この作品は、[CVB＆MEにMOP-1112666]カナダ衛生研究所からの資金によってサポートされていました。

倫理の声明：全ての実験および手順はブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー、カナダの大学の研究室バイオセーフティ指針と一致して行われました。 FRETベースの共焦点顕微鏡のための35ミリメートルのガラス底の培養皿の調製<ol><li>次の手順で36〜48時間前の実験とを使用してプレートを準備します。 </li><li> Cストレージ-20℃から選択されたゲル状のタンパク質混合物と0.25％トリプシン-EDTAを取得し、使用するまでモバイル氷浴に保管してください。 注：コーティングタンパク質混合物は、使用前に固化から混合物を防止するために、短時間室温にさらされるべきです。必要になるまでトリプシン溶液も冷やしておくべきです。代わりに、トリプシンは、ステップ1.5が完了した後、-20℃の貯蔵から取り出すことができます。 </li><li> DMEM（無血清添加、チルド）：タンパク質混合物の1時25希釈を準備します。各プレートが用意されているにタンパク質混合物/ DMEMの適切な量を転送。 35ミリメートルのガラス底板については、完全にプレートの底面に内側のガラスの円をカバーするために約200μlを添加します。 </li><li>安全キャビネット内、室温で少なくとも30分間座ってプレートを残します。この期間中の水浴中で37℃、10％NCSで暖かいDMEM。 </li><li>直前に次のステップに37℃に水浴中で暖かいトリプシン。 </li><li>ガラスピペットと吸引を用いて培養フラスコに現在あるDMEMを削除します。残りのDMEM残留物を除去するために暖かい滅菌PBSでフラスコの床を洗います。 </li><li>フラスコ底部から前培養平滑筋細胞を取り除きます。 注：フラスコは、細胞がプレートの準備の前に、所望の密集度（約80％）に達するようにするには、このステップに日に設立されました。細胞が元々 DMEM供給をリフレッシュし、細胞をインキュベーターに戻しした後、10％NCSを含むDMEM 20mlのフラスコ中に懸濁させ、24時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートしました。 DMEMは前夜に更新されました細胞がコンフルエントに達するまで、これらの初期の手順以下のRY 48時間。 <ol><li>ウォッシュは、トリプシンの1ミリリットルで素早くフラスコ、その後、吸引を用いて、1 mlのトリプシンを削除します。 </li><li>トリプシンの別の1ミリリットルに加え、酵素は、フラスコの底面全体に接触して確保するために、フラスコをswishing、より長い期間（約30-60秒）に向けて出発。 </li><li>フラスコからの分離に満足するまで、顕微鏡下で剥離しているどのくらいの細胞を観察します。代替は、トリプシン溶液をswishing、フラスコから分離された細胞の割合に満足するまで、細胞の剥離をチェックします。 注：フラスコを、37℃で、このプロセスをスピードアップするために約30〜60秒間インキュベーターに戻すことができます。 </li><li>細胞は、トリプシンを使用して取り除かれた後、（トリプシンをフラスコに総容量の1/8を形成するように十分な体積）トリプシン反応を停止し、フラスコに10％NCSを用いて新鮮なDMEMを加えます。 注：250mlの培養フラスコを使用した場合、例えば、これは、希望7 mlのDMEMを細胞溶液8mlにもたらすために、トリプシンの1mlに添加してもよいです。 </li></ol></li><li> （ラベル）クリーン50mlコニカルチューブにフラスコから細胞溶液を生じた譲渡。 </li><li>各プレートに1ミリリットルの新鮮なDMEM + 10％NCSを追加しますが（十分な媒体が24時間持続するために）準備されています。 </li><li>静かに形成された可能性のあるペレットを破壊するために細胞溶液を複数回含むチューブを反転。 </li><li>ピペットを各プレートに穏やかに混合した細胞溶液の体積を所望します。 注：このプロトコルのためにメッキ推奨SMCの数が35ミリメートル培養皿あたり0.5〜0.8×10 6です。これらの数は、細胞型に依存して変化してもよく、各研究所で試験され、修飾されるべきです。 </li><li>ガラス下部に細胞の平等な分配を確保するために、各プレート徹底的に時計回り/反時計回りの渦巻。 </li></ol> D1SRのCa 2+インジケーターを運ぶアデノウイルスベクター2.一過性トランスフェクション<ol><li>私の添加後各プレートにdiumとセルソリューション、細胞は皿の底にガラスに正しく取り付けることができるように、少なくとも1時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートし、プレートを残します。細胞が明確に添付されるまで、15分間隔で顕微鏡下でプレートを確認してください。 </li><li> -80℃ストレージからのアデノウイルスD1SRアリコートを取り出し、生物学的安全キャビネットに輸送するために、モバイル氷浴中に保ちます。 </li><li>ピペット所望の投与量を各プレートに冷却D1SRの（100の感染多重度）。 注：プレートごとに必要なアデノウイルス溶液の体積の計算は、プラーク形成単位（P​​FU）として提示され、元の原液、中のウイルス力価に依存します。我々の経験に基づいて、我々は培養プレートに1平滑筋細胞（SMC）を感染させるために必要な番号やウイルス粒子として解釈される100の（MOI）を、感染の多重度をお勧めします。 </li><li> 5％CO 2供給O / Nで37℃で感染させた細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、新鮮なDMEM + 10％NCSの1ミリリットルで細胞を補充します。 </li><li> 5％CO 2、O ​​/ Nで37℃の加湿インキュベーター中で培養します。 </li></ol> FRETベースの共焦点イメージングを使用して3.測定SR腔のCa 2+ <ol><li> O / Nインキュベーション後、プレートから培地を除去します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li>共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアにFRET SE（増感エミッション）アプリケーション（または同様の機能）を使用して初期撮影を行います。 <ol><li>アプリケーションが開いたら、目的の実験条件を達成するために、設定を調整する「設定」タブにクリックします。 </li> &lt;李&gt;は手動（アクセプターチャネルのために）細胞は（ドナーのためにとチャンネルをFRET）440 nmで順番に興奮しているように、チャネルの設定を変更し、513 nmの。 （ドナー用）488 nmおよび535 nmの（FRETとアクセプターのため）で発光波長を収集します。 </li><li>露光の間で10秒間隔（3つの連続CFPドナー、FRET、およびYFPアクセプターチャネルのための時間を記録する）、細胞の150ミリ秒の励起の露光時間で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させます。 </li><li>画像の解像度を確認するには、「ライブ」ボタンを使用します。所望の解像度に達するまで、さらに設定を微調整します。 </li><li>それでも「設定」タブの下に、「キャプチャ画像」ボタンを使用してサンプルの画像を取ります。 </li><li> 「評価」タブに移動する、行われている実験のためのFRET効率を計算するために適切な方法を選択します。レシオメトリック計算[E A（I）= B / Aを使用して方法3、]、このようなD1SR指標としてカメレオンを含む実験のために推奨されます。 </li><li>実験中にグラフ形式で記録された強度値を観察することができるように、「グラフ」タブに切り替え。 </li><li>実験が進むにつれて、グラフ上の関心のこの領域の対応する平均強度を観察するために、画像ビューアでROIを描きます。 注：研究者はまた、複数のROIを描き、対応する強度を記録し、グラフ上に同時に表示するように選択することがあります。また、研究者らは、最初の記録のための単一のROIを概説し、ソフトウェアのデータ分析指向のバージョンに実験ファイルを開くことによって、後で複数のROIの輪郭を描くに進むことができます。 注：FRETベースの実験をセットアップするために必要な手順に関するさらなる詳細は、FRETアプリケーションウィザードのマニュアルに記載されています。顕微鏡はFRETウィザードが装備されていない場合は、以下のプロトコルは、のパラメータを設定するために使用することができます手動で記録。 </li><li>記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に、信号の安定した基礎記録を確実にするために、少なくとも3分のデータ収集を可能にします。 </li><li>手動で関心ビーイングの領域と近くにスポットでプレートに直接所定の線量をピペッティングすることにより、SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとして、（100 nmのエンドセリン-1 例えば、2μMタプシガルギン）のCa 2+ -movingエージェントを導入可能性として記録。所望の時間の後処理のために記録を続けます。 </li><li>レシオメトリックをキャプチャFRET SEアプリケーションを用いた共焦点倒立顕微鏡の63X油浸対物レンズとのシリアル画像（512×512ピクセル）をFRET。 </li><li>関心の各領域における5-10のSMC（ROI）のクラスタからの撮像結果のデータを収集し、その後にフォーマットし、統計ベースのソフトウェアを使用して分析します。 <ol><li>後で使用するためにデータを保存するには、記録されたトレース上で右クリックして、SAVする「エクスポート」オプションを選択します電子記録とのスプレッドシートは、研究者の選択したドライブ上の信号強度を意味します。 </li><li>時点0秒​​で観察された開始強度値によって各データポイントを分割して、各個々の実験からのデータを正規化します。 </li><li>手動で元のスプレッドシート/秒から関連するデータ行をコピーして貼り付けることにより、統計プログラムのプロジェクトファイルへのスプレッドシートからのインポート正規化されたデータ。 </li><li>自動的にプログラムに貼り付けられたデータセットに対応するグラフを生成。 注：プログラムのデフォルト設定は、インポートしたデータから線グラフを生成します。表示されるグラフの種類は、メインツールバー内で見つかった見出し「変更」の「グラフの異なる種類を選択」ボタンをクリックして変更することができます。 </li><li>単一のデータ・シートに同一の実験の大きなグループ内の複数の独立した試験を表すプールのデータは、実行される特定のテストの平均トレースを生成します。 </li></ol></li></oL&gt; 細胞質のCa 2+インジケーターの4準備<ol><li>黒のマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中0.0125 gでプルロニック酸（PA）を溶解（PAの溶解を助けるために、モバイル水浴中でチューブを暖めるために有していてもよいです）。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+指示薬色素（あるFluo-4 AM）のチューブ（50μgの）を取得します。 </li><li>光との接触からできるだけそれを保護するために、箔中の染料のチューブを包みます。 </li><li>色素を含有するチューブにDMSO + PAソリューションのピペット45μlの。 RTで箔とストア内のDMSO + PAソリューションを包みます。 </li><li>徹底的に解決策の上下に複数回ピペッティングすることにより、チューブの内容物を混合。あるいは、10分間染料管超音波処理。 注：完全にDMSO + PAソリューション全体に染料を分配する方法のいずれかが十分であろう。単に研究者の好みの問題です。治験責任医師は、溶液を超音波処理することを選択した場合、それ他はノイズによって影響されない孤立した地域/部屋で行う必要があります。研究者はまた、耳を保護するために重いマフラーを使用する必要があります。 <ol><li>ソリューションを超音波処理した場合、超音波洗浄器（ の dH 2 Oで）フル2/3の内側に発泡チューブホルダーと場所の内部に染料を含有するアルミホイルにくるまれたチューブを挿入します。 </li><li>上の孤立した地域/部屋とパワー機に入れ超音波処理浴が（保護帽子を確保する前に、超音波処理プロセスを開始する場所にあります）。 （できるだけ長く光から保護するためにホイルで包んでおく）部屋を出ると、それを遮断し、チューブを取得する前に10分間実行しているマシンのままにしておきます。 </li></ol></li><li>暗いマイクロ遠心チューブに今完全に混合した溶液アリコート（チューブあたり5μLを、10チューブ総作ることができるはずです）。 </li><li>ホイルで各アリコートチューブを包みます。使用するまで-20℃の条件で乾燥剤でラベルのチューブとストア。 </li></ol> 5.細胞質のCa 2+測定<ol><li>ラット大動脈のSMCの培養プレートを準備するために1.1から1.12の手順に従ってください。 </li><li> 48時間後の培養液でプレートから培地を除去します。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+インジケーター（5マイクロリットル）の先に調製したアリコートを削除し、使用するまでモバイル氷浴中で維持します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>暖かいHEPES-PSSの1ミリリットルでインジケータを混合し、培養プレート上にロードします。 </li><li> RT（24℃）で1時間の指標でのSMCをインキュベートします。 </li><li>培養プレートからインジケータを削除し、1ミリリットル温かい生理HEPES-PSSバッファ3回洗​​浄します。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li> 63X Oとシリアルの画像（512×512ピクセル）を取得共焦点倒立顕微鏡のIL-浸対物レンズ。 <ol><li>手動で細胞が488nmで励起されるように設定を変更し、発光波長は700ヘルツの走査速度で555 nmで収集されます。 </li><li>細胞の150ミリ秒の励起露光時間（細胞を記録中、指定された時間間隔で光に暴露される時間量）と露光の間に5秒間隔で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させ、記録を開始します。 </li><li>前関心の薬剤を導入する信号の安定した基礎記録を確保するために、少なくとも3分間録音。 </li><li> SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとしてのCa 2+ -moving剤（ 例えば 、2μMタプシガルジン）を導入する（ステップ3.16で説明したように）と時間後処理所望の量の記録を継続します。 </li><li>蛍光SIを平均化することにより、顕微鏡固有のソフトウェアを使用して記録信号強度興味（ROI）の各領域における5-10のSMCのクラスタからgnals（F / F 0）。収集フォーマット、およびデータ分析ソフトウェアを用いて画像化から生じるデータを分析します。このソフトウェアを使用して、データ収集の説明と分析のための手順を3.18.1-3.18.5参照してください。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

このプロトコルは、SRのルーメン内のCa 2+濃度を研究するためにD1SRアデノウイルスとのVSMCのトランスフェクションを説明します。この方法は、異なるカルシウム移動剤を適用した結果に/ SRのうち、直接この細胞小器官内のCa 2+の測定だけでなく、その動きを可能にします。この方法は、SRおよび細胞質のCa 2+レベルの変化は、全体的な携帯の健康に影響を与えるとどのようにこれらの変更が相互に関連しているかの包括的な理解に向けて取り組んで研究者のための多くの利点を有しています。細胞内Ca 2+運動の伝統的な観測が唯一の細胞質のCa 2+レベルの変化を追跡することを含みます。 D1SRまたは類似の構築物を用い由来の重要な利点は、したがって、むしろSRに対するアゴニストの効果によって上あいまいな結論を引き出すするよりも、このようなSRのような特定の細胞小器官を含むこのイオンの動きを監視する機能です間接的にこのような操作によって誘発され、細胞質のCa 2+レベルの変化を観察します。同じ静脈に沿って、SRのCaに影響を与えるように働く薬剤は、特に、より効率的に細胞小器官、細胞全体の細胞の Ca 2+濃度および全体的な健康の両方に対するそれらの効果を評価するために使用することができる2+。それはD1SRで培養した細胞のトランスフェクションは、管腔内SRのCa 2+レベルの変化を測定するより直接的なだけでなく、無料の、方法を提供することで、これらの利点に起因しています。また、重要性のこのモデルは、細胞ストレスまたは特定の機能的応答を誘導することが知られている薬理学的または生理学的作用物質に応答してSRネットワーク内Ca 2+濃度の変化を測定するためのツールを提供することです。これは、関心のある任意の細胞でD1SRインジケータの較正曲線を生成することによって可能となります。 ER / SR中のカルシウム濃度は、正規化D1SR比（F / F 0を較正することによって計算することができます。）標準較正曲線に対して以前に10、11記載の方法。 ここで概説したプロトコルの制限は、他の細胞型でD1SR構築物の使用に関する入手可能な情報の欠如です。他の細胞型との使用はこれまでに限られているが、この方法はこれまでのところ、我々の研究で複数回13-15ラットのSMCのために成功しています。この方法の成功のためには、すべての予防措置は、細胞培養工程の健康な進行を確保するために取られることが重要です。ガラス底の顕微鏡プレート上のラット大動脈平滑筋細胞の十分な成長を促進することが証明されている購入のために利用可能な多くのタンパク質ベースのゲル状物質などのプレート上の細胞増殖を可能にする適切な材料を使用することが重要です。細胞は、それらの最適の通路の間に、高密集度で調製されていない場合D1SR、その後のイメージングでのトランスフェクションの成功の変動を観察することができます。 Pへの変更次善のトランスフェクションおよび弱い信号は、撮像段階の間に得られる可能性があり、同じ細胞株の長期の使用に固有henotype。 D1SR構造体を用いた実験は、イメージングのための細胞の密集度を確保するために前にその実行には、少なくとも36〜48時間のために準備しなければならないように、この方法の使用に関与する制限は、主にそのために必要な細胞培養作業によって避けられない作られたものであり、アデノウイルスで細胞を増殖させるのインキュベーションのための十分な時間。

Ca 2+が 、体内のすべての単一のセル内に豊富に見られる非常に重要なイオンで ​​す。それは、成長、増殖、遊走、およびアポトーシス1-4を含む多くの異なる細胞機能、で重要な役割を持っています。よくのCa 2+は両方の直接的および間接的な作用を介してこれらのプロセスに影響を与えることができることが確立されているため、このイオンの正常な細胞内濃度の変更が容易に影響を受けた細胞についてのネガティブな結果をもたらすことができます。 SRは、セル5内の最大の細胞内Ca 2+ストアとして考えられています。 SRと細胞質の両方におけるCa 2+の定常状態レベルは正常にし、この細胞小器官のの Ca 2+ -transportingチャンネルのうち、一定の磁束によって維持されています。損傷または疾患のいずれかの形式に起因する細胞に課さストレスの多い条件は、一般的に、彼に長期的な効果を持っているために行くSRのCa 2+の有意な変化と関連していますセルのALTH。例最も深刻で、ストレスを受けた細胞のできないことは、定常状態のSR Caを回復し、維持するため2+レベルはあっても、アポトーシス6-8により死に終わることがあります。 携帯のCa 2+動態への現在の研究は、その数少ない研究試験細胞小器官の Ca 2+ストアのコンテンツを直接9-11事実によって制限されます。最も一般的な方法ではなく、SR の Ca 2+含有量12-14の変化の間接的な測定として、細胞質のCa 2+レベルの測定を含みます。これらの実験において、 の Ca 2+は、一般的に細胞小器官の枯渇を引き起こす薬剤（ 例えば、タプシガルジン）の使用を介してSRから放出されるように誘導されます。結論は、その後、細胞質のCa 2+濃度の変動に基づいて、SRのCa 2+への変更に関連して描かれています。ラウンドアバウトのミリアンペアで、このような結論を導き出すために研究者のための残りの能力にもかかわらず、nner、のCa 2+測定SRのこの方法は明らかに収集されたデータの解釈に関する多くの制限で、そのような情報を収集するための間接的な方法です。この明確な制限を回避するためには、SR管腔ネットワーク内で直接見出さの Ca 2+の量を測定する必要があります。 直接管腔内SRのCa 2+レベルを記録することができるというの最終的な結果にバイタルは、細胞培養ツールと使用のCa 2+指標です。現在の原稿に参照されるデータについては、使用されたVSMCは、凍結した細胞株からのものであることに注意することが重要です。細胞を、5％CO 2電源で一定37℃でインキュベート概説した実験用通路22-26上ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％新生仔ウシ血清（NCS）で培養しました。現在の方法を使用して、例えば、細胞が非常にうまく外をシミュレートするタンパク質混合物に成長しました組織15の多くの異なる種類の環境。 SRのCa 2+研究の静脈に沿って成功のための重要なのは、使用されるタンパク質の混合物の一種です。この場合には、低成長因子品種は、通常のCa 2+シグナル伝達と絶えず試験された細胞内で起こる動きに影響を与えることから、このツールの構成要素を回避するために必要でした。試験細胞の正常な成長に続いて、のCa 2+インジケータも効果的に、これらの培養細胞に導入されなければなりません。これは、SR-在住のCa 2+インジケーターD1SRを運ぶアデノウイルスベクターを使用することによって可能となりました。高いトランスフェクション効率を達成するために、細胞は、イメージングの前に、少なくとも36〜48時間のためのウイルスベクターを用いてインキュベートされなければなりません。この調製は、高い精度と再現性でSRルーメン内のCa 2+トランジェントを測定するための信頼性の高いツールを提供します。 このプロトコルで使用されるD1SRインジケータはD1ERのCa 2+、iの修正変異体でありますもともとカリフォルニア大学の博士ロジャー・Y・チエンの研究室、サンディエゴ、USA 9,16によって作成されたndicator。元D1ERは、前のCa 2+指標9,16に比べてはるかに広い範囲（0.5から160μM）を介してのCa 2+感受性を表示カメレオンと呼ばれる遺伝的にコード化された Ca 2+指標の第二世代に属しています。新しい変種D1SR、博士ウェイン・チェン（アルバータ大学、カナダ）からの親切な贈り物は、しかし、（代わりに元D1ERのように、カルレティキュリンシーケンスの）変異カルセケストリンシーケンスを運びます。変異カルセケストリンは11ルーメンSR内のCa 2+に結合する内因性カルセケストリンと競合の問題を解消するのCa 2+への結合を減少しています。 D1SRインジケータが変更されたカルモジュリン（CAM）とM13（トンを含むリンカータンパク質によるその結合切り捨て強化シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を運びます彼のCaM）配列に結合ミオシン軽鎖キナーゼの26残基ペプチド。カムM13配列は、内在性カルモジュリンに結合するM13のを防止するように改変されています。また、SR保持を確実にするために、カルセケストリン配列はCFP 11の5 &#39;末端に追加されています。 Ca 2+と結合すると、カムM13ドメインは、FRETシグナル強度の増大として記録され、隣接CFPとYFPとの間のエネルギー伝達の増加をもたらす立体構造変化を経ます。ドロップ2+ SR腔のCa濃度は、カムM13ドメインが隣接CFPとYFPの間のエネルギー移動、及びFRETシグナル強度の有意な低下が低下、逆コンフォメーション変化を通過する一方、 。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (high glucose, pyruvate)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn Calf Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass-bottomed plates</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL 0.2 &#956;M vented blue plug seal cap flask</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA Solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1SR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo 4-AM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>F-23917</td>
			<td>Keep at -20&#176;C until right before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>T7100BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5.0</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of calcium fluctuations within the sarcoplasmic reticulum of cultured smooth muscle cells using fret-based confocal imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

このセクションでは、間接的に、細胞質のCaの変動を観察することによっての Ca 2+ストア濃度オルガネラへの変更を測定する一般的に用いられる方法と比較して、SR腔Ca 2+濃度データを捕捉するために記載された方法を用いて得られる結果の例を提供する2+ 。 図1Aは、（514 nm励起/ 535 nmの発光）YFPチャンネルでD1SRアデノウイルスでトランスフェクトされたSMCの文化の関心領域（ROI）のスナップショットを示しています。全てのSMCはD1SR発現について陽性であるが、示されているように、それはD1SRインジケーターの発現レベルは、同じROI内の異なるセル間で異なることは明らかである。 図1Bは、D1SRでトランスフェクトされたSMCの蛍光画像の2次元投影を示しますCa 2+の分布の鮮明な画像を提示するアデノウイルス（YFPチャンネル）、広大SR管腔ネットワーク内。 図1Cは、CFP（488分の440 nm）で、FRET（535分の440 nm）であり、YFP（535分の514 nm）のバンドパスフィルタを使用して、SMCでD1SR指標分布を示しています。 我々はまた、（2μM）（ 図2）タプシガルジンエージェントを空にするSRへの細胞の急性暴露の明確な試験を使用して、SRにこの対象となるイオンの動きを監視から得られた Ca 2+シグナルトレースの例を示しています。 図2Aおよび図2Bに示すように、タプシガルジンは、SR の Ca 2+含有量（の[Ca 2+] SR）の低下を誘導します。 図3Aに、我々はSR空剤タプシガルギン（2μM）で処理した細胞質のCa 2+インジケーターを搭載した培養平滑筋細胞の代表的な画像を示しています。記録された Ca 2+シグナルの観察された一過性のピーク（ <strオング&gt;図3B）は、のCa 2+過渡現象の源は明示的に識別できない場合でも、SMCの細胞質へのCa 2+放出の指標です。 図4Aは、SRカルシウム指標D1SRを発現する培養平滑筋細胞の代表的なスナップショットを示し、エンドセリン-1の100nmで処理しました。 図4Aおよび図4Bの両方に示されるようにD1SR FRETシグナルの低下によって測定されるように、エンドセリン-1は遅いが、SRカルシウム含有量の安定した低下を誘導します。明らかなように、レシオメトリックFRETプロトコルが重要なのCaの研究を可能にする2+直接薬剤の作用機序に関連した動きが使用されます。直接このようにしてに/セルで最大のCa 2+ストアからこのイオンの動きを測定することが直接SRの行動や釣り銭に関係のCa 2+動態の結果の代表を提供する際に便利です<html> SR内腔環境中のS。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53912/53912fig1.jpg" /> ラット大動脈平滑筋細胞におけるSRのCa 2+インジケーターD1SRの 図1. 配布。（A）48時間後の感染でD1SR andenoviralベクターでトランスフェクトされた代表画像描いたSMCの文化。 （B）YFPチャネル（514 nm励起/ 535nmで発光）を用いて培養SMCにおいてD1SR分布の蛍光画像の2次元射影。 （C）CFP（488分の440 nm）を、FRET（535分の440ナノメートル）、およびYFP（535分の514 nm）のバンドパスフィルタを用いD1SR指標でトランスフェクトされたSMCの代表的なスナップショット。スケールバー=10μmとは。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53912/53912fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg &quot;/&gt; 図2. タプシガルジンは、の[Ca 2+] SR の大幅な低下を引き起こす 。培養ラット大動脈平滑筋細胞の（A）リアルタイム疑似カラーのスナップショット（FRETチャンネル）がD1SRでトランスフェクトし、2μMので処理された旨の信号強度の減少を示すタプシガルギンタプシガルギン誘発性のCa 2+放出にSR の Ca 2+含有量の有意な低下。 （B）の[Ca 2+] SRの大幅な低下を確認タプシガルジン2μMで処理された培養平滑筋細胞内のF / F 0値のための代表的なトレース。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53912/53912fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53912/53912fig3.jpg" /> Fiのグレ3. タプシガルジンは、（[Ca 2+] i） の2+の細胞質のCaの有意な増加を引き起こします 。 （A）細胞質のCa 2+インジケーターを搭載した、およびタプシガルジンの2μMで処理した培養ラット大動脈平滑筋細胞の代表的なスナップショット。示されるように、タプシガルギン起因SRからのCa 2+放出を、細胞質内シグナル強度の有意な増加を引き起こします。 （B）タプシガルギンの2μMで処理された培養平滑筋細胞内のF / F 0値のための代表的なトレース。 Ca 2+シグナルで描か増加はSRから放出された Ca 2+の量に比例すると考えられている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53912/53912fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図4.エンドセリン-1は、の[Ca 2+] SR。培養ラット大動脈平滑筋細胞の（A）リアルタイム疑似カラーのスナップショット（FRETチャンネル）D1SRでトランスフェクトし、100 nmのエンドセリン-1スローを示すで処理の大幅な低下を引き起こすが、原因SRのためのエンドセリン誘発性のCa 2+放出にSR の Ca 2+含有量の有意な低下を示す信号強度が着実に減少。 （B）エンドセリン-1の100 nmので処理された培養平滑筋細胞内のF / F 0値のための代表的なトレース。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53912/53912fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K ビュー.  University of British Columbia. Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

生物学

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

共焦点顕微鏡を用いた生細胞におけるエンドサイトーシスおよび細胞質区画における同時pH測定

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...