Name: a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
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この作品はLeverhulmeトラスト、工学物理科学研究会議からの助成金によってサポートされていました[EP / H018301 / 1、EP / G037221 / 1];アルツハイマー病研究UK [ARUK-EG2012A-1];ウェルカム・トラスト[089703 / Z / 09 / Z]および医学研究審議会[MR / K015850 / 1、MR / K02292X / 1]。我々は、HEK293培養物の調製のために、それぞれLifeAct-GFPのトランスフェクションおよび細胞質-GFP細胞のためのE. AvezovとM.呂に感謝し、そしてW.陳。また、有益な議論や提案のための顕微鏡の設計の支援のためのK. O&#39;Holleranに感謝し、そしてL.シャオとR. Heintzmann。

<ol>
	<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement.">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li><li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation.">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy.">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li><li>Esbj&#246;rner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observations+of+amyloid+&#946;+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A&#946;(1-40)+and+A&#946;(1-42)+aggregation.">Direct observations of amyloid &#946; Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of A&#946;(1-40) and A&#946;(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li><li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology.">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li><li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Super-Resolution+Imaging+of+&#946;-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo:+Method+and+Techniques.">Optical Super-Resolution Imaging of &#946;-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li><li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves.">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li><li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+resolution+wide-field+optical+imaging:+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li><li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination.">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li><li>Brunstein, M., Wicker, K., H&#233;rault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks.">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li><li>F&#246;rster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator.">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).</li><li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fastSIM:+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy.">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).</li><li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples.">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li><li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).</li><li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy.">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).</li><li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space.">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).</li><li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy.">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li><li>Str&#246;hl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data.">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).</li><li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns.">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li><li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm.">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915 (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html>例えば、このプロトコルで詳述設定として特注TIRF-SIMシステムは、市販の顕微鏡に比べて高速で多色超解像度イメージングが可能です。超解像技術としてSIMの固有の利点は、単一分子局在顕微鏡（SMLM）、または誘導放出の枯渇顕微鏡（ある点走査法などの他の方法に比べて、時間分解能は、フルオロフォアの光物理によって限定されるものではないということですSTED）。多色イメージングが簡単であるように、これらの他の技術とは異なり、SIMはphotoswitchableまたは枯渇蛍光団を必要としません。ここで報告された2倍の改善とは対照的に、SIMおよび多焦点SIMを区画などの光などの非TIRF-SIMシステムは、通常、実際には1.7倍以下の解像度の向上を達成することができ、および商用システムは、システムよりも頻繁に遅く、あまり柔軟性がありますこのプロトコルで提示。 &quot;&gt;この技術を実装する2つの主要な困難は、まずSIMが高いパターンのコントラストを生成するために、第二光学アライメント手順を消費労力と時間を必要とする目的の背面開口部のTIRゾーン内梁6の正確な位置決めのために必要ですサンプルにおいて、偏光回転は、低NA 2D-SIMシステムでは、偏光回転を直線偏光の向きを注意深く選択することによって回避することができる。必須であるが、これはTIRF-SIM 25は不可能になる。高速多色画像化のために、電気光の偏光制御が必要であり、これは、システムの複雑さおよび費用を増加させます。 技術の制限事項 TIRF-SIMは、従来のTIRFように、自然に生物学的構造とエバネッセント場の150-200 nmの侵入深さによって照明することができる基底細胞膜に位置するプロセスの観察に制限されています。同時にSIMは、多くの場合、STEDまたはSMLMのいずれかよりも細胞に対してよりphotodamagingものとして引用され、横方向の解像度の倍増は、依然として従来のTIRF顕微鏡と比較して少なくとも4倍5により光子の必要数を増やすん。短い露光時間で高フレームレートで撮影するために、この光子の増加は、増加した照明強度の使用を必要とします。任意のフルオロフォアが固定または低速で移動サンプルのSIMイメージングのために使用することができるが、強化された光安定性と高輝度蛍光タンパク質または次世代合成染料は、生細胞イメージングのために推奨されています。 この実装では、20ヘルツを超えるSIMフレームレートで、単一の色を撮像することができるが、提示システムにおける多色画像は電動発光フィルタホイールのスイッチング時間により制限されます。 sCMOSカメラチップのサイズが大きいため、多帯域発光フィルターと画像分割光学系の使用が可能であると同時に私を可能にしますなしスピードペナルティで複数の波長でmaging。別の可能性は、異なる励起レーザを交互に励起光を拒絶するためにマルチバンドノッチフィルタを使用することです。この実装ではバイナリ強誘電体SLMの使用も最適ではありません。そのようなSLMの回折効率は非常に低いので、入射光の大部分は、空間マスクによってフィルタリングされたゼロ次反射です。非常に高いフレームレートを必要とするアプリケーションの場合、イメージング速度は、従って、レーザダイオードの出力パワーによって制限されます。 SLMはまた、離れた画素はとして理想的な半波長板を動作させてください550 nmの設計波長からの波長に対する偏光のいくつかの楕円率を導入しています。この追加のLCVRを使用することによって補償することができるが、理想的な解決策は、パターン発生器などのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）を使用することができます。 可能な修飾セットアップpresaの複数形ここnted柔軟性があり、より簡単に修正された市販の装置よりも、このような3D-SIM、高速2D-SIMように、他の画像診断法、多焦点SIM（MSIM）および非線形SIM（NL-SIM）は21,34,35を実装することができます。 2D-SIMは、末梢小胞体などの比較的平坦な、動きの速い構造を画像化するのに適しすることができます。周辺ERは、TIRFエバネッセント場を使用して照明することができるが、原因で、そのフラットな構造に無視できるピンボケ背景に、標準的な2D-SIMを使用して画像化することができるよりも細胞内の深くにあります。さらに、改良された光学セクショニング再構成アルゴリズムの使用は、光が光学的に厚いサンプルは、いえ軸方向分解能倍増が21必要とされないため、2D-SIMの使用を拡張するピンボケ抑制することができます。 MSIMでは、サンプルは、励起焦点36の疎な格子によって照明されます。この様式は、SM（単に空間マスクを除去することによって実現することができます）と偏光子によってそれを置き換えます。 SLMは現在、振幅変調器として動作します。 SLM上に表示されたバイナリSIM格子像面における回折限界の焦点の大きさに等しくなるように選択されたスポットのサイズが、スポットの2次元格子で置き換えることができます。 図7Aでは、4×4ピクセルの正方形の格子は13.62ミクロンの物理的なSLMのピクセルサイズを考えると、試料上に縮小時150×150nmの回折限界の焦点を生成するSLM（挿入図）に表示されます。励起の焦点は、次に、SLM上の格子パターンをシフトすることによって変換することができ、これは、視野全体を照明するために複数回繰り返されます。画像は各翻訳パターン位置とスタックのために取得されている倍までの解像度向上と再構成画像を得るために、ポスト処理され、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" />そして、同等の広視野画像と比較して、アウト・オブ・フォーカス光減少30。取得時間を伴う生フレームの数が多いに増加させるが、この様式は、例えば、染色された赤血球（ 図7C）のような低コントラスト構造を標準SIMは不向きであるため厚く、高密度のサンプルを撮像するために有用であり得ます（この場合はN = 168）の視野ごとに必要。 Li らによって最近提示最後に、セットアップは、高NAリニアTIRF-SIMまたはパターン化された活性化非線形SIM（PA NL-SIM）のいずれかを有効にするように変更することができる。、超高1.7 NAの客観的または付加を使用することによって405 nmの光活性化レーザとSLM格子パターン35の慎重な最適化。 将来の応用 SIMはまだ急速に進化技術であり、生命科学の多くのアプリケーションは、将来的に有効になります。技術のスピード、解像度、コントラストの強化と標準フルオロフォアメートルを使用する能力バイオイメージングのために、SIMは、例えば、共焦点及び広視野プラットフォームのような従来の多くの顕微鏡システムを置き換えるために設定されているEAN。商業用SIMシステムが決定的に、彼らは分野の最新の研究開発を実施するように変更し、開発される柔軟性がない、しかし、彼らは多くの研究機関の財務範囲を超えている、優れた技術仕様で、すでに今日利用可能である、と。彼らはまた、「手元の実験のために適合させる」ために必須の能力、エッジ生命科学研究を切削しばしば重大なボトルネックを欠いています。ここで説明するシステムは、再構成された二層系のインビトロ研究、材料、物理科学、表面の化学的性質を研究するために、 例えば 、細胞表面の近くに動的プロセスを研究するために特によく適しているであろう。 2Dの材料、および他の多くのアプリケーション。

最後の5年にわたり、超解像顕微鏡は成熟しており、生物学者の手に専門光学研究室から移動しました。商業用顕微鏡ソリューションは、光超解像を実現するための3つの主要なバリアントのために存在する：単一分子の局在顕微鏡（SMLM）、排出量の枯渇顕微鏡（STED）を刺激し、構造化照明顕微鏡（SIM）1,2。 SMLMは、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と確率的光学再構成顕微鏡（STORM）のような容易にダウンして20 nmまで、主として光学セットアップの簡単さと高空間分解能の約束に、最も人気のある技術となっています。しかし、単一分子の局在化を介した超解像顕微鏡は、本質的なトレードオフが付属しています：空間分解能の達成可能では時間分解能を制限するため、個々のフルオロフォアローカライズの十分な数を蓄積に依存しています。イメージング動的プロセス1が適切にも画像を再構成するためにその時間内に十分なローカライズイベントを取得しながらモーションアーチファクトをpreventする関心のある構造の動きをサンプリングしなければならないため、生細胞におけるESは、したがって、問題となります。これらの要件を満たすために、生細胞SMLMデモが大きく励起パワーを増加させることによって、フルオロフォアphotoswitching率の必要な増加が得られており、これにより、サンプルの生存時間および生物学的関連性3制限毒性および酸化ストレスに順番につながります。 SIMとSMLM両方を超えるSTEDの明確な利点は、それは厚い試料中の超解像度の画像は、例えば60nm程度の横方向の解像度は、最大120ミクロン〜4の深さで器官脳スライスで達成されたことができますされていること。 SMLMまたはSIMの単一目的の実装と、そのような深さでのイメージングが実現不可能であるが、単一分子光シートまたは格子光シートマイクのどちらかで可能になりますroscopy 5。これまでのところ、これは図6の小さなフィールドを撮像するために制限されているが、ビデオレートSTEDはまた、実証及びシナプス小胞の移動をマッピングするために使用されてきました。 細胞生物学および分子の自己集合反応7における用途のために-それは特定の蛍光の光物理的特性に依存しないように、多くの時間点にわたって高時間分解能でイメージングを必要とする12、構造化照明顕微鏡（SIM）よく適合することができますプローブ。 SIMのこの固有の利点にもかかわらず、今までその使用は、主に固定された細胞または動きの遅いプロセスを画像化するために限定されています。これは、市販されているSIMシステムの限界によるものである。これらの商品の獲得フレームレートが必要と正弦波照明パターン並びに光学偏光維持を生成するために使用される回折格子の回転速度によって制限されました。商業SIMの最新世代機器は、高速撮像が可能であるが、彼らは中央イメージング施設が、すべてに非常に高価です。 このプロトコルは、薄い試料中の生細胞の基底面付近で高速処理を撮像するための柔軟なSIMシステムの構築へのガイドを提示します。それは非常にフォーカス背景信号のうちを減少させ、サンプル13にノー深く約150 nm未満を貫通照明パターンを生成するために、全反射蛍光（TIRF）を採用しています。 TIRFでSIMを組み合わせるという発想は、SIM自体14とほぼ同じくらい古いですが、2006年15前に実験的に実現しなかった。TIRF-SIMで得られた第一のin vivo画像がチューブリンとキネシンを視覚化するために11ヘルツのフレームレートを達成2009年16で報告されましたダイナミクス、2色TIRF-SIMシステムは17,18を提示されました。最近では、単一色2ビームSIM秒の構築および使用のためのガイドystemは最大18 Hzの19,20のフレームレートをフィーチャー発表されました。 ここに提示され、セットアップは、TIRF-SIMで動作することができる2つのうちの3色で20HzでSIM超解像度イメージングが可能です。システム全体は、倒立顕微鏡のフレームの周りに構築され、ピエゾ作動Zステージと電動式のXY移動ステージを使用しています。 TIRF-SIMに必要な正弦波励磁パターンを生成するために、提示システムは、強誘電体空間光変調器（SLM）を使用します。バイナリ格子パターンがSLM上に表示され、結果の±1回折次数は、フィルタリング中継され、対物レンズのTIRリングに重点を置いています。必要な位相シフト及び格子の回転は、表​​示されたSLMの画像を変更することによって適用されます。このプロトコルは、このような励起パスを構築し、位置合わせする方法について説明し、排出路の位置合わせを詳述し、最適なアラインメントを確保するための試験サンプルを提示します。また、デ<html>スクライブ偏光制御とコンポーネントの同期に関する高速TIRF-SIMに特定の問題や課題を。 設計上の考慮事項と制約このプロトコルで提示TIRF-SIMシステムを組み立てる前に、光学部品の選択を決定考慮すべきいくつかの設計上の制約があります。光学部品の全ての略号は図1を参照してください。 空間光変調器（SLM） それは、サブミリ秒パターン切替が可能であるようにバイナリ強SLMは、この設定で使用されています。階調ネマチックのSLMを使用することができるが、これらはスイッチング時間を大幅に提供減少しました。二位相のピクセルをオンまたはオフに各SLMは、入射面波面にオフセットπまたは0相のいずれかを付与する周期的な格子パターンがSLM上に表示されている場合はそのためには、位相回折格子として動作します。 ENT &quot;&gt;全反射（TIR） TIRを達成し、エバネッセント場を生成するために、ガラスサンプル界面における励起ビームの入射角が臨界角よりも大きくなければなりません<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> 。また、これは、したがって、エバネッセント照明パターンの最大間隔または期間を、必要とされる最小の入射角を設定し、。最大入射角<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> （受光角）を定義から計算することができ、対物レンズの開口数（NA）によって制限されます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> 。これは、アッベ式に従って達成間隔の最小パターンを決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> NAと波長をリンクします<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" />最小パターン間隔に<imgALT = &quot;式&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;。実際には、1.49のNA油浸TIRF対物レンズは、約79°の最大入射角と488nmでの励起波長を用いて164 nmでのサンプルの最小限のパターン周期をもたらします。これら二つの角度は、（TIRリング。 すなわち ）機器がTIR照明を実現する上で、対物レンズの後部開口部のリングを定義し、2つの励起焦点を正確に位置決めして正確に各照明パターンを生成するために回転する必要があります。 TIRF-SIMの画像の再構成は、パターン回転あたり3位相シフトの最小の買収は、したがって、SLMパターン期間は3で割り切れる必要があります必要があります（ 図1を参照）。例えば、488nmの照明用の9画素と640 nmの照明のための12ピクセルの期間。剪断された格子を用いたパターン間隔のサブピクセル最適化などのSLMパターン設計の包括的な議論については、、16及びLu-ヴァルターら ら Knerの前の仕事を参照してください。2つの励起焦点の20位置は全ての波長のためのTIRリングの内側にある必要があります、しかし、SLMからの±1次数の回折角は波長であります依存。標準SIMため、多色画像は、最長波長に対する格子周期を最適化し、より短いチャンネルに対する性能の損失を許容することによって達成することができます。 TIRF-SIMの場合はしかし、一つの波長を最適化すると、他の波長の焦点は、もはやTIRリング内であることを意味しません。病巣バック開口部の直径の95％で、およびTIRリング内にあるが、640nmのため、この期間外焦点を配置と同じように、例えば、9画素の格子周期を使用して、488 nmのためのTIRFを提供するのに十分ですアパーチャ。この理由のために、異なるピクセルパターンの間隔は、各励起波長のために使用されなければなりません。 TIRF-SIM励起経路のアラインメントはるかので、従来のSIMよりも、顕微鏡本体内のダイクロイックミラーの位置における小さな変化（ 図1中のDM4）に非常に敏感です。回転フィルタキューブターレットの使用は、固定位置に保持され、使用される励起波長のために特別に設計されたシングル、マルチバンドダイクロイックミラーを使用する代わりに、推奨されません。最高品質のダイクロイックミラーを使用することが必須です。これらは、少なくとも3mmの厚さの基板を必要とし、多くの場合、製造業者によって「撮影フラット」として指定されます。他のすべての基板は、TIRF-SIMに耐え難い収差や画像劣化につながります。 偏光制御 TIRF-SIMを達成するために、それが光軸に対して対物レンズの瞳面内の方位角方向に偏光ままであるように照明パターンと同期して励起光の偏光状態を回転させることが不可欠である（ すなわち。 s偏光）。偏光制御光学系の位置合わせは、電動式回転ステージ22、例えば、使用される特定の光学素子のポッケルスセル21、または半波長板を左右される。このプロトコルでは、カスタム液晶可変リターダ（LCVR）は、それが高速（〜ミリ秒）のスイッチングを可能にするように640 nmの波長範囲488を完全に波（2π）リターダンスを提供するように設計、使用されています。液晶リターダを使用する場合には、高品質のコンポーネントを使用することが必須である：標準部品は、典型的には、照明パターンと低い変調コントラストのうち、ぼけにつながるカメラの露光時間の長さにわたって一定のリターダンスを与えるのに十分安定ではありません。液晶リターダは、また、温度に強く依存し、温度制御に内蔵必要。 同期レーザーは、SLMと同期する必要があります。バイナリ強誘電体のSLMは、内部のでバランスされていますオン状態とオフ状態の間魔術。ピクセルは、いずれか一方のみでそれらの状態をオンまたはオフではなく、時間を切り替えインターの間に半波長板として作用します。したがって、レーザーはのみによるピクセルの中間状態にパターンコントラストの低下を防止するために、SLMからの信号を有効にLEDを介してオン/オフ状態の間にオンにする必要があります。レーザをデジタル変調することができない場合、音響光学変調器（AOM）を交互に高速シャッターとして使用することができます。 レンズの選択これらの制約に基づいて、所望の照明パターンを生成するために試料面上にSLM面の必要な縮小を決定することができます。これは、画像中継望遠鏡励起集光レンズL5に2つのレンズL3とL4の焦点距離を計算することができます。このシステムでは100X / 1.49NAの油浸対物レンズ488 nmおよび640 nmの励起で使用され、従って300および140ミリメートルの焦点距離を使用してL4およびL3のための、およびL5のための300ミリメートル、試料面での38ナノメートルのSLMの画素サイズに相当357Xの合計縮小を与えます。レンズの組み合わせを使用して、SLMは、それぞれ70°と67°の入射角に対応し、488 nmの照明とサンプルで172および229 nmでのパターン間隔を与えるnmの640のための12画素について9の期間を格子。ガラス - 水界面の場合、臨界角は、したがって、これらの2つのパターンの間隔は、両方の波長のためのTIRF励起を可能にする、61°であり、かつ波長とは無関係です。 37℃で動作する場合、または補正環を備えた対物レンズは、カバーガラスの厚さの変動によって導入される球面収差の補正のために有用です。 画像再構成生SIMデータが取得されると、それは、2段階のプロセスで超解像を生成するための計算量の問題です。まず、照明パターンのために決定されなければなりませんすべての画像および第二に、SIMスペクトルの構成要素は、（ 図6、インセットを参照してください）効果的なOTF支援を倍増するように適切に分離して再結合する必要があります。 超解周波数成分が重複する成分の残留部分によって引き起こされるアーティファクトを防止するためにできるだけ正確に純粋でなければならないように投影された照明パターンの正確な知識は、最も重要です。我々は、照明パターンのそれぞれについて発見されたグスタフソンら要するに23、正規化された二次元の正弦波を記述する照明パラメータのセットによって導入された手順に従って、生の画像データから事後パラメータ決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" />励起パターン<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> ： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" />これによって<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" />縞コントラストとそれぞれ個別の画像メートルのフェーズを開始するパターンを記述しています。波数ベクトルの成分<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> 、唯一の異なる向きに変更<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" />パターンと缶のそれ以外の場合は一定であると仮定。粗重なりを最適化するように相互相関のイメージのいずれかにサブピクセルシフトを適用することによって、精製された原画像のスペクトルの相互相関が実行される波数ベクトルの成分を決定します。これは、実空間位相勾配の乗算を介して行われます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" />それがfreにおけるサブピクセルシフトを誘発します波数空間。前に実際のパターン推定に波ベクトルの良好な推定値を有することが有用であり、これは蛍光ビーズ層を画像化することにより求めることができることに注意してください。 シフトパターンとの間の位相ステップがあるように<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> 、 すなわち 。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> 、周波数成分の分離は、「相軸」に沿ってフーリエ変換することにより行うことができます。大域的位相<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" />フリンジのコントラスト<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />次いで、異なる成分の複雑な線形回帰を用いて決定することができます。個々の分離された成分は、その後、一般的なウィーナーフィルタを使用して合成されます。一般化ウィナーフィルタの両方のパラメータ抽出と実装の詳細については、我々はグスタフソンに読者を参照してください。ら 23と同じアルゴリズムが使用されています。

<table><tbody><tr><td>488 nm laser</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>with digital modulation</td></tr><tr><td>Long-pass dichroic mirrors&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>for combining excitation beams</td></tr><tr><td>Quad band dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td></tr><tr><td>Quad band dichroic mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1&quot; square kinematic mount</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Glan-Taylor calcite polarizers</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>For alignment of LCVR</td></tr><tr><td>Glan-Taylor mount</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Achromatic half wave plate</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>For HWP</td></tr><tr><td>Liquid Crystal Variable Retarder</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td></tr><tr><td>LCVR controller</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td></tr><tr><td>Achromatic quarter wave plate</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>For QWP</td></tr><tr><td>10 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>For beam expander</td></tr><tr><td>200 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>For beam expander</td></tr><tr><td>Cage XY Translators</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Ferroelectric spatial light modulator</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board</td></tr><tr><td>SLM mounting frame</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Fixed to custom built aluminium mount</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Rail carrier</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>Precision Optical Rail</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>For SLM mounting</td></tr><tr><td>300 mm achromatic doublet lens</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&amp;nbsp;</td><td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td></tr><tr><td>140 mm achromatic doublet lens</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Precision XY Translation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>Lens Mounting Adapters</td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&quot; mounts</td></tr><tr><td>Translation stages</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Dovetail, side drive</td></tr><tr><td>XY Translator with Differential Drives</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>for spatial filter</td></tr><tr><td>Rotation cage mount</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>for spatial filter</td></tr><tr><td>300 mm achromatic doublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Excitation tube lens</td></tr><tr><td>Automated XY stage with Z-piezo top plate</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&amp;nbsp;</td><td>with MS-2000 controller</td></tr><tr><td>Inverted microscope frame</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>High speed filter wheel</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>with Prior ProScan III controller</td></tr><tr><td>Bandpass emission filters</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Stage top incubator</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controllers</td></tr><tr><td>Stainless steel optical posts</td><td>Thorlabs</td><td>TR series</td><td>for mounting optical components</td></tr><tr><td>Post holders</td><td>Thorlabs</td><td>PH series</td><td>for mounting optical components</td></tr><tr><td>Kinematic mirror mounts</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>for mounting 1&quot; mirrors</td></tr><tr><td>Shearing interferometer</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>100 nm fluorescent microspheres</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 well glass bottom dishes</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>with #1.5 coverglass</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>with #1.5 coverglass</td></tr><tr><td>0.01 mm microscope reticle slide</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

構造化照明顕微鏡（SIM）と光学的に超解像イメージングは​​、化学および生物医学科学の分子レベルでのプロセスの可視化のためのキーテクノロジーです。商用SIMシステムが利用可能であるが、カスタム商用システムを上回ることができ、実験室で設計されているシステムでは、後者は、典型的には、イメージングの忠実度と速度の点で両方、使用および汎用アプリケーションを容易にするために設計されました。この記事では、全反射（TIR）照明を使用し、100nmでの到達分解能で3色で最大10 Hzで撮像が可能であるSIMシステムを構築するための綿密なガイドを提示します。 SIMとTIRFの組み合わせに、システムは、ライバルの技術よりも優れた画像コントラストを提供します。これらの仕様を達成するために、いくつかの光学要素は、すべての利用可能な励起WAVする照明光の偏光状態と空間構造上の自動制御を可能にするために使用されていますelengths。ハードウェア実装および制御の詳細は、励起光パターン生成、波長、偏光状態、および最大の取得フレームレートを達成することに重点を置いてカメラ制御との間の同期を達成するために与えられています。システムのアライメントおよびキャリブレーションのためのステップバイステップのプロトコルが提示され、達成可能な解像度の向上は、理想的な試験サンプルで検証されています。ビデオレートの超解像画像化する能力は、生きた細胞を用いて実証されています。

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A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K ビュー.  University of Cambridge. This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

生物工学

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

免疫・感染学

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

生化学

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

生物学

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a super-resolution technique that allows for the determination of the microcompartments that are accessible for proteins by generating localization and tracking maps of these proteins. Moreover, by multi-color localization microscopy, the localization and tracking profiles of proteins in different subcompartments are obtained simultaneously. The technique is specific for live cells and is based on the repetitive imaging of single mobile membrane proteins. Proteins of interest are genetically fused with specific, so-called self-labeling tags. These tags are enzymes that react with a substrate in a covalent manner. Conjugated to these substrates are fluorescent dyes. Reaction of the enzyme-tagged proteins with the fluorescence labeled substrates results in labeled proteins. Here, Tetramethylrhodamine (TMR) and Silicon Rhodamine (SiR) are used as fluorescent dyes attached to the substrates of the enzymes. By using substrate concentrations in the pM to nM range, sub-stoichiometric labeling is achieved that results in distinct signals. These signals are localized with ~15&#8211;27 nm precision. The technique allows for multi-color imaging of single molecules, whereby the number of colors is limited by the available membrane-permeable dyes and the repertoire of self-labeling enzymes. We show the feasibility of the technique by determining the localization of the quality control enzyme (Pten)-induced kinase 1 (PINK1) in different mitochondrial compartments during its processing in relation to other membrane proteins. The test for true physical interactions between differently labeled single proteins by single molecule FRET or co-tracking is restricted, though, because the low labeling degrees decrease the probability for having two adjacent proteins labeled at the same time. While the technique is strong for imaging proteins in membrane compartments, in most cases it is not appropriate to determine the localization of highly mobile soluble proteins.

Here, we present a protocol for multi-color localization of single membrane proteins in organelles of live cells. To attach fluorophores, self-labeling proteins are used. Proteins, located in different membranes compartments of the same organelle, can be localized with a precision of ~18 nm.

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

要約

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全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラーローカリゼーション顕微鏡

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

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全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラーローカリゼーション顕微鏡