We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNAのin vitro転写およびmRNAの精製<ol><li>製造業者の指示に従ってNotI制限酵素を用いてPCS2 +プラスミドを含むH2B-PSmOrangeを線形。 注：mRNAの汚染や劣化を防ぐために、手袋や白衣などの適切な保護を使用して、次の手順を実行します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってPCR精製キットまたはフェノール - クロロホルムベースの方法を使用して線状化DNAを精製します。 </li><li>製造元の指示に従ってSp6の-mRNA転写のための線形化の鋳型DNA1μgのを使用してください。 </li><li> 37℃で10-20分間、1.0 UのRNaseフリーのDNアーゼIを添加することにより、DNAを削除します。 </li><li> RNAを製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップを使用したmRNAをクリーンアップします。 </li><li> mRNAの純度および濃度を増加させるために、6μlの酢酸ナトリウム（3.0 M、pH5.2）を150μlの96％エタノールを添加することにより、mRNAを沈殿させます。メートルをインキュベート少なくとも30分間、および24時間まで-20℃でixedソリューション。 </li><li> 4℃で45分間18.407×gで紡糸溶液により、mRNAを収集します。液体を捨て、150μlの70％エタノール中のmRNAを懸濁します。混合し、4℃でさらに15分間この溶液を遠心分離。 、液を捨て、氷上で5分間ペレットを乾燥し、20μlの超純RNaseを含まない水でのmRNAを懸濁します。 </li><li> 100のmRNA希釈（99μlの超純RNaseを含まない水に1μlのmRNAの）：1の測光によるmRNAの濃度および純度を評価します。 </li><li>短期保存の場合、-20℃でのmRNAのソリューションを維持します。長期保存の場合、-80℃でのmRNAを保ちます。 </li></ol>ゼブラフィッシュ胚に2 H2B-PSmOrange mRNAのマイクロインジェクション<ol><li> TG（foxD3：GFP）を使用して、注入前の交配ペア夜を設定します。 TG（FLH：GFP）ダブルトランスジェニック魚（または任意の他のGFPトランスジェニック魚）。スペーサーを配置することによって分離された魚を残しますそれらの間の交配の時間を制御します。 </li><li>注射の午前中にスペーサーを取り外し、20分間の魚の伴侶をしましょう​​。 </li><li>時間を交配時には、130頁の最終濃度にH2B-PSmOrangeのmRNAを希釈/ NLとmicroloaderチップを用いたマイクロインジェクションキャピラリーへの転送6μlの注射液（RNaseを含まない水で）。較正されたスライドガラスに注入量を確認してください。 2 NL mRNAの溶液（260頁）を注入する射出圧力を調整します。 </li><li> 1xの胚（E3）培地を含む滅菌プラスチックペトリ皿に卵を収集します。 </li><li>プラスチック製パスツールピペットを用いて射出皿に20〜30の胚を転送します。 </li><li> 1細胞期11で卵黄への細胞の細胞内へのまたはちょうど下の溶液を含む2 NLのmRNAを注入します。 </li><li> 1×E3培地を含むペトリ皿に移す注入された胚は、未受精か正常に発達した胚を除去し、28℃でそれらを成長させます。 注：ライトプロテクトO胚fを実験を通して必要とされていません。 </li><li> 1×E3媒体にゼブラフィッシュの胚を高め、色素沈着を抑制するために、原腸形成した後、0.2 mMのPTU（1-フェニル2チオ尿素）を追加します。細菌汚染の危険性を最小限にするために1日2回培地を変更します。 </li></ol> 3.胚の埋め込み<ol><li> GFP（緑色）とPSmOrange（赤/オレンジ）蛍光ランプ及び適切な発光フィルターを装備した双眼顕微鏡を用いて共発現胚を選択します。 1×E3媒体を含む滅菌ペトリ皿に正の胚を移します。 </li><li>鉗子12を用いて、実体顕微鏡下Dechorionate胚。 </li><li>カット先端ピペット（P200）を用いて、超純水中で調製予め温めておいた1.0％低融点アガロース（LMA）の1.0ミリリットルを含む1.5ミリリットルチューブに1胚を転送します。注：80°CにLMAを温め、胚を埋め込む前に、室温で3〜5分間クールダウン。 </li><li> 150μlのLMAに胚を移し微細なプラスチックチップを用いて、カバーガラスをチャンバー反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +（または他の任意の適切な顕微鏡）について記載した実験においてダウン、例えば背側の胚の向きを調整します。 LMAが重合されると、麻酔のために0.2 mMのPTUと0.02％の3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）を含む魚の水でチャンバーを埋めます。 </li><li>サンプルを画像化する前に、トリカインの効果を確認するために15分を待ちます。麻酔は、明視野照明を装備した実体顕微鏡を使用してモニターすることができる胚の動きを、防ぐことができます。 注チャンバは、二回再利用することができます。 </li></ol> 4. PSmOrange光変換<ol><li>共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、それぞれGFPとPSmOrangeを画像化するための488 nmおよび561 nmのレーザーを使用してphotoconvertする領域を特定するために、検体をスキャンします。 注：反転STAに反転共焦点レーザー走査顕微鏡A1R +を使用GE顕微鏡イメージングソフトウェアによってTiEcontrolledと488 nmの、561 nmおよび光電およびイメージングのための640nmのレーザーを装備。しかし、アプリケーションが確実であれば変換し、イメージング用のレーザラインが利用可能であるように、この顕微鏡に限定されるものではありません。 <ol><li>所定の場所に（NA：0.75; WD：1.0ミリメートル; FOV：0.64 X 0.64ミリメートル）20X空気目標を置きます。 </li><li>客観上記の焦点面で測定された0.74ミリワット、561 nmのレーザー：光変換前PSmOrangeタンパク質を検出するために、次の顕微鏡の設定を使用します。 注：これは、このシステム上の40％に相当する（焦点面で測定することが効果的なパワーを決定する唯一の方法です）。 H2B-PSmOrange注入の効率などの実験の必要に応じてレーザパワーを調整し変更することができます。 </li><li>関心領域を強調するためにズーム倍率を追加します。高い倍率は、画像取得時間、したがって、光毒性を減少させます。 </li></ol></li><li>被覆構造zスタックを取得488 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-&gt; 4）で561 nmのレーザーを使用して、関心の秒。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。 </li><li>サンプルをスキャンし、関心領域をphotoconvertにエリアをハイライトする（ROI）ツールを選択します。刺激領域としてROIを修正しました。写真アクティベーション/漂白モジュールを選択し、それぞれのチェックボックスをオンにして、488 nmのレーザーを活性化し、80％（客観的に測定された1 mWのレーザパワー）に488nmレーザーを設定します。 0.5秒/フレームへのスキャン速度を設定します。 </li><li>光変換ユーティリティ（ND刺激）を開き、光変換設定を指定します。 <ol><li>光変換プロトコルを指定するには、「追加」コマンドをクリックします。 </li><li> 「取得/刺激」メニューの「取得」の「フェーズ」1に設定し、画像の数が「ループ」メニュー内の光変換前に取得することを示しています。 </li><li>セント &quot;に設定し、「フェーズ」2imulation「刺激イベントの数を入力するには、実行されます。 </li><li>調整 &quot;フェーズ&quot; 3 &quot;相&quot; 1.オプションで説明したように、画像取得の最後のラウンド前に待機する時間を入力して、「フェーズ」2後の待機「フェーズ」を挿入します。 </li><li>すべてのパラメータを設定したら、刺激の設定を適用し、光変換を実行します。 注意：レーザーパワーを、光変換の各ラウンドのためのスキャンおよび反復回数の周波数が変動し、胚から胚に異なる場合があります。で開始する設定を表1に示します。 </li></ol></li><li> 488 nmの、561 nmおよび上記のように設定を適用する640 nmのレーザーを使用して、最終的なzスタックを取得します。 （4.5 mWまで）高いレーザパワーを使用して、変換PSmOrangeを可視化するために640 nmのレーザーを設定します。 </li></ol> LMAから5.ディスマウント胚<ol><li>顕微鏡からチャンバーを含む胚を削除してください。慎重にアガロースのuから胚を削除鉗子を歌います。 </li><li>新しい滅菌プラスチックペトリ皿にまたは1x E3および0.2 mMのPTUを含む滅菌6ウェルプレートに胚を移します。開発の所望の段階まで、28℃で胚をインキュベートします。 </li></ol> 6. Photoconverted PSmOrangeタンパク質発現細胞の運命を分析<ol><li>ポイント3.3と3.4で説明したように、胚を再埋め込みます。 </li><li>共焦点顕微鏡下でサンプルを置き、関心のGFPトランスジェニック構造（488 nm）の中でphotoconverted細胞（640 nm）を識別するための試料をスキャンします。 </li><li> 488 nmの、561 nmおよびシーケンシャルモード（ラインモード1-&gt; 4）で640 nmのレーザーを使用して、関心の構造をカバーzスタックを取得します。 1.0と2.0ミクロンの間のzステップを修正しました。ライン平均及び走査周波数は、画質を最適化するために使用することができます。 </li><li>これは共発現GFPとphotoconvertedタンパク質、細胞を同定するために、次のいずれかの方法を使用します。 <ol><li>カスタム作られた自動フィジーイメージJマクロ3 <ol><li>コンボリューション「GaussianBlur」プラグインを使用して、元のスタック（→プロセス→GaussianBlur→フィルター）と「画像電卓」プラグイン（→プロセス→イメージ電卓）を使用して、元からのスムーズなスタックを引きます。関心の構造を視覚化し、分析のための計算時間を短縮するために、この手順を使用します。 </li><li> photoconvertedセルを強調表示するために、緑と遠赤チャンネルに特定のしきい値を適用します（→イメージ→→しきい値を調整します）。適切な設定で、閾値領域を検出するために、「粒子の分析」ツールを使用します（→粒子を分析→分析）。 </li><li> 「イメージ電卓」プラグインを開き、黄色（→プロセス→イメージ電卓）に緑と遠赤​​のチャンネルに重複の関心領域を表示します。 </li></ol></li><li> 3Dデータ評価のための顕微鏡イメージング・ソフトウェア<ol><li>スタックを表示しますショーのボリュームビューオプション（→3Dビジュアライゼーションメニュー→表示ボリュームビュー）を使用して3D。 、緑、赤と遠赤色のチャンネルを選択明るさとコントラストを調整し、photoconvertedエリア（ 図1）を強調するために3Dスタックをトリミングするグラフィックインターフェースを使用してください。 注：データを分析するための同様の方法は、画像解析のための一般的なソフトウェアのほとんどで利用可能です。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

蛍光レポーターを有するトランスジェニック胚は、胚の発達を理解するために根本的に貢献しています。しかし、特定の構造の特定の視覚化を容易にするプロモーターに必須の必要性が依然として存在します。彼らの不在下では、研究者が興味のある構造の起源と発展について調べるために、このような蛍光タンパク質の光変換などの技術に依存しています。これにより、その発達に関与する分子機構を同定するための重要な前提条件です。ゼブラフィッシュ分野における技術の進歩は、現在のアプローチ14,15にCRISPR-Cas9媒介ノックを使用して、インスタンスのためのトランスジェニック系統、photoconvertibleタンパク質でFPを交換することができます。しかし、この技術は、比較的時間がかかり、常に成功していません。これとは対照的に、普遍的にGFPにH2B-PSmOrangeを表明し、おそらく他のトランスジェニック背景の適用は、EMを介して細胞を追跡する単純明快な技術でありますbryonic開発。 例えば、ゼブラフィッシュ腹habenulaの複数形の起源、脊椎動物の背側間脳内の保存された神経伝導系の一部は、最近ので、その開発の根底にある遺伝カスケードが明らかにされなくなるまでとらえどころのないされています。移動する細胞を追跡するためにPSmOrangeシステムと長期的タイムラプス解析を用いて、我々は左と骨端の右隣発信背側手綱核とは異なり、腹側手綱ニューロンは視床3に、この領域の後方を開発することを示すことができました。この知識は、私たちはその後、腹側手綱ニューロンの開発のために下流の遺伝子TCF7L2のシグナリング標準的なWntの重要な機能を識別することができました。 photoconvertible PSmOrangeシステムの適用は、迅速、簡単であり、胚が照明の前に強力なタンパク質発現のために選択することができる光活性化タンパク質上の利点を有します。合成はmRH2B-PSmOrangeためのNAをコードは遍在全ての核オレンジ蛍光タンパク質を発現するGFPトランスジェニック胚に注入されます。私たちは、注入時に任意の副作用を発生していないと、タンパク質は、少なくとも96時間安定です。タンパク質は、次いで、488nmの励起レーザーを用いてROIにおけるGFPトランスジェニック細胞においてphotoconvertedされ、胚は、その後、約48時間以内に細胞を含む現在遠赤色蛍光タンパク質について分析することができます。条件が胚および標的組織の発達段階に応じて変えることができるように、それは成功した光変換を監視することが重要です。顕微鏡イメージングソフトウェアは、光変換前後の各チャネル（赤、緑、遠赤）の画像を取得します。光変換効率は、光変換前後の異なるチャネル間のROIの平均強度の蛍光を測定評価することができます。何の遠赤色蛍光を光電広告直後に検出されない場合光変換のditionalラウンドが適用されなければなりません。 GFP漂白は、光変換後に一般的です。しかし、トランスジェニック蛍光タンパク質の連続的な翻訳は、約2時間以内に、この問題を克服します。 カスタムはphotoconvertedタンパク質を共発現する細胞の同定を容易にするために、フィジーImageJのマクロを作って、トランスジェニックGFPは3可能です。 H2B-PSmOrangeを発現する安定なトランスジェニック系統の将来の確立はさらに、この手順を簡素化します。また、組織再生などの分野を検索するには魅力的な価値を持っている可能性がある4日後に受精、後に発生事象の分析を容易にします。また、母性発現しPSmOrangeトランスジェニックとタイムラプスイメージング16の組み合わせは、単一細胞レベルでの原腸陥入前に出発細胞遊走のイベントを調査するための強力なツールとなります。さらに、アプリケーションがf、とH2B核タグの交換を含んでいてもよいですまたは例えば、発生中の胚において細胞膜及び潜在的に軸索を可視化するGAP43。 この技術の1つの制限は、接合体タンパク質のみが原腸形成後に発現され始めるので、原腸形成過程の分析には適用されないということです。それはまた、胚の深い位置する細胞内タンパク質をphotoconvertすることはかなり困難であることを考慮しなければなりません。光変換設定は、高いレーザパワーとして適合しなければならず、光変換のために必要な比較的長い刺激時間は注意深い監視を必要とする組織の損傷をもたらすことができます。

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.
Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.
To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

<table><tbody><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Original H2B-PSmOrange Plasmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>The plasmid described in the paper is available in the Carl lab</td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>No Number</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &amp;lambda; 20X air objective&amp;nbsp;</td><td>Nikon GmbH Germany</td><td>No Number</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td><td>No Number</td><td></td></tr></tbody></table>

tracking cells in gfp-transgenic zebrafish using the photoconvertible psmorange system

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

図1は、PSmOrange光変換システムの一例を示す図です。松果体複合体は、脊椎動物の背側間脳に保存された構造です。多くの他の脊椎動物のように、この複合体は、間脳の中心部にある松果体器官および左側parapineal細胞で構成されています。エレガントが、時間のかかるアンケージング実験はparapineal細胞が松果体臓器13の前部に由来することを示しました。 Tgの（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚は、松果体とparapineal両方の細胞は、開発中に標識されています。 PSmOrangeシステムの適合性を評価するために、我々は報告松果体複雑な開発を再現するためにこれらの胚を使用していました。 PSmOrange、H2B-PSmOrangeの核型をコードする260のPG mRNAは、すべての細胞核においてタンパク質を発現させるために1細胞期の二重トランスジェニック胚に注入しました。注入された胚を24時間後fertilizatまで28℃でインキュベートしました。イオン（HPF）、GFPと強いH2B-PSmOrangeの発現のために選択し、底部に向かって指向の背側でのチャンバーカバースリップシステムでLMAに埋め込まれました。試料は、顕微鏡イメージングソフトウェアによって制御され、488 nmで、561 nmおよび640 nmのレーザーと光変換およびトラッキングのための20X空気目的を備えた倒立共焦点レーザー走査顕微鏡下に置きました。松果体の前部にある二つの細胞クラスターはphotoconverted、すぐに（ 図1A - F）画像化しました。しかしない561 nmレーザー（オレンジ/赤- 図1B）と、 - photoconverted細胞（ 図1C遠赤色）640 nmのレーザーを用いて可視化することができました。これらの細胞におけるGFPの発現は、最初にも起因する（ 図1A、1D、1F） を光退色に減少しました。 52 HPFでGFPおよびH2B-PSmOrangeはphotoconverted H2B-PSmOrangeタンパク質を発現する細胞において検出された（ 図 </strong&gt; 1A &#39; - F&#39;）。確かに、これらの細胞の数は、脳の左側にparapinealを形成し（ 図1A中の矢頭&#39; - F&#39;）。この結果は、parapineal細胞起源に関する以前の報告と一致していると生きている脊椎動物の胚におけるPSmOrange技術の適用可能性を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53604/53604fig1.jpg" /> 。ゼブラフィッシュの胚を生きているにPSmOrange光変換システムを使用してparapineal細胞起源の識別図1（A - F &#39;）TGの背側間脳に焦点を当ててトップに前方と背側のビュー（foxD3：GFP）; TG（FLH：GFP）トランスジェニック胚での松果体（P）とparapineal細胞（PP）ハイライト（Aを - F）26 HPF直後光電と（A &#39; - F＆＃<html> 39;）26時間後に52 HPFで。胚は、mRNAは、H2B-PSmOrangeをコードして注射しました。写真は表示します 3D再構成。 （A、A &#39;）トランスジェニックGFP、（B、B&#39;）の発現がない光電（遠赤チャネル）後H2B-PSmOrange（赤チャネル）および（C、C &#39;）を変換します。白点線の円は、赤/オレンジ色の蛍光を欠いている光変換の面積を、強調表示します。 （D、D &#39;）すべての3つのチャネルのマージ（緑、遠赤、赤）、（E、E&#39;）赤と遠赤チャネルおよび（F、F &#39;）緑と遠赤チャンネル。 （A&#39;-F &#39;）白矢じりは緑、橙/赤と遠赤色蛍光を示しparapineal細胞の位置を強調表示します。 （AF &#39;）スケールバーは、各画像の右下隅に表示されます。PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 段階 </td><td> ループの数 </td><td> アクティブレーザー </td></tr><tr><td>集録</td><td> 1サイクル</td><td> 488 nmで、561 nmで、640 nmの</td></tr><tr><td>刺激</td><td> 15 30サイクル</td><td> 488 nmの</td></tr><tr><td>成熟</td><td> 1分</td><td> ＃ </td></tr><tr><td>集録</td><td> 1サイクル</td><td> 488 nmで、561 nmで、640 nmの</td></tr></tbody></table> 表1：H2B-PSmOrange の光変換のための条件。

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Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K ビュー.  Heidelberg University. We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

ビデオ: Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

発生生物学

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

生物学

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

神経科学

Protein Phase Separation Assay: An Optogenetic Method for Mutant RNA-Binding Protein Phase Separation in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Source: Asakawa, K. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62932">Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a phase separation assay, wherein intracellular proteins comprising intrinsically disordered regions fused to a photosensitive oligomerization domain are induced via blue-light exposure to self-associate into membrane-less liquid-like condensates.

タンパク質相分離アッセイ:ゼブラフィッシュ幼生の脊髄運動ニューロンにおける変異型RNA結合タンパク質相分離のための光遺伝学的手法

Source: Asakawa, K. et al. Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...