The work was supported in part by the Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) and the Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. IMOP細胞における自己再生を維持<ol><li> DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリンおよび20 ng / mlのbFGF：培養培地をiMOP準備します。無菌の試薬を用いてiMOP培養培地50mlをしてください。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。 <ol><li>解凍50X B27サプリメント、37℃の水浴中で5分間、フィルター滅菌し100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 RTで100μg/ mlのbFGFのアリコートを解凍します。 DMEM / F12には100μg/ mlのbFGFの1ミリリットル50X B27、10μLおよび100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。 </li></ol></li><li>培養iMOP細胞を60 mm組織培養皿内のメディアの3ミリリットルを使用してください。メディアの容量を倍にして、一日おきに培養物に新鮮な培地を追加します。 bFGFのその濃度が5 ng / mlで以下に低下しないことを確認してください。 <ol><li> 5の後、5％のCO 2継代細胞と37℃で培養iMOP細胞-培養7日以下の手順に記載されています。 15に転送する文化10 mlピペットチップを用いmLコニカル。 </li></ol></li><li> HBSS 50mlに0.5MのEDTA pH8.0の0.1mlの希釈してHBSS中1mMのEDTAを行います。プレ暖かい1mMのEDTA、37℃の水浴中でHBSSで作ら。 </li><li> 5分間200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 RTで。 10分 - 重力沈降のために、5、37℃のインキュベーターで培養液を含む15ミリリットルの円錐を配置します。その時間の後、otospheresを観察し、15 mLコニカルの底に集めます。 注：過度の遠心力は、細胞の損傷を引き起こす可能性があります。 </li><li>慎重に吸引細胞ペレットを乱すことなく、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。細胞ペレットに予め温めておいた1mMのEDTAのHBSS溶液0.5mlを追加します。 P1000ピペットを使用して、静かにアップピペット上下2から3回。 37℃の円錐形を置き、単一細胞に解離を促進するために、&lt;5分間インキュベートします。 </li><li>穏やかotospheresが解離しているかどうかを決定するために細胞溶液を渦。おと場合球は、細胞が解離され、円錐形の底に沈殿します。インキュベーションの時間が異なる場合があります。 注：EDTAで長時間のインキュベーションは、過剰な細胞死をもたらすでしょう。 </li><li> 37°Cから細胞を取り出し、EDTAを中和し、希釈するために、メディアの2ミリリットルを追加します。室温で5分間、200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。吸引除去が出て2ミリリットル吸引ピペットを用いて、細胞を洗浄するために1×PBSの5ミリリットルを追加し、EDTAを希釈しました。 </li><li>室温で5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、2ミリリットル吸引ピペットを用いて1×PBSを吸引除去します。 3回 - 優しくピペッティングと2ダウンによってiMOP培養培地0.5mlにP1000ピペットを用いて細胞を再懸濁します。 </li><li>適切なカセット28とマイクロ流体パーティクルカウンターを用いて細胞を数えます。 iMOP細胞のコンフルエントプレートが〜6 X10 6個の細胞が含まれています。細胞1希釈：メディアで100を計数するためのカセットに細胞溶液75μlのを追加します。プレートiMOP cultu 6cmの皿で1×10 6個の細胞メディア再（〜1：10希釈）。通路iMOPsごとに5から7日間。 注：大otospheresを形成するか、または組織培養皿の底に付着した細胞は、分化します。培養がコンフルエントを超えている場合に細胞も死んでしまいます。 </li></ol> 2.凍結融解IMOP細胞<ol><li>解凍と凍結前の細胞に4℃の解決策を平衡化することにより合成凍結媒体を準備します。 </li><li> iMOP細胞のコンフルエントに6cm皿から細胞を収集します。 15ミリリットルコニカルに- （8×10 6個の細胞 〜6）10 mlピペットと転送細胞を使用してください。 </li><li>室温で5分間、200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 otospheresが小さい場合、細胞は重力沈降により決済することはありません。オプション：総細胞数を決定するためにステップ1.9を用いて細胞を数えます。 </li><li>背後に緩い細胞ペレットを残しながら吸引し、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。 </li><li> CEを再懸濁し、合成凍結メディアの0.25ミリリットルを追加約5×10 5〜6×10 3細胞/ mlの密度でLLS。ゆっくりP1000ピペットで細胞をピペット。先端を濾過した1 mlのP1000ピペットを用いて、低温バイアルに細胞懸濁液を転送します。 </li><li>アルコールフリーの冷凍コンテナにバイアルを置き、温度に到達するまで-80℃〜毎分温度1℃を減らすために-80℃で凍結コンテナを配置します。 </li><li>細胞の長期保存のために、液体窒素貯蔵タンクの気相へのバイアルを移します。培養のための細胞を解凍するには、-80℃で凍結した細胞を含む低温バイアルを平衡化。 </li><li> 37℃の水槽で予備iMOP暖かい培養培地。 </li><li> 37℃の水浴中で、バイアルの底に旋回することによって、迅速凍結バイアルを解凍します。最後の氷の結晶が消えたら、解凍した細胞にiMOP予め温めておいた培地の1ミリリットルを追加します。転送15mLの円錐形への細胞とiMOP培養培地の追加の4ミリリットルを追加</li><li> 15ミリリットルの共同スピン5分間nical。 200×gで使用済み培地を吸引し、。 6 10cmディッシュにiMOP培地プレート細胞の2ml中の細胞を再懸濁。拡張のため、5％CO 2で37℃で培養物をインキュベートします。 </li></ol> 3.感覚上皮にIMOP細胞を分化<ol><li> DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリン：iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを準備します。 iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを行います。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。解凍50XのB27サプリメントと5分間100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 37℃の水浴中で。 1ミリリットル50X B27およびDMEM / F12に100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。 </li><li> 、収穫解離、再懸濁し、細胞をカウントする手順1.4から1.9を繰り返します</li><li> 3日目の培地を使用してiMOPで6センチディッシュでプレート1×10 6個の細胞 。 0日目に、転送培養を15mlコニカルに10 mlのピ​​ペットを用いて。 OTOの収集ステップ1.6で述べたように、重力沈降による球。吸引除去が出ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごし、円錐形の底にotospheresを残します。 </li><li>そっと感覚上皮の分化培地2mlに追加します。大口径10ミリリットルピペットを用いてを6cmディッシュに転送otospheres。 注：過酷なピペッティングから機械的せん断がotospheresから細胞を解離することができます。 </li><li>一日おきに培養物に新鮮な感覚上皮分化培地2 mlを加え。必要に応じて、細胞は、重力沈降によって収集することができ、メディアを交換。 </li><li>円錐15ミリリットルに転送しotospheresが述べたようにピペットを吸引2ミリリットルを使用して、ステップ1.6.Aspirateで使用済み培地を沈降し、邪魔されずotospheresを残すようにすることによって10日目でotospheresを収集します。 </li><li>室温で15分間、1×PBS中の4％ホルムアルデヒド中でインキュベートすることによりotospheresを修正。 、ホルムアルデヒド溶液を除去し、洗浄緩衝液（1×PBS、0.1％トリトンX-10を含有するotospheres洗います0）をブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、10％正常ヤギ血清で1時間、0.1％トリトンX-100）を含みます。 <ol><li>バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBSで洗浄サンプルは、27の免疫染色を、0.1％トリトンX-100の対象にotosphereを含みます。 P1000ピペットを用いてガラススライド上にメディアをマウントに1×PBSに転送otospheresと場所のotospheres。サンプルの上にカバースリップを置き、取り付けメディアは4℃で乾燥させます。 </li></ol></li><li> 16ビットのCCDカメラを搭載した倒立顕微鏡のセットアップおよび20X 0.75空気または40X 1.3 NA油浸対物レンズのいずれかを使用して、エピ蛍光画像を取得します。ブルー（377±25 nmで/ 447±30 nm）で、グリーン（475±25 nmで/ 540±25 nm）の赤（562±20nmで/ 625：記載されている（励起および発光）の波長を使用して、異なるカラーチャネルからの蛍光を収集20nmの）及び赤外線（628±20nmの/および692±20±NM）。 </li></ol> 4.アッセイするEDU設立<ol><li> 3日目に、プレート6 10cmディッシュ中、1×10 6 iMOP細胞。三日後0日、収穫、解離、再懸濁し、ステップ1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。 </li><li>プレートiMOP培養培地中2.5×10 5個の細胞と6ウェル皿の異なるウェルにおける感覚上皮の分化培地中の5×10 5細胞 。 </li><li> EDU取り込みアッセイを使用して、3日目にEDU取り込みによってS期の細胞の割合を決定します<ol><li>培地に1μMのEDUの最終濃度を得るためにiMOP培養物に直接EDUの株式を追加します。 </li><li> 2時間iMOP培養でEDUをインキュベートし、5％CO 2で37℃でインキュベートします。収穫は、解離し、収集した細胞は、手順1.4から1.9を繰り返します。 15分間、1X PBS中4％ホルムアルデヒド中で加えます。室温で細胞を固定します。室温で5分間、200×gで遠心分離により細胞を回収。ホルムアルデヒド溶液とproperlを削除yは廃棄してください。 </li><li>ラベルヘキストでの細胞の核とは、製造業者のプロトコルに従って、緑色蛍光色素アジドとEDUを組み込みました。 注：すべての洗浄は1×PBS、二回1×PBSで3％BSAおよび0.1％のTween 20洗浄細胞を用いて行われます。 </li><li>退色防止試薬を用いてスライド上のマウント細胞およびサンプルの上に1.5カバーガラスを配置します。落射蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞の蛍光画像を取得します。 </li></ol></li></ol> 5. IMOP由来ニューロンの区別<ol><li>神経基本培地、1X B27サプリメント、2mMのL-グルタミン：神経分化培地50mlのを行います。 5分間37℃の水浴中で50X B27と200mMのL-グルタミンの解凍ボトル。神経基本培地48.5 mlに1ミリリットル50X B27 0.5mlの200mMのL-グルタミンを追加します。 </li><li>滅菌10cmプレートでラウンド12ミリメートル1.5カバーガラスを配置し、滅菌し、カバーガラスをきれいにするためにプレートに70％エタノールを加えることにより、コートカバーガラス。 </li><li>静かな入り江を攪拌彼らはエタノールでカバーされていることを確認するrslips。 RTで10分間プレートを残します。残りのエタノールを洗い流すために、滅菌1X PBSでカバーグラスを3回すすいでください。残りの1×PBSを洗い流すための滅菌H 2 Oで一回カバースリップをすすぎます。 </li><li>ピペットを吸引2ミリリットルを使用して、H 2 Oを吸引除去し、カバーガラスを乾燥させ。 15分間組織培養フード中でUV光にカバースリップを公開。すぐに使用しない場合、Storeは、無菌環境でカバースリップ。 </li><li> 24ウェルディッシュの各ウェルに1 12ミリメートルラウンドカバーガラスを配置します。カバーガラスは、ウェルの底に平らにすることを確実にするために静かにプレートを振ります。 </li><li> 2ミリグラム/ RTでmlのポリ-D-リシンストック溶液を解凍し、1×PBS中10μg/ mlのポリ-D-リジン濃度に希釈します。 10 UG / mlのポリ-D-リジン0.25mlのウェルに追加します。 1時間37℃のインキュベーター内でプレートを残します。 </li><li>滅菌1×PBSでウェルを3回洗浄します。室温で10 mg / mlのラミニンストック溶液を、融解を10μg/ mの希釈1×PBSでリットル。 24マルチウェルディッシュの1ウェルに作業溶液を10μg/ mlのラミニンの0.25ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターでプレートをインキュベートします。 2ミリリットル吸引ピペットを用いてラミニン液を吸引します。 </li><li> P1000ピペットを用いて1×PBS 1 mlに添加して、ピペットを吸引2mlで吸引することにより、1×PBSを除去することにより、カバーガラスを1×PBSで3回洗浄します。細胞は、めっきされる準備が整うまで、ウェル中の最後の洗浄から1×PBSを残します。解離と3日目に6センチの皿に段階的に1.4-1.9.Plate 1×10 6個の細胞を、細胞をカウント、収穫により神経分化を開始します。 </li><li> 0日、収穫には、解離して1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。 24マルチウェルディッシュで1.5×10 0.5ミリリットルに5 iMOP細胞ウェルあたり予め温め神経分化メディア-シード1×10 5。吸引し、一日おきに培養物に予熱した神経分化培地を追加します。 </li><li> 15分間4％ホルムアルデヒドでiMOP由来の神経細胞を固定してください。 AT RT 7日目削除ホルムアルデヒド溶液に、洗浄緩衝液でiMOP由来の神経細胞を洗浄し、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、0.1％トリトンX-100を含む）（1×PBS、10％正常ヤギ血清および0.1％トリトンX-100） 1時間。 <ol><li>バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBS、0.1％トリトンX-100を被験者の細胞を含有する洗浄サンプル27を免疫染色します。マウントメディアに配置する前に、1×PBSでカバーガラスを洗ってください。マウントメディアはステップ3.8に記載されているエピ蛍光画像を取得する前に、4℃で乾燥することができます。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

IMOP培養のモニタリング 自己再生を維持し、新規iMOP細胞株の分化を促進するためのプロトコルが記載されており、付加的なめっきフォーマット（表1）に含まれています。日常的拡大とiMOP細胞の分化に役立ついくつかの重要なステップが記載されています。多能性幹細胞培養と同様に、iMOP細胞は、理論的に無限の寿命を有します。細胞株が適切に維持されることを保証するために、iMOP培養物を定期的に細胞の生存、自己複製と分化能のために監視されます。解離後の細胞の生存率を決定するために、我々は、トリパンブルー染色を使用しています。一般的には、細胞の70％以上が解離した後に生存しています。 iMOP細胞内で自己複製を監視するには、C-MycおよびSox2の抗体を用いて免疫染色することは行われています。増殖培養条件の下では、iMOP細胞は〜18時間の倍加時間を持っています。行うか、自己再生マーカーの発現の変化時間をubling変更された自己複製の可能性の指標です。 iMOP細胞、感覚上皮細胞またはニューロンのための早期マーカーの細胞周期の出口及び発現の分化能を監視するための細胞の分化能を評価するために使用されます。 iMOP細胞は、上記の規準のいずれかに合格しない場合は、培養を終了することが賢明であろう。 IMOPの文化に影響を与える変数 iMOP細胞を培養中で1つの重要なステップは、自己再生を促進するために、培養物中のbFGFの活性濃度を維持することです。セル29,30を培養する際のbFGFは伝え37℃で非常に不安定です。培養物の増殖を有意に起因したbFGFの不安定性に自発的分化によって影響を受けることができます。現在のプロトコルでは、新鮮な培地は、常には5ng / mlの上記のbFGFレベルを維持するために、培養物に供給されます。からの放出制御を使用したbFGFレベルの安定化グリコール酸および乳酸のポリエステルマイクロスフェアは、媒体31におけるbFGFの安定したレベルを維持するために必要なメディアの変更の頻度を減らすことができます。着実に解放可能bFGFの添加は、しばしばiMOP培養中のbFGFのレベルを維持するためにメディアを追加する必要性を減少させます。 iMOP細胞の生存率を維持するために別の重要なステップは、解離試薬および機械的せん断への暴露を制限することです。現在のプロトコルでは、解離は、1mMのEDTAとのインキュベーションによって達成されます。活発なピペット操作によって引き起こされる過度の機械的せん断を低減し、細胞の生存率を向上させるのに役立ちますiMOP細胞を継代する際、複数の遠心分離工程を制限し、EDTAで過剰なインキュベーション時間の抑制。これらのステップに与えられた注意が効果的に文化の拡張中に多数の細胞の生存率を維持することができます。 iMOP細胞のルーチン培養の間、細胞を解離させるためのいくつかの方法を試験しました。 MechanピペッティングからiCalのせん断はotospheresを解離するために使用することができるが、均一にまたは一貫して単一細胞を生成しません。 iMOP細胞の細胞解離のための市販の試薬を使用すると、効果的にotospheresから単一細胞を生成することができますが、これらの試薬はotospheresを改革し、処理表面に付着した細胞の接着性に影響を与えます。市販の試薬を使用するために、複数回の洗浄は、分化プロトコールを用いる前に、解離試薬を除去するために必要でした。 現在の分化プロトコルにおいて、両方の感覚上皮及び神経分化条件は、単一細胞または死細胞の塊の形で観察された細胞死をもたらしました。アポトーシス細胞死は 、インビトロで長期培養中に適切な分化または生存の手がかりが不足しているためである可能性があります。 B27サプリメントに含まれる両方の分化条件は、細胞の生存を促進します。 B27 supplemが、ENTは、初代海馬ニューロン32の生存を促進することが示されている、それはiMOP細胞の生存を促進するのに十分ではないかもしれません。このようなROCK阻害剤としての化合物の添加は、維持し、日常的培養中および in vitro 分化におけるiMOP細胞の生存率を高めることがあります。 ROCK阻害剤は、広範囲の分化33に影響を与えることなく、無血清培養物中の細胞の生存を促進するために多能性幹細胞の培養に使用されています。培地にROCK阻害剤の添加はiMOP細胞の分化能に影響を与えることなく、長い分化プロトコル中の細胞の生存率を高めることができます。増加した細胞生存率を効率的に成熟有毛細胞またはSGNSを多数生成するためのプロトコルの開発を可能にします。 IMOP分化の初期マーカーとして増加CDKN1B式 初期の蝸牛開発中に、セルの初期イベントサイクル出口が有毛細胞、支持細胞とSGNS 34分化に先行します。神経前駆細胞の有糸分裂ターミナルは波ベースから始まり、蝸牛35の頂部に向かって進んで広がります。反対の勾配では、有毛細胞および支持細胞を生じさせるprosensory前駆細胞の有糸分裂の端末は、蝸牛34,36のベースに頂点から進行します。 CDKN1Bの時間的発現が有糸分裂後の状態によく相関するが、それは最も可能性の高い開発蝸牛における細胞周期の出口を促進する唯一の要因ではありません。これを支持する、CDKN1B変異動物は、まだ分裂後毛細胞37を開発することができます。その代わりに、CDKN1Bは、分化の開始をマークするために早期の指標として用いることができます。無誘導iMOP分化培養において、分化の早期マーカーは明らかな形態学的特徴が観察される前に、分化の初期段階を促進するためのプロトコルの開発を支援します。&lt;/ P&gt; 耳の開発と同様に、サイクル出口はiMOP細胞における増加CDKN1Bレベルで差別化し、結果を開始します。 iMOP細胞増殖において、CDKN1Bだけ低いレベルの発現を観察することができます。かかるCDKN1A（のp21 CIP）のような他のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はiMOP細胞において正常な細胞周期進行に関与し得ます。感覚上皮およびiMOP細胞の神経分化の間に、単一の細胞の定量的分析はiMOP培養（ 図6A、C）を微分でCDKN1Bの増加発現と細胞のサブセットを明らかにしました。これらの細胞におけるCDKN1Bの発現は、分化を受けiMOP細胞の指標です。 細胞運命の決意を研究するための携帯電話のプラットフォームとしてIMOP細胞 iMOP細胞は、インビトロで異なる耳の系統への前駆状態から遷移することができるので、耳の細胞の運命を調べるために利用することができます決定。現在、説明されたプロトコルは、様々な耳の細胞型を生成するために、無誘導分化手順を使用します。 iMOPシステムは、セルとSGN系統をサポートする、成熟した有毛細胞に向けてiMOP細胞を導く、生物活性分子、化合物と定義された遺伝子の追加が可能になります。 iMOP携帯プラットフォームの1つの用途は、分化を促進する候補トランスクリプション要因（TF）をテストすることです。キーTFの発現は、有毛細胞または神経細胞の分化を駆動するために使用することができます。確立されたマーカーまたは有毛細胞とSGNSの形態学的特徴とともにCDKN1Bの発現が異なる耳の系統38,39への候補TFの寄与を決定するために用いることができます。 などのAtoh1のような候補のTFは、有毛細胞の開発のために不可欠であり、損傷を受けた蝸牛40,41内有毛細胞の分化を促進するために再利用されています。 iMOP細胞へのAtoh1の導入は、有毛細胞の分化を促進することができます。 developiで蝸牛ngの、Ngn1とNeuroD1の両方は 、インビボ42-44 で適切SGN分化に必要とされます。 iMOP細胞内Ngn1またはNeuroD1の発現は、SGNの分化を促進することができます。これらの実験は、TFを個別にまたは組み合わせでの発現は、ニューロン45〜48に、線維芽細胞または多能性幹細胞に変換することができます生成する誘導された神経細胞（IN）に似ています。通常、有毛細胞またはSGNSの開発中に発現されているTFの導入は、有毛細胞またはSGN系譜に向けてiMOP細胞を誘導するための良い戦略です。 iMOP由来の有毛細胞とSGNS多数の分化を促進する条件は、疾患モデル、げっ歯類における労働集約型のテストが開始される前に、迅速かつコスト効率良く行うことができる小分子のスクリーニングおよび毒性試験のための堅牢な携帯プラットフォームを提供します。記載されたプロトコルは、複数のに利用することができる単純で汎用性の高いシステムを提供します耳の前駆細胞の分化をtudyingおよび大規模の実験に適しています。

The organs of the inner ear, the cochlea, utricle, saccule and three semicircular canals, mediate the ability to hear and balance. Within the cochlea, hair cells convert sounds into electrical signals that are relayed to the spiral ganglion neurons (SGN). The SGNs fire action potentials to propagate neural signals through the auditory circuit. Genetic mutations, ototoxic drugs and exposure to loud sounds contribute to hair cell and SGN death that result in hearing loss1-4. Once lost, these cells are not replaced. Use of iPSC and ESC to generate nascent hair cells or SGNs holds great promise for inner ear cell replacement therapies5-8. A flurry of progress has shown that pluripotent stem cells and inner ear derived progenitors can differentiate into hair cells and SGNs at various stages of maturity. Mammalian embryonic stem cells (ESC) and induced pluripotent stem cells (iPSC) can be used to generate functional hair cells and SGNs9-11. Stem cells and progenitor cells derived from the mammalian inner ear have also been shown to form hair cells and neurons with properties of their in vivo cellular counterparts12-16. 
Use of iPSC or ESC-derived otic progenitors to replace lost hair cells and SGNs requires efficient differentiation. Improper differentiation or continued proliferation of engrafted stem-derived progenitors in the inner ear can exacerbate inner ear function and pose a tumorigenic risk such as teratomas formation in the inner ear17. There is a clear need for developing culture conditions and understanding differentiation of otic progenitors. One strategy in developing these methods is to recapitulate cell fate decisions made by neurosensory progenitors during inner ear development. Protocols that prevent proliferation and direct otic progenitors into hair cells or SGNs will help improve safety as well as efficacy of replacement therapies. 
During development, the inner ear begins with the thickening of surface ectoderm in a restricted region between rhombomeres 5 and 6 to become the otic placode. As the otic placode invaginates to form an otic cup, a collection of cells in the anterior region of the otic cup gives rise to the neural-sensory-competent domain (NSD), which contains precursors of hair cells and neurons of the inner ear18. Fate mapping studies from mouse, chicken and zebrafish developing inner ear suggest multiple populations of neurosensory progenitors that give rise to the sensory hair cells, surrounding supporting cells and otic neurons19-22. The high mobility group transcription factor, Sox2, has been implicated in sensory cell specification and used as a marker for inner ear progenitors23,24. Hypomorphic mutations that decrease Sox2 expression levels in the inner ear result in the loss of the hair cells, supporting cells and SGNs in the cochlea25,26. 
To study otic progenitor cells undergoing cell fate decisions, a fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line from Sox2 expressing cochlear progenitors was previously established. iMOP cells were originally derived from embryonic E12.5-13.5 cochlea and infected with a c-Myc retrovirus27. iMOP cells can continually proliferate as colony forming cells known as otospheres and have the capacity to differentiate into hair cells, supporting cells and SGNs27. Understanding the capacity of iMOP cells to differentiate into distinct otic lineages allows application of these findings to efficiently generate iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. Efficient differentiation protocols will open new avenues for cell replacement therapies of inner ear diseases that are recalcitrant to conventional treatments. A crucial issue in generating otic cells by in vitro cell culture is to have differentiation markers that help determine if cells are undergoing differentiating. Cdkn1b (p27KIP) has been extensively used as an early marker for differentiation in developing inner ear, however, expression of Cdkn1b in iMOP cells and how it correlates to differentiation has not been addressed. In this study, the current culture conditions and how Cdkn1b expression correlates to other markers of iMOP differentiation are described.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers</td>
			<td style="width:196px;">BioCision</td>
			<td style="width:145px;">BCS-405</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Cryogenic Vials (2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td style="width:145px;">430654</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm)</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:145px;">72230-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">11320-082</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">21103</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">10010-023</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">B27 Supplement (50X) Serum Free</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">17504-044</td>
			<td style="width:280px;">Stored as 1 ml aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">L-Glutamine(200 mM)&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">25030-081</td>
			<td style="width:280px;">Stored as 5 ml aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Natural Mouse Laminin</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">23017-015</td>
			<td style="width:280px;">Stored as 1 mg/ml aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">C10337</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Synth-A-Freeze Cryopreservation Media</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">A12542-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Prolong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">47743-736</td>
			<td style="width:280px;">Stored as 10 mg/ml 100 &#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Moxi Z Mini Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:196px;">Orflo&#160;</td>
			<td style="width:145px;">MXZ001</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Moxi Z Cassette Type S</td>
			<td style="width:196px;">Orflo&#160;</td>
			<td style="width:145px;">MXC002</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:455px;">Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF)</td>
			<td style="width:196px;">Peprotech</td>
			<td style="width:145px;">450-33</td>
			<td style="width:280px;">Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:455px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">P7886</td>
			<td style="width:280px;">Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 &#181;l aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:455px;">Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP2648-1</td>
			<td style="width:280px;">Resuspended in 10mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367811D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1367811E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Tissue Culture Treated Biolite 24 -Well Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">130188</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Tissue Culture Treated Biolite 6 -Well Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">130184&#160;</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">Tissue Culture Treated 6 cm Dish</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">130181&#160;</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22&#956;m</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">TipOne filter pipet tips 0.1-10 ul elongated filter tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">TipOne filter pipet tips 1-20 ul filter tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">TipOne filter pipet tips 1-200 ul&#160; filter tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">TipOne filter pipet tips 101-1000 ul filter tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:455px;">50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initiating differentiation in immortalized multipotent otic progenitor cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

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Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

initiating-differentiation-immortalized-multipotent-otic-progenitor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.4K ビュー.  Rutgers University. The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...