Name: a quick and efficient method for the purification of endoderm cells generated from human embryonic stem cells
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
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ジャスミンKresseの巧みな技術支援を深く感謝されています。

胚体内胚葉に向けたヒトESCの1分化<ol><li> 37℃のインキュベーター中でヒト胚性幹細胞（ESC）を育成し、5％CO 2。 </li><li>コー​​ト基底膜マトリックス1mlの新たな6ウェル細胞培養プレート、室温で少なくとも30分間培養ウェアインキュベートします。具体的な詳細については、各メーカーの指示に回してください。 </li><li>培養したヒトESCは、低倍率（ 例えば、4X）を使用して、顕微鏡下で80％-90％の密集度に達していることを確認してください。滅菌ガラスパスツールピペットで培地をオフに吸引することにより空洞から培地を吸引除去します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1回細胞を洗浄します。このために、そっと各ウェルに2mlのPBSを追加し、プレートを振盪し、死細胞及び細胞破片を除去するために溶液を吸います。 </li><li>細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。 37°C ANで細胞をインキュベートD 5％CO 2の細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで。 注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。材料の項で述べた無酵素継代溶液について、インキュベーション時間はおよそ7分です。 </li><li> 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのピペットチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、DMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。 </li><li> G×300で5分間、細胞を遠心。吸引した上清および10μMのRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤を含む5 mLのES細胞培養用培地中で細胞を再懸濁します。 </li><li>血球計数器を用いて顕微鏡下で細胞を計数150,000シード - 使用するES細胞系に応じて、6ウェルあたりまたは他のプレートレイアウト40万細胞。 CULを使用してください37℃のインキュベーター内で細胞を、5％CO 2、アポトーシスや文化を避けるために、10μMのROCK阻害剤を含むトゥーレ媒体。 </li><li>約24時間滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引を播種し、原始線条誘導培地の2ミリリットルを追加した後。 注：この培地は高度なRPMI-1640培地中で1％グルタミン、0.2％FCS、5μMCHIR-99021および50 ngの/ mlのアクチビンAの最終濃度が含まれています。一般的に、6ウェルプレートで培養に2mlの培地を使用します。 </li><li> 48時間播種した後、誘導培地を内胚葉する培地を交換してください。毎日培地交換を持つ別の48時間この培地中で細胞を培養。 注：この培地は、1％グルタミン、0.2％FCSおよび高度なRPMI-1640培地中で50 ngの/ mlのアクチビンAが含まれています。胚体内胚葉に向けてコミットされた細胞は、表面マーカーCXCR4を発現します。 CXCR4の染色は、DE-コミットした細胞の数を定量するために使用することができます。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。 CXCR4 +フローサイトメトリー分析のための胚体内胚葉細胞の染色<ol><li>収穫前の最後の24時間が、少なくとも1時間のために、細胞を培養培地に10μMのROCK阻害剤を追加します。 </li><li>コート基底膜マトリックスで再播種するために使用される細胞培養ウェア、qPCR分析または免疫蛍光染色のためにチャンバースライドのため、すなわち、12ウェルプレート。 RTで少なくとも30分間、プレートまたはスライドをインキュベートします。 </li><li>染色および/またはソートに使用分化した細胞のウェルから滅菌ガラスパスツールピペットで培地を吸引除去します。 </li><li>細胞クラスターの穏やかな解離のための無酵素継代液試薬の1ミリリットルを追加します。細胞は小さなクラスターに混乱の明確な兆候を示すまで37℃で細胞を、5％CO 2をインキュベートします。 注：インキュベーション時間は、用いる試薬によって異なります。 materiに記載された無酵素継代ソリューションのためのALS部は、インキュベーション時間はおよそ7分です。 </li><li> 1ミリリットルDMEM / F-12培地を加え、ピペッティングにより、1mlのチップを使用してダウン単一細胞に残った細胞凝集体を崩壊させます。表面から細胞を洗い流し、遠心チューブに細胞を転送するために使用します。すべてのセルを取得するには、/ FCS OワットDMEM / F-12培地の1ミリリットルで各ウェルを洗浄し、遠心チューブに培地を追加します。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 6ウェルプレートの3つのウェルからの細胞は、分化の3日後に10〜15×10 6個の細胞をもたらすはずです。 G×300で5分間、細胞を遠心。 注：得られた細胞の正確な数は、分化のために使用される多能性細胞株に依存するであろう。 </li><li>上清を吸引除去し、10μMのROCK阻害剤を含むPEBバッファーで細胞を再懸濁します。最大10 7個の細胞のために、この緩衝液100μlを使用してください。 stainiの日に10μMのROCK阻害剤を追加します。ngの。 （PEBバッファー+ RIと呼ばれる）すべてのダウンストリームアプリケーションのためにこのバッファを使用します。 注：PEBバッファーは、0.5％のBSA、PBS中2mMのEDTAが含まれています。より多くの細胞を染色する場合は、それに応じてバッファ量を調整します。 </li><li> 100μl中10 7個の細胞当たりCXCR4-APC抗体を10μlを追加し、これは、およそ1:10希釈を表します。 注：APC結合抗体の使用は必須ではありません。その代わりに、使用されるマイクロビーズに応じて置換され得ます。より多くの細胞を染色する場合に応じて、抗体の音量を調整します。 </li><li>軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファーで細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。 </li><li>滅菌ガラスパスツールピペットで上清を吸引除去し、10 7個の細胞あたり80μlのPEBに細胞ペレットを再懸濁し、20μlの抗APCマイクロビーズを追加します。 注意： </sより多くの細胞を染色する場合trong&gt;、それに応じてマイクロビーズ音量を調整します。 </li><li>軽く指でチューブを反転することにより混合し、15分間冷蔵庫で4℃でインキュベートします。 1〜2ミリリットルPEBバッファー+ RIを用いて細胞を再懸濁します。 G×300で5分間、細胞を遠心。バッファを吸引します。 500μlのPEBバッファー+ RIで再懸濁。 </li></ol> CXCR4 +細胞の3磁気分離<ol><li>製造指示に従って磁界の中型の磁気カラムを配置します。 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを事前にすすぎます。列に全体の細胞懸濁液を適用します。カラムに結合するようではないすべてのセルを通過する流れを収集します。 CXCR4 +細胞の最適な検索のために列を乱さないことを確認してください。 </li><li> 500μlのPEBバッファー+ RIでカラムを3回洗浄します。介して第1の流れを収集し、ステップ3.1から採取した細胞とそれを組み合わせます。磁場から磁気カラムを削除し、それを配置します適切なコレクションチューブ。 1ミリリットルPEBバッファー+ RIをカラムに追加します。細胞を溶出するためには、しっかりと列にプランジャーを押し下げます。 </li><li>オプション：別途サンプルを介してすべての流れを収集し、フローサイトメトリーを用いて、CXCR4 +細胞の数を分析するために20μlのそれぞれを使用しています。その数は、すべての洗浄工程で辞退すべきです。 注：少なくとも2×10 4生存し、ゲート細胞は、信頼性の高い結果を得るためにカウントする必要があります。 </li><li>繰り返しますが、ステップ3.1と新しいカラムを用いて、ステップ3.2からのサンプルを通る第一の流からサンプルを通る収集・フローで3.1から3.3の手順。前回のコラムを再使用しないでください。プランジ​​ャ空気を使用しているブロックをカラムに押し込まれます。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。分化の効率に応じて最大6×10 6細胞を、手順10 7個の細胞を使用する場合に第二のカラムを使用して最初にソートされ、他の1×10 6細胞であり得ます。 </李&gt; <li> 5分間、300×gで細胞を遠心。吸引した上清と滅菌ガラスパスツールピペットを持つと追加10μMのROCK阻害剤でステップ1.9から1ミリリットル胚葉誘導培地で細胞を再懸濁します。 </li><li>血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。 、適切な密度で細胞をシードすなわち、〜12ウェルプレートのウェルあたり4×10 5細胞（アプリ3.6 cm 2の表面）または〜8ウェルチャンバースライドのウェル当たり1.5×10 5個の細胞。 </li></ol> 4.オプション：精製胚体内胚葉人口の分析<ol><li>免疫蛍光染色のために、およそ24時間の胚体内胚葉（DE）および/または多能性マーカータンパク質のための4％パラホルムアルデヒドや汚れを接種した後、ステップ3.7から精製された細胞を固定。 注：一般的に使用されるDEマーカーはFOXA2及びSOX17を含む、一般的に使用される多能性マーカーは、OCT3 / 4、NANOGとSOX2 6、8を含みます。 </li><li>フォーR RT-qPCR分析、直接精製された細胞を採取するか、播種後24時間、全RNAを抽出し、抽出した全RNAサンプルからcDNAを逆転写。 DEおよび多能性マーカー遺伝子6、8の発現を分析するためにRT-qPCRの反応（三重）あたりを鋳型として10 ngのcDNAを使用してください。 注：一般的に使用されるマーカー遺伝子は、ステップ4.1に記載されています。サイクル条件は、融解曲線分析に続いて、95℃で5分間及び95℃で15秒間の40サイクル、60℃で1分間です。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

現在使用されて分化プロトコルはほとんど100％に分化した細胞になりません。まだ対処されなければならない理由のために、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗します。使用される分化プロトコルの効率とESCの傾向に応じて、残留​​多能性細胞の特定の数は、一般的にさえ胚体内胚葉への分化後に観察されているライン。これらの残留細胞は、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびmiRNA発現解析などの下流の微分またはさらなる分析を損なうおそれがあります。残余の多能性細胞または他の不要な系統はまた、分化の目標を妨げる可能性パラクリン効果を示すことができます。したがって、これらの細胞の除去は、改善された再現性をもたらすことができます。 分化後に内胚葉細胞を発現CXCR4 +の精製は、これらの集団を濃縮するために、および分化過程に抵抗する細胞を除去するために使用することができます。表面DEマーカータンパク質CXCR4は、胚体内胚葉細胞の特異的な精製のために使用することができます。手元MACS精製プロトコル未満、2時間以内に完了することができ、高価な実験装置および装置なしですべての細胞培養実験室での単純なベンチトップ形式で実行することができます。 FACS精製は、一般的に使用される技術であるが、過酷な条件を採用しています。 FACSの間、精製細胞は、通常、長時間懸濁状態に維持し、細胞は、他の挑戦的な要因、FACS装置のノズルで例えば、高圧の対象とされています。比較ではMACS手順は、高速かつ穏やかです。これは、精製工程の後に再播種時に再接続する細胞の能力を向上させます。さらにこの再付着を容易にするためにROCK阻害剤は、後の前アポトーシスを防止するために、精製し、培養培地に添加されます。再付着に影響を与える別の重要な因子は、細胞を再接種されるときの密度です。これは強くdepen使用する細胞株でのDS。この研究に播種するために使用される細胞数は、我々の手で適切に動作する代表的な細胞数です。しかしながら、異なる細胞株についてこれらの数を調整する必要があってもよいです。両方の対策、ROCK阻害剤の添加および再シードのための細胞数の評価は、ソート後の更なる細胞培養の成功に不可欠です。 使用DE分化プロトコルを用いて、典型的には&gt; 70％のCXCR4 +細胞は、8を選別することなく得ることができます。 DE生成に使用されるプロトコルの性能は、結果的に、その後のMACS精製プロトコルの効率に影響を与えます。一般的に、効率的な分化は（&gt; 80％のCXCR4 +細胞）（95％まで）MACSソーティング後の高純度をもたらします。従って、この精製方法の使用は、実質的に未分化細胞の数を減少させるが、100％の純度を達成することができません。将来的には、系統特異的表面マーカーは、Tを定義することができます帽子は、より多くの分化細胞の精製を可能にします。 MACSソーティング手順は、この目的のための主要な選択です。

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞は、ヒトの身体の実質的に任意の細胞型に分化する能力を有します。したがって、in vitroでの分化プロトコルは、心筋1、肝細胞2、β細胞3、肺上皮4または神経細胞5のような多数の成体細胞型を生成することができます。これは、様々な変性疾患3の潜在的な治療のためのESCの貴重なツールとなります。 肺、肝臓と膵臓の成体組織に向かってESCのインビトロ分化は、胚体内胚葉（DE）6を連想させる細胞への擬似原腸形成を必要とします。上記の体細胞型に向かって下流分化は著しく効率が低いので、最適な内胚葉分化は律速7とみなされます。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、茶を受けますそれらの遺伝子発現プロファイルのracteristic変化。例えばFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバーと表面受容体CXCR4のような他の転写因子の発現は非常6、8、9を上方制御される一方、多能性マスター調節遺伝子がダウンレギュレートされている。CXCR4はSMAD2によりトランスされることが知られています、そのプロモーター領域10内の特定の結合部位へのノーダル/ TGF-βシグナルとSOX17の下流/ 3、。したがって、レポート6、8、11〜13の数で使用される非常に適したマーカーです。これらの発現変化のESCが第原始線条様細胞集団の特性を獲得し、その後、内胚葉の胚層6にコミットする擬似原腸形成のイベントを反映しています。 少数の細胞が分化過程をレジストや他の意図しない系統14に分化することができるようしかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。これらの細胞は、負influeありNCEさらなる分化。また、残余の未分化細胞は、後の移植実験のための大きなリスクを保有し、奇形腫15-17を生じさせる可能性があります。 早期に表面マーカーCXCR4 DE 18に向けてコミットされた細胞の精製に使用することができ、これらの不要な細胞を除去するために。ここでは、DE分化培養からのCXCR4 +細胞の正の選択のための方法を説明します。このため、表面マーカーCXCR4は、その後今度は、磁気マイクロビーズに結合する抗体によって結合されます。 FACS選別中過酷な条件とは異なり、磁気的に標識されたDE細胞様細胞は、その後、簡単に優しい精製法を用いて、ベンチトップ形式で精製され得ます。このプロトコルは、DE分化プロセスに抵抗する細胞集団を除去するための簡単​​な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Hues8 human embryonic stem cell line</td><td>Harvard Department of stem cell &amp;amp; regenerative biology</td><td></td><td>Suitable cell line for endoderm generation</td></tr><tr><td>Hes3 human embryonic stem cell line</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Suitable and robust cell line for endoderm generation</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC culture medium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>anti-APC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>magnetic field</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>basement membrane matrix&lt;br/&gt; * solve and store in aliquots at -80 &amp;deg;C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12.&lt;br/&gt; Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature.&lt;br/&gt; Remove the matrigel and use immediately. </td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 FW&lt;br/&gt;gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Human FOXA2 REV&lt;br/&gt;tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW&lt;br/&gt;gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC REV&lt;br/&gt;ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan assay</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW&lt;br/&gt;gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV&lt;br/&gt;tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 FW&lt;br/&gt;cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 REV&lt;br/&gt;ctgcagtgtgggtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW&lt;br/&gt;ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV&lt;br/&gt;ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW&lt;br/&gt;caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV&lt;br/&gt;agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW&lt;br/&gt;ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV&lt;br/&gt;tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW&lt;br/&gt;agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV&lt;br/&gt;cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

a quick and efficient method for the purification of endoderm cells generated from human embryonic stem cells

このような胚性幹細胞（ESC）などの多能性幹細胞の分化能力は、細胞置換療法のための潜在的治療用途を可能にします。分化した細胞型は、種々の変性疾患の治療のために使用することができる。、肺、肝臓、および膵臓の組織に向かって、これらの細胞のインビトロ分化は、第一段階として、決定的な内胚葉細胞の生成を必要とします。このステップは、レート制限などのインスリン産生β細胞、肝細胞または他の内胚葉由来の細胞型として末端成熟した細胞型に向けてさらなる分化のためのものです。内胚葉系統に向けてコミットされた細胞は、非常にそのようなFOXA2、SOX17、HNF1B、GATAファミリーのメンバー、および表面受容体CXCR4のような転写因子の多くを表現します。しかし、分化プロトコルはめったに100％効率的ではありません。ここでは、分化後のCXCR4 +細胞集団の精製のための方法を説明します磁性マイクロビーズを使用して、DEへ。この精製は、さらに不要な系統の細胞を除去します。穏やかな精製方法は、迅速で信頼性が高く、下流側のアプリケーションと分化を改善するために使用されるかもしれません。

分化すると ESCは、遺伝子およびタンパク質発現の急激な変化を受ける。 図1は、成功した内胚葉分化を確認するために使用することができる代表的なマーカー遺伝子を示します。遺伝子発現解析のための主要な標的は、GSC、FOXA2、及びSOX17ある。未分化のESCと比較した場合の相対的な遺伝子発現解析では、特にFOXA2及びSOX17は &gt; 2000倍に増加している。GSCはすでに原始線条形成の間に非常に初期の24時間以内に発現していますしかし、それにもかかわらず4日目&gt; 100倍に誘導されます。これらの遺伝子の発現は、CXCR4の表面マーカー6を用いて選別時に結果的に増加します。これらの遺伝子の発現は、まだ4日後に検出可能であるが、このようなOCT3 / 4（POU5F1）およびNANOGなどの多能性のマスターレギュレータは大幅にダウンレギュレートされています。このインディカ一部の細胞が十分にCHIR-99021およびアクチビンAのSOX7の遺伝子発現と治療計画に応答しないTESは、一般的に、DEに対する胚体外内胚葉形成を区別するためにアドレス指定されます。最初のケースでSOX17は、SOX7とし、SOX17は FOXA2と共発現された後者の場合は共発現です。 図1の結果は、我々はまだSOX7 +細胞を染色することができていないが、DEと一緒にいくつかの余分な胚細胞は、分化の間に形成された可能性があることを示しています。 図2は、DEへのESCの分化した後に存在する異なる細胞集団を示しています。ステップ1のESCは、単一の細胞として播種し、その後4日間CHIR-99021およびアクチビンAで処理することにより、分化しました。 DEのIF染色は、SOX17及びFOXA2（ 図2A）は 、両方のマーカーが共同expresse均一であることを示すマーカー核内D。これは、DEコミットメントの特徴とみなされています。しかし、いくつかの細胞は分化過程レジスト二DEマーカータンパク質（ 図2A）のどちらを表します。実際には、二つの異なる細胞集団は4日間の分化後に観察されています。多くの細胞は、DEマーカーFOXA2を表現しながら、依然として多能性マーカーSOX2（ 図2B）を発現する残りの細胞があります。これらの2つのタンパク質は、2つの別個の集団において発現されない共発現（ 図2B）に観察することができません。 一日3または分化の4上の表面タンパク質CXCR4は、DE-コミットCXCR4 +集団をソートすることにより、残りの多能性細胞および他の不要な系統を除去するために使用されます。使用される細胞株の分化効率に応じて、&gt; 80％のCXCR4 +細胞が、ステップ1~8で概説分化プロトコールを用いて得ることができます</suP&gt;。ここで使用HES3ラインは、ソートした後92％±4％をソートし、前に66％±3％のCXCR4陽性細胞が得られた（n = 3）。 図3は、DEへの分化した後に、CXCR4 +細胞の精製を染色し、MACS後にフローサイトメトリーデータを示していると前とMACS精製後に免疫蛍光（IF）染色を使用して一般的なDEおよび多能性マーカータンパク質の発現を示します。ステップ2で説明したCXCR4のための免疫蛍光染色を使用して約60％のCXCR4 +細胞は、（ 図3A、中段パネル）が得られた分化の3日目。 CXCR4 +細胞は、APC結合抗CXCR4抗体で染色時Q1へQ4から移動します。 MACS精製ステップ3で説明した後、CXCR4 +集団が85％に濃縮されています。精製プロセスは、しかし、培養（ 図3A、右パネル）からすべての不要な系統がなくなるわけではありません。 MACS精製後、CXCR4 +細胞は、さらなる分析のために播種することができ、あるいは必要に応じて並べ替えの第二ラウンドは、より高い純度が、減少し生存率を得るために行われてもよいです。 （緑色に染色された）多能性マーカーSOX2の広範な発現を、分化の前には、IF染色によって検出されます。これとは対照的に、（赤く染色）DEマーカーFOXA2は（ 図3B）を検出することはできません。 図3C CXCR4 +で細胞はFOXA2のための抗体（緑）で染色され、多能性マーカーSOX2（赤）のための共染色されています。精製されたCXCR4 +細胞の播種後わずか数SOX2 +細胞が検出されます。播種した細胞の大部分は、DEマーカーFOXA2に陽性です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53655/53655fig1highres.jpg" width="700" /> 図4日間の内胚葉分化の間の異なる多能性および内胚葉マーカー遺伝子の遺伝子発現の1.代表的変化。 （A） </プロトコルの強い&gt;図は、遺伝子発現解析に続いて内胚葉分化のために使用されています。ランダムRPが基準プロトコル7、単独のアクチビンでの治療、およびCA-Aを使用して分化を表し、任意の成長因子なしで培養条件を表す（CHIR-99021とアクチビンA）MACSソーティングのために使用されるプロトコル、 （8で詳細を参照してください）。 CA-プロトコルで使用されるメディアは、ここでは、原始線条誘導培地および内胚葉誘導培地として呼ばれている。描かれている（B）はせずに、胚体内胚葉のコミットメントの際に表現されているGSC、SOX17及びFOXA2のRT-qPCRを、によって測定された遺伝子発現でありますさらにMACSソーティング。POU5F1（OCT3 / 4）およびNANOGは、多能性の調節因子であり、SOX7は胚体外内胚葉で発現される一般的にダウンして、分化の際に規制。遺伝子発現は、&lt;（3安定して発現ハウスキーピング遺伝子に対して標準化しましたem&gt;のCNRQ値が得られTBP、TUBA1A、G6PD）。未分化細胞における上記遺伝子の発現を1に設定し、変更が遺伝子発現の倍数変化としてプロットします。値は平均±SEMであり、n = 4-5。 ANOVAプラスボンフェローニの事後テスト。ランダムと#P≤0.05と比較して** P≤0.01、## RPに比べて0.01≤P（この図内のすべてのデータが最近8で公開されている）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53655/53655fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53655/53655fig2.jpg" /> 内胚葉分化後2.異なる細胞集団を図。 DEの（A）染色は、それらの均質な共局在を明らかに分化のD4にそれぞれの抗体でSOX17及びFOXA2マーカー。しかし、いくつかの細胞は、分化過程に抵抗し、（青核染色のみを）これらのマーカーを発現しません。黄色で表示され、緑と赤の染色のマージ。（B）DE分化後に二つの異なる細胞集団が存在します。 DE-様細胞は、依然として多能性マーカーSOX2を発現する分化過程に抵抗した細胞に対し、FOXA2を発現します。 （AB）核はDAPI（青）で対比染色しました。パネル（A）中のスケールバーは50μmで、パネルにある（B）は、100μMです。イメージングは、670 nmの（赤、Cy5の）、520nmの（グリーン、FITC）および433 nmで（青、DAPI）で行った、それぞれ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53655/53655fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53655/53655fig3highres.jpg" width="700" /> 分化したDE細胞集団と代表番目のソート図3. MACSソートした後aining。 （A）CXCR4 +染色された細胞（Q1）は、MACS選別した後、濃縮されています。 CXCR4-細胞（Q4）の数が減少します。分化プロトコル収量を使用される細胞株に依存して、&gt; 80％のCXCR4陽性細胞8及びMACSは、さらに、それらを濃縮するために使用することができる。（B）未分化細胞は、多能性マーカーSOX2（緑）ではないDEマーカーFOXA2（赤色を発現ソートされた人口はほぼ均一DEマーカーFOXA2（緑）を発現するのに対し、ごく少数の未分化SOX2 +細胞を選別MACS後）。（C）は 、（赤）のまま。 （BC）核はDAPI（青）で対比染色しました。パネル（C）中のスケールバーは100μmであり、すべてのパネルに適用されます。イメージングは、670 nmの（赤、Cy5の）、520nmの（グリーン、FITC）および433 nmで（青、DAPI）で行った、それぞれ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53655/53655fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

a-quick-efficient-method-for-purification-endoderm-cells-generated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K ビュー.  Hannover Medical School. ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。 

ビデオ: A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In particular, endothelial cells (EC) constituting the inner surface of vessels, directly participate in oxygen delivery, nutrient supply, and removal of waste products to and from tumors, and are thereby prominently involved in the constitution of the tumor microenvironment (TME). Tumor endothelial cells (TECs) can be used as cellular biosensors of the intratumoral microenvironment established by communication between tumor and stromal cells. TECs also serve as targets of therapy. Accordingly, in culture these cells allow studies on mechanisms of response or resistance to anti-angiogenic treatment. Recently, it was found that TECs isolated from human colorectal carcinoma (CRC) exhibit memory-like effects based on the specific TME they were derived from. Moreover, these TECs actively contribute to the establishment of a specific TME by the secretion of different factors. For example, TECs in a prognostically favorable Th1-TME secrete the anti-angiogenic tumor-suppressive factor secreted protein, acidic and rich in cysteine-like 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulates vessel homeostasis and inhibits tumor cell proliferation and migration. Hence, cultures of pure, viable TECs isolated from human solid tumors are a valuable tool for functional studies on the role of the vascular system in tumorigenesis. Here, a new up-to-date protocol for the isolation of primary EC from the normal colon as well as CRC is described. The technique is based on mechanical and enzymatic tissue digestion, immunolabeling, and fluorescence activated cell sorting (FACS)-sorting of triple-positive cells (CD31, VE-cadherin, CD105). With this protocol, viable TEC or normal endothelial cell (NEC) cultures could be isolated from colon tissues with a success rate of 62.12% when subjected to FACS-sorting (41 pure EC cultures from 66 tissue samples). Accordingly, this protocol provides a robust approach to isolate human EC cultures from normal colon and CRC.

Tumor endothelial cells are important determinants of the tumor microenvironment and the course of the disease. Here, a protocol for the isolation of pure and viable endothelial cells from human colorectal carcinoma and normal colon to be used in drug testing and pathogenesis research is described.

通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

がん研究

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

生物学

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

神経科学

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

発生生物学

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and cell-matrix interactions. Due to this complexity, recapitulation of lung development in vitro to promote differentiation of stem cells to lung epithelial cells has been challenging. In this protocol, decellularized lung scaffolds are used to mimic the 3-dimensional environment of the lung and generate stem cell-derived airway epithelial cells. Mouse embryonic stem cell are first differentiated to the endoderm lineage using an embryoid body (EB) culture method with activin A. Endoderm cells are then seeded onto decellularized scaffolds and cultured at air-liquid interface for up to 21 days. This technique promotes differentiation of seeded cells to functional airway epithelial cells (ciliated cells, club cells, and basal cells) without additional growth factor supplementation. This culture setup is defined, serum-free, inexpensive, and reproducible. Although there is limited contamination from non-lung endoderm lineages in culture, this protocol only generates airway epithelial populations and does not give rise to alveolar epithelial cells. Airway epithelia generated with this protocol can be used to study cell-matrix interactions during lung organogenesis and for disease modeling or drug-discovery platforms of airway-related pathologies such as cystic fibrosis.

This protocol efficiently directs mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm to mature airway epithelial cells. This differentiation technique uses 3-dimensional decellularized lung scaffolds to direct lung lineage specification, in a defined, serum-free culture setting.

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

生物工学

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

胚心室内皮細胞の単離

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

iPS細胞からの効率的なヒト腸オルガノイド生成のためのマトリックス比較

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are in the spotlight of many research areas. However, the lack of physiological cues in classical cell culture materials hinders efficient iPSC differentiation. Incorporating commercially available ECM into stem cell culture provides physical and chemical cues beneficial for cell maintenance. Animal-derived commercially available basement membrane products are composed of ECM proteins and growth factors that support cell maintenance. Since the ECM holds tissue-specific properties that can modulate cell fate, xeno-free matrices are used to stream up translation to clinical studies. While commercially available matrices are widely used in hiPSC and organoid work, the equivalency of these matrices has not been evaluated yet. Here, a comparative study of hiPSC maintenance and human intestinal organoids (hIO) generation in four different matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB), and VitroGel (Matrix 4-XF) was conducted. Although the colonies lacked a perfectly round shape, there was minimal spontaneous differentiation, with over 85% of the cells expressing the stem cell marker SSEA-4. Matrix 4-XF led to the formation of 3D round clumps. Also, increasing the concentration of supplement and growth factors in the media used to make the Matrix 4-XF hydrogel solution improved hiPSC expression of SSEA-4 by 1.3-fold. Differentiation of Matrix 2-AB -maintained hiPSC led to fewer spheroid releases during the mid-/hindgut stage compared to the other animal-derived basement membranes. Compared to others, the xeno-free organoid matrix (Matrix 4-O3) leads to larger and more mature hIO, suggesting that the physical properties of xeno-free hydrogels can be harnessed to optimize organoid generation. Altogether, the results suggest that variations in the composition of different matrices affect stages of IO differentiation. This study raises awareness about the differences in commercially available matrices and provides a guide for matrix optimization during iPSC and IO work.

著者スポットライト:iPS細胞を用いた創薬のためのオルガノイド生成の促進

Organoids have become valuable tools for disease modeling. The extracellular matrix (ECM)&#160;guides cell fate during organoid generation, and using a system that resembles the native tissue can improve model accuracy. This study compares the generation of induced pluripotent stem cells-derived human intestinal organoids in animal-derived ECM and xeno-free hydrogels.

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

要約

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通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

胚心室内皮細胞の単離

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究