The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

フレッシュSの1の単離ベネズエラ胞子および使用済培養液の調製<ol><li> divIVA-mCherryをPが のFtsZ -ひずみSV60 [attBで φBT1 :: pSS209（Pの divIVAの10μlの胞子を、60μlのR2の微量元素溶液（TE）を補充した30ミリリットルマルトース酵母エキス、麦芽エキスを接種する（MYM）培地、 -ftsZ-ypet）]。一貫性のある成長と細胞の胞子形成のために、バッフル付きフラスコまたは十分な通気を可能にするために、スプリングが含まれているフラスコを使用します。 </li><li> 30℃で35-40時間、および250 rpmのための培養細胞。 </li><li>液体マウントされ、位相差顕微鏡により細胞を調べます。この時点で、菌糸体断片および胞子が表示されます。 </li><li>菌糸体と、より大きな細胞断片をペレット化するために1分間400×gで卓上遠心機で遠心1ミリリットルの細胞。 </li><li>約300μlの上清の共同を転送新しい1.5 mlチューブに胞子の懸濁液をntaining、氷上に保ちます。ステップ1.7の残りの培養液を保管してください。 </li><li>胞子をMYM-TE 1:20希釈（最終濃度：0.5〜5×10 7胞子/ ml）を、必要になるまで氷上で維持する（ステップ2.3参照）。 注： ストレプトミセスに胞子形成を誘発する正確な条件は、胞子形成培養物から任意の未知の細胞外シグナルを含む、使用済みMYM-TE媒体を使用して、理解されていないが、胞子形成を刺激します。 </li><li>胞子および菌糸体断片の自由であるMYM-TE費やし得るために、残りの培養液の10ミリリットルを濾過滅菌します。滅菌0.22μmのシリンジフィルターを使用して、転送は、滅菌15mlチューブにMYM-TEを過ごしました。 </li><li>同様の成長条件を使用して、追加の実験を行うことになっている場合は4℃で数日のために準備を過ごしたMYM-TEを保管してください。 </li></ol>マイクロ流体デバイスの作製注：各マイクロ流体ナンプラーをteが行わなければ、4つの独立した実験まで可能になります。実験を設定する際に、未使用のフローチャンバーの汚染を避けるために、滅菌溶液と労働条件を使用しています。 <ol><li>マイクロ流体プレートから出荷溶液を除去し、滅菌MYM-TEでウェルをすすぎます。 </li><li> 6へのウェル2にMYM-TE費やしウェル1および300μLを入口に300μlのMYM-TEを追加します。 </li><li>負荷40μlをレーン「A」のセルローディングウェル8のステップ1.6から胞子を希釈し、指示を製造に係るプレートにマニホールドを密封します。 </li><li>ウェルあたり2分間6 psiで5に入口ウェル1からの媒体を流すことによって、マイクロ流体制御ソフトウェアを起動し、適切なプレートタイプを選択し、プライム流路と培養室にフロープログラムを設定します。 </li><li>発芽および細胞の栄養成長を可能にするために、6時間、入口ウェル1からMYM-TEを流れる：マイクロ流体制御ソフトウェアでは、実験のためのフロープロトコルを作成します。スイッチその後、実験の残りの時間のためだけでなく、2〜5からの使用済みMYM-TEの灌流に。実験中（約9μlの培地/時間に相当）6 psiで流れ圧力を一定に保ちます。ステップ3.5の後にフロープログラムを起動します。 </li></ol>顕微鏡とタイムラプスプロトコルの3セットアップ注：このメソッドは、sCMOSカメラ、メタルハライドランプ、ハードウェアのオートフォーカス、96ウェルプレート用ステージホルダーと環境チャンバを装備した完全電動および自動化倒立広視野顕微鏡に実装されました。 <ol><li>実験を開始した後、オートフォーカスの問題を防止するために、予め30℃に環境チャンバをあらかじめ温め。必要な時間は、使用環​​境室、顕微鏡や暖房システムに依存します。実験前の夜システムを加熱するために開始します。 </li><li>顕微鏡と顕微鏡検査の自動化と制御softwaをオンにします再。このような100X、1.46 NA油DICの目標として最適な信号の収集と空間分解能、高開口数（NA）油浸対物レンズを使用してください。蛍光黄色と​​赤の蛍光タンパク質融合体の微分干渉コントラスト（DIC）画像と画像を取得するために、適切なフィルタおよび二色性ミラーを選択します。 </li><li>客観的にイマージョンオイルの滴を置き、画像取得時のセルにフォーカスを改善するために、マイクロ流体板上に撮像窓の下に液浸流体を追加します。慎重に倒立顕微鏡のステージ上にシールマイクロ流体デバイス（ステップ2.5）をマウントします。プレートがしっかりとステージホルダーに配置され、実験の過程にわたってシフトしないことを確認してください。 </li><li>オリエンテーションのために埋め込まれた位置マーカーを使用して焦点にマイクロ流体培養室の撮像窓を持参してください。に対応し、トラップサイズ5を有する第一のフローチャンバー（ラベル「A」）の一番左の部分に焦点を合わせます0.7ミクロンのトラップの高さ。 </li><li>マイクロフルイディクス・ソフトウェアでは、入口ウェル8からロードセル15秒4 psiで。撮像窓全体にステージを移動させることにより、培養チャンバー内の細胞密度を確認してください。何の胞子がトラップされなかった場合は、セルの負荷ステップを繰り返すまたは代わりに所望の細胞密度が達成されるまで（2048 X 2048ピクセルの撮像窓あたり1-10胞子）負荷圧力および/または時間を増加させます。培養室の過負荷を避けます。 私たちは通常、 ストレプトミセスを撮像するためのトラップサイズ5を使用しますが、我々はまた、4と3は、セルロードプロセスを最適化する上で追加の提案を供給業者のマニュアルを参照してくださいサイズトラップとの良好な結果を得た：注意してください。 </li><li>ステップ2.5からの制御ソフトウェアのフロープログラムを起動し、マイクロ流体板は、画像取得を開始する前に、顕微鏡ステージで1時間熱平衡化することができます。 </li><li>顕微鏡制御ソフトウェアでは、ミューを取るために多次元の取得を設定時間をかけて複数のステージ位置でltiple画像： <ol><li>自動保存の場合：画像ファイルの自動保存のためのディレクトリを指定します。 </li><li>イルミネーションの設定については、事前に各特定の構築物のための最適な照明設定を決定します。 DIC 150ミリ秒、YFP 250ミリ秒、RFP 100ミリ秒：概説実験のために、以下の露光時間を使用します。 </li><li>時系列の場合：シーケンス内の所望の時点で画像を取得する時系列を設定します。 S.のライフサイクルを撮像しますベネズエラ 、24時間かけて40分の時間間隔を選択します。 </li><li>ステージの位置やオートフォーカスの場合：対象の各撮影位置の舞台と店舗ステージ位置を移動させることにより、培養室をスキャンします。シングルステージの位置は、光退色最小限に抑え、phototoxicity.Typicallyは12ポジションまで使用するのに十分に離れて配置されていることを確認してください。遅い焦点ドリフトを補正するために、各時点でオートフォーカスのルーチンを実行します。顕微鏡制御ソフトウェアで利用可能な場合、「ハードウェアのオートフォーカスにより局所的な表面更新」へのオートフォーカス方式を設定します。選択されたステージ位置のZ座標が確認されると、ハードウェアのオートフォーカスを有効にします。 </li></ol></li><li>顕微鏡制御ソフトウェアのタイムラプス実験を開始します。 </li><li>すべてのステージの位置は、後のポイントで焦点に残っていることを確認してください。数時間かけて実行してタイムラプス実験のために、私たちは時折、オートフォーカスを使用していても、ステージのドリフトを観察します。ステージ位置をリフォーカスする必要がある場合は、適切な時点で実験を停止し、フォーカスを調整し、定義された撮影時間間隔（ステップ3.7.3）内で実験を再起動します。時系列を連結する方法については、ステップ4.3を参照してください。 </li><li> 24-30時間後に画像取得を停止するか、関心領域内の菌糸が胞子に分化したとき（DICイメージシリーズを参照してください）​​。ソフトウェアでフロープログラムを停止し、マイクロ流体デバイスを分解。 </li><li>短期STOの中古マイクロ流体板を準備激怒。に残っているMYM-TEを削除し、6によく1からMYM-TEを費やし、空の廃棄物ウェル7とセルの負荷も8無菌条件下で、レーン「A」の再充填使用ウェルおよび未使用レーンのウェル（ &quot;B&quot;滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でプレート上の「D」）。 4℃で乾燥し、ストアからそれを防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。 </li></ol>フィジーのソフトウェアを使用したタイムラプスムービーの4世代注：我々は、さまざまな商用フリーソフトウェアパッケージはZenBlue、をMetamorph、ICY、イメージプロ（ImagePro）またはImageJを含むタイムラプス顕微鏡画像を処理するために利用可能であることに注意してください。ここでは、ImageJのに基づいてオープンソースの画像処理プログラムであるフィジー、に焦点を当て、かつ、既に有用なプリインストールされているプラ​​グインの数を提供します。 <ol><li>フィジーがインストールされているコンピュータへのあなたのタイムラプス実験から転送イメージングデータ。 </li><li>プログラムを起動して、＆用いた撮像ファイルをインポート＃34;ファイル]&gt; [インポート]&gt; [バイオフォーマット」。かでは単にフィジーにイメージングファイルをドラッグして「バイオフォーマットインポートオプション各照明チャンネルに別々の画像スタックを取得するために分割チャンネル &quot;&quot;、ボックスにチェックを入れ、「（DIC 、RFP、YFP）。 </li><li>オプション：（DIC、RFP、YFPチャンネルごとに、起因するリフォーカス（ステップ3.9）に、画像取得中の破損に起因する個別の時系列をマージし、それぞれの画像スタックを開き、実行する「イメージ&gt;スタック&gt;ツール&gt;を連結する」ために）。 </li><li>画像スタックをスクロールすることにより、時系列データの品質を評価します。時間をかけてフォーカスに滞在菌糸、ショーの菌糸の成長を探し、最終的に胞子（DICスタック）を形成します。それぞれ、栄養または胞子形成菌糸（YFPスタック）内の単一の環または複数、梯子状の構造を形成する菌糸先端にDivIVA-mCherryを（RFPスタック）とのFtsZ-YPetの予想細胞内局在を調べます。 </li><li>下流processiのための関心領域を分離画像のngの。タイムラプス顕微鏡は、多くの場合、フィジーでの処理が遅くなることがあり、大きなファイルを生成します。したがって、特定し、関心領域（ROI）を分離し、画像スタックのこの小型版で、さらに画像処理ステップを実行するようにすることをお勧めします。 <ol><li>メニューで「長方形選択」ツールを選択し、開発菌糸が画像シリーズ全体のROIで囲まれているようにDICの画像スタック内の長方形のROIを描きます。 </li><li> 「Ctrlキー」+「Shiftキー」+「D」とROI-スタックを複製します。 </li><li> YFPの画像スタックの名前バーをクリックして選択し、「編集&gt;選択&gt;選択を復元する」YFPスタック内の同じ位置決幅にスタック元DICから前の長方形の選択範囲を復元し、「Ctrlキー」でROIを複製するには、メニューに+「Shiftキー」+「D」。 </li><li> RFPスタックこのプロセスを繰り返します。 </li></ol></li><li> 3画像スタックトンに画像を合わせますO時間をかけてxy平面内のステージのドリフトを除去します。 DICスタック内の最後のフレームにスクロールして、メニューから「プラグイン&gt;登録&gt; StackReg&gt; Ri​​gedBody」を選択します。 RFPとYFPの画像スタックに対して、この手順を繰り返します。必要であれば、ステップ4.5.1-4.5.3を繰り返すことでROIをトリミング。 </li><li>オプション： &quot;&gt;プロセスコントラストを高める」「明るさとコントラストツールを調整する」（「Ctrlキー」+「Shiftキー」+「C」）または選択で各画像スタックのために、手動で明るさとコントラストを調整して、メニューからと「ノーマライズ」を適用しますスタック内のすべての画像へのコマンド。後者のコマンドは、ピクセル値を変更し、従って下流の画像解析に影響を及ぼし得ることに留意すべきです。 </li><li>オプション：「コンバイン&gt;画像&gt;スタック&gt;ツール」プラグインを使用して、水平または垂直（4.11を参照して、RGBファイル形式に変換）個々のスタックを結合します。 </li><li>スケールバー（「分析&gt;ツール&gt;スケールバー」）と時間スタンパを追加（＆＃34;画像&gt;スタック&gt;タイムスタンパ」）。 </li><li> 「.TIFF」形式の画像シーケンスとして修正された画像スタックを保存します。映画を生成するには、「.AVI」として保存します。 「バイオ・フォーマット&gt;バイオフォーマット輸出」プラグインを使用して、QuickTime形式で別の方法として、輸出画像シリーズと「.MOV」ファイルの種類を選択します。 </li><li> 、単一のフレームから画像を取得し、目的のフレームを選択し、画像の &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shiftキー」+「D」を複製します。 「RGB」または「8ビット」の下の &quot;&gt;画像&gt; RGBカラーまたは8ビットを入力」と「.TIFF」として画像を保存するために、得られた画像の種類を変更します。 注：フィジーは、さらに注釈を付けるための追加機能が多数用意されていますまたはプロセスのタイムラプスシリーズ。詳細情報（http://fiji.sc/Fiji）のためのフィジーオンラインサポートにアクセスしてください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes.">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li><li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.:+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere?.">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?.</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li><li>McCormick, J. R., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development.">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li><li>Fl&#228;rdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces.">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li><li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ser/Thr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces.">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li><li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth.">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li><li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces.">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li><li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ.">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li><li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles.">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li><li>Grantcharova, N., Lustig, U., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li><li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria.">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).</li><li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor.">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li><li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li><li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation.">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li><li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+control+of+cell+division:+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces.">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li><li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures.">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li><li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma(BldN)+and+a+cognate+anti-sigma+factor,+RsbN.">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li><li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development.">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).</li><li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+aerial+growth,+cell+division,+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae.">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li><li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development.">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li><li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-L&#242;pez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis.">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).</li><li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS.">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li><li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria.">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li><li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum.">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078 (2013).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ストレプトマイライフサイクルのタイムラプス顕微鏡は、過去に技術的に困難となっています。ここでは、発生プログラム（ 図2）を介して進行を視覚化し、トレースを助けるために細胞極性マーカーDivIVAと細胞分裂タンパク質のFtsZに蛍光タンパク質融合を使用して完全なライフサイクルの生細胞イメージングを実行するための堅牢なプロトコルを提示します。 この方法の中心には、Sの栽培です（MYM-TEを過ごした）使用済み培地で一定の媒体灌流および通常の増殖培地（MYM-TE）の交換を可能にするマイクロ流体デバイスでベネズエラ 。栄養豊富な培地の連続供給は栄養growtを刺激するのに対し、培養条件の変化は、胞子形成を促進し、使用済み培地中の任意のまだ正体不明の細胞外シグナル（ 例えば 、クオラムセンシングシグナル）などの井戸のような栄養ダウンシフトので記載されているプロトコルには重要ですほとんど胞子形成とH（データは示さず）。従って、この微小流体システムにおいて細胞を培養することは、多くの実験的な柔軟性を提供し、培養条件の変化に応答して、細菌増殖の変化の長期的モニタリングを可能にするため、アガロース上で細胞を培養することに優れています。マイクロ流体プレートは単一の使用のために設計されているが、細胞を接種されていない流路は、その後の実験に使用することができます。私たちは長い時間のために開かれてきたプレートにマニホールドを密封する問題を経験しているように私たちは、一週間以内に、マイクロ流体板のすべてのチャネルを使用することをお勧めします。 実験を設定する際に、我々は、生殖管が（データは示していない）出現する前に凍結グリセロールストック由来する胞子は、少なくとも6時間を要したのに対し、新たに調製された胞子が、フローチャンバーにロードされる二時間以内に発芽することを見出しました。発芽中のこの遅延は、実験の長さを拡張し、を妨害することができます機器の可用性と実験条件。発芽管の開発と成長のための十分な栄養素を提供するために、少なくとも3時間MYM-TEの灌流を用いた実験を開始することも重要です。実験は栄養成長を研究するために設計されている場合MYM-TEによる灌流は、最初の3時間を超えて拡張することができます。胞子は、出発物質の好ましい選択を提供するが、短い菌糸断片はまた、マイクロ流体板にロードすることができます。しかし、剪断された菌糸体を使用して、積載効率が低く重要であり、多くの場合、非胞子形成変異体を検査するときの制限を提示することができるいくつかのロードを実行する必要があります。かかわらず使用接種物の種類の、メディア拡散を妨害し、画像解析を複雑にすることができ、迅速な過密につながるとして、胞子または菌糸断片と培養室をオーバーロードしないことが重要です。 レポータータンパク質の建設を計画することが重要ですcarefuLLY ストレプトミセスにおける蛍光タイムラプスイメージングで使用するため。標的タンパク質と蛍光レポーターおよびN末端またはC末端融合の選択肢の間のリンカーの長さが重要になる場合があります。また、撮影頻度及び露光時間を含む最適な実験条件は、それぞれの蛍光タグ化タンパク質のために予め決定される必要がある。S.低レベルで発現される蛍光標識したタンパク質を撮影するときに問題となる可能性があり、緑/黄色のチャネルでベネズエラ菌糸展示自家蛍光。また、発芽初期栄養成長段階の間、S.、ということに留意すべきですベネズエラは、短波長光（ 例えば 、CFPへのタンパク質融合物を使用する場合）に特に敏感です。 細菌の生細胞イメージングのためのイメージング技術と、蛍光レポーターシステムの継続的な進歩にもかかわらず、ソフトウェアパッケージのほとんど（ 例えば MicrobeTracker、Schnitzelcデータセットのこれらの種類のその後の自動処理のためのells、CellProfiler）は多細胞のライフスタイル27-29と糸状菌由来画像の解析をサポートしていません。従って、 ストレプトマイセスおよび他の糸状菌からの撮像データの定量的なハイスループット分析のための適切なアルゴリズムを開発する必要があります。 要約すると、ここで説明する作業は、Sの計り知れない可能性を示していますなぜなら、液体中に胞子を形成する能力の属のための新しいモデル発達システムとして、 ベネズエラ 。マイクロ流体培養装置は、不慣れなユーザーのために使用するのは簡単です。これは、動的なタンパク質の局在化、偏成長、およびunigenomic胞子の鎖に多細胞菌糸体の形態学的分化を含むストレプトマイライフサイクル、中央細胞生物学的プロセスを研究するための優れたプラットフォームを提供します。また、この実験セットのuPはまた、ペプチドグリカン合成またはヨウ化プロピジウム及び4を監視するための蛍光D -アミノ酸&#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールなどの培養条件を交互に必要とする開発中のイベント、または蛍光色素の使用を調査するために魅力的な出発点を提供します染色体組織30,31を可視化する（DAPI）。

A correction was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

放線菌は休眠、unigenomic胞子1-3に多細胞、栄養捕捉菌糸体から形態的分化を含む複雑な発達サイクルを特徴とする土壌中に生息する細菌です。 有利な増殖条件下で、典型的なストレプトミセス胞子は、一つまたは二つの生殖管（ 図1）を押し出すことによって発芽し始めます。これらの管は、先端延長によって細長く、栄養菌糸として知られる分岐した菌糸のネットワークへと成長します。極性成長と菌糸の分岐が不可欠なタンパク質DivIVAによって指示されます。このコイルドコイルタンパク質は伸びる先端4-7で新しい細胞エンベロープ材料の挿入のために重要であるpolarisomeを、と呼ばれる大きな細胞質複合体の一部です。栄養成長の間に、菌糸のフィラメントは、いわゆるクロス壁8の不定期の形成による区分化になります。これらのクロス壁の形成は、再<html>帖のFtsZ、ほとんどの細菌9における細胞分裂に不可欠であるチューブリンのような細胞骨格タンパク質。 ストレプトマイセスでは、しかし、これらの植物の交差壁が収縮し、細胞-細胞分離につながらない、したがって、菌糸塊が相互接続された合胞体区画のネットワークとして残ります。十分に理解されていない栄養制限及び他の信号に応答して、特殊な気菌糸は栄養菌糸体から脱却し、空気3に成長します。これらの構造の勃起が長いマルチゲノム気菌糸が等しいサイズのunigenomic prespore区画の数十に分けになっている間、開発の生殖期を、開始します。この大規模な細胞分裂事象は、単一胞子形成菌糸2,10内の複数のFtsZリングの同期収縮によって駆動されます。形態学的分化は休眠、厚肉、着色された胞子の放出によって完成されます。 トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> 図1： 固体培地上で ストレプトマイライフ サイクルこれはSの古典的研究に基づくライフサイクルのモデルです寒天プレート上で増殖しているコエリカラー 。胞子の細胞の開発は、菌糸の分岐ネットワークを形成するために、先端延長によって成長する1または2発芽管の形成から始まります。栄養菌糸の極性成長と分岐がDivIVA（赤）によって指示されます。栄養クロス壁の形成はのFtsZ（緑）が必要です。栄養素制限と他の信号に応答して、気中菌糸が立設されています。空中成長の逮捕は、しっかりと箱状presporeの区画に胞子形成菌糸を区分胞子形成セプタムを生じさせるのFtsZリング、ラダーの組み立てと調整されています。これらの区画は、厚い胞子壁を組み立て、最終的にreleaされています成熟した着色された胞子としてのsed。 ストレプトマイライフサイクルの重要な発生事象は十分1,3を特徴とします。しかし、まだ何の不足などタンパク質の局在ダイナミクス、染色体移動および発生の制御、細胞分裂などの分化を支える細胞内プロセスへの洞察を提供するために、蛍光タイムラプス顕微鏡を用いる細胞生物学的研究があります。 ストレプト開発のライブセルイメージングが原因ライフサイクルの複雑さと、生物の生理学的特性の挑戦でした。栄養成長と胞子形成隔形成の初期段階でのこれまでの研究では、酸素透過イメージングチャンバーを採用し、または顕微鏡ステージ11-15上のストレプトミセスセリカラーのアガロースサポート成長しています。これらの方法は、しかしながら、多くの要因によって制限されます。一部のシステムでは、唯一の細胞増殖ANの短期的なイメージングを可能にします細胞の前にDの蛍光タンパク質は、不十分な酸素供給に苦しむかによる菌糸の開発の3次元パターンに焦点面の外に成長します。長期的なイメージングが可能である場合には、アガロースパッド上で細胞を培養すると、細胞が代替増殖またはストレス条件に曝露することができないため、実験の柔軟性を制限し、アガロースパッドにおける媒体からのバックグラウンド蛍光が大幅に弱い蛍光を監視する能力を制限します信号。 ここでは、優れた精度と感度との完全なストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのプロトコルについて説明します。蛍光広視野顕微鏡（図2）に接続されたマイクロ流体デバイスにストレプトミセスを成長させることにより、私たちは今までの30時間の時間をかけて発芽、栄養成長と胞子形成隔壁形成をモニターすることができます。これは非常に新しいモデル生物ストレプトミセスの使用によって促進されます</em&gt;のベネズエラは、それは、液体培養でほぼ完全に胞子形成し、それによって、古典的なモデル種S.の限界を克服するため、固形培地16-20にのみ胞子形成コエリカラー 、。栄養成長と胞子形成を視覚化するために、我々を共発現は、蛍光細胞極性マーカーDivIVAと重要な細胞分裂タンパク質のFtsZのバージョンをタグ付け。 我々が正常マイコバクテリア、 大腸菌 、 コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌および酵母21-25のために使用された市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システムは、単一の焦点面に細胞を捕捉し、異なるリザーバからの培養培地の連続的なかん流を制御することができます。詳細なプロトコルでは、我々はSを露出させるためにこの機能を活用します胞子形成を促進するための栄養ダウンシフトに栄養菌糸体をベネズエラ 。 プロトコルデスクライブ全体ストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのものであるが、特定の発達段階は特に重要である場合、代替メディア条件や顕微鏡の設定を選択することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> 図2： 回路図は、実験的な作業の流れを描きました 。プロトコルで説明した3つの主要なステップが示されています。まず、胞子及び使用済み培地は、静止期培養物から調製されます。第二に、新鮮な胞子はマイクロ流体システム及びSにロードされていますベネズエラは、最適な成長温度を維持するために、インキュベーションチャンバーを完全に自動化された倒立顕微鏡を使用して発達ライフサイクル全体を通して結像されます。第三に、得られたタイムラプスシリーズを分析し、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して処理されます。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Microfluidic culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411857-9061-000</td>
			<td>Environmental chamber surrounding the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocra FLASH 4 V2</td>
			<td>Hamamatsu Photonics K.K.</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator HXP 120V</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>423013-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489046-9901-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489063-0000-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1272-644</td>
			<td>Stage holder for microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>Microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/Positions</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open-source software package</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Generation of time-lapse movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 
			4 g Maltose 
			4 g Yeast extract 
			10 g Malt extract 
			add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2 Trace element solution (TE) 
			8 mg ZnCl2 
			40 mg FeCl3-6H2O 
			2 mg CuCl2-2H2O 
			2 mg MnCl2-4H2O 
			2 mg Na2B4O7-10H2O 
			2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O 
			add 200 ml H2O 
			Autoclave and store at 4 oC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.002 volumes to MYM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Satorius stedim</td>
			<td>16532-K</td>
			<td>Preparation of spent MYM-TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV60</td>
			<td>John Innes Centre strain collection</td>
			<td></td>
			<td>S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

全体Sの成功した生細胞イメージングベネズエラのライフサイクルは、発芽、栄養生長および胞子形成（ 図3、映画1）の主要な発達段階を含む連続時系列が得られます。ライフサイクルを通して進行の可視化は、さらにDivIVA-mCherryをとのFtsZ-YPetの別個の細胞内局在性によって強化されています。発芽し、栄養成長の間に、DivIVA-mCherryを排他的に新たに分岐点（ 図4A）を形成する成長菌糸のヒントやマークに蓄積します。これらの結果は、DivIVA 12,26の以前に報告された細胞内の位置決めと一致しています。対照的に、のFtsZ-YPetは成長菌糸体（ 図4B）で不規則な間隔で単環様構造を形成します。これらの構造はinterconnの形成をもたらす、非収縮栄養クロス壁の合成のための足場を提供しますected菌糸のコンパートメント8。胞子形成菌糸に菌糸の成長、細胞分化が極性DivIVA-mCherryを病巣の消失によって見えるようになり、極性成長の逮捕とのFtsZ-YPet蛍光の同時増加（ 図4C）。菌糸を胞子形成では、のFtsZ-YPetの局在パターンは劇的に変化します。第一螺旋のFtsZ-YPetフィラメントは菌糸に沿って転倒し、その後、突然、ほぼ同期イベントでは、これらのヘリックスは規則的な間隔のFtsZ-YPetリングのはしごに合体します。ここに記載された実験条件下では、これらの均等に分散のFtsZ-YPetはしごは約2時間持続します。最後に、胞子形成セプタムは、微分干渉コントラスト（DIC）画像（ 図4D）で識別可能になり、最終的に新しい胞子が放出されます。 提供フィジーのソフトウェアを用いて画像処理を記述し、その後のプロトコル<html>取得されたタイムラプスシリーズ（動画1）から公開の映画を生産する方法のTEPバイステップで解説。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> 図3：Sの代表的なタイムラプス蛍光顕微鏡シリーズからのスナップショットイメージ ベネズエラ 産蛍光標識のFtsZ（緑）、DivIVA（レッド）マージされた画像の選択されたフレームがある示され（上部パネル：RFP-YFP-DIC、下のパネル：DIC）。発芽、栄養成長と胞子形成を含むストレプトミセスのライフサイクルを可視化します。画像はムービー1時間から採取した時間である：分。スケールバー=5μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> D / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; 図4： ストレプトマイライフ サイクル の成功タイムラプスシリーズの代表的な結果 DivIVA-mCherryをの（A）ローカライズ。 RFPとDICチャネルのマ​​ージされた画像とムービーの1から2以降の時点のスナップショットが示されています。 DivIVA-mCherryを、新しい菌糸のブランチサイト（充填された矢印の頭）をマークし、極性成長（オープン矢印ヘッド）を指示するために菌糸の先端に局在します。スケールバー=10μmの（B）のFtsZ-YPetローカリゼーション栄養成長（矢じり）の間。 FtsZ-YPetは（DIC、下のパネル）を収縮しない単一のリング状の構造（上パネル）を形成します。胞子形成隔壁形成時の（C）のFtsZ-YPet（緑）の局在。 （：分時間）DivIVA-mCherryを病巣は、下記に示す経過時間と、赤で示されています。スケールバー：5μmです。 （D）（C）からの胞子形成菌糸のDIC画像を対応する形を示します最終的には胞子の連鎖（右画像）に成熟可視胞子形成隔壁（左画像）とprespore区画のエーション。時間は時間である：分。スケールバー=5μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ムービー1からフレーム" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> ムービー1： ライフサイクル ベネズエラストレプトミセス のタイムラプス蛍光顕微鏡シリーズ映画がマージされたRFP-YFP画像（左）と対応する微分干渉コントラスト（DIC）画像（右）から構成されています。 DivIVA-mCherryを、緑色、赤色とのFtsZ-YPetに示されています。単一のフレーム間の時間間隔は40分です。スケールバー=10μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">THIを表示するには、こちらをクリックしてください。</a>Sムービー。

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング<em&gt; S。ベネズエラ</emマイクロ流体デバイスの使用&gt;ライフサイクル

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.7K ビュー.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

ビデオ: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

免疫・感染学

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

非侵襲的<em&gt;インビボ</em&gt;活性化可能な蛍光イメージング剤を用いた炎症性MMP活性の蛍光イメージング

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

使用して樹状細胞の移行の監視

RNA精製は、細胞内から成長します

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

非侵襲的

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

'シングルウイルスゲノミクス'を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

使用して樹状細胞の移行の監視

RNA精製は、細胞内から成長します

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

非侵襲的

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化