国立衛生研究所（NIH R15 DCへNS067536-01A1）、国家外陰部痛協会（DCへの賞）、およびマカレスター大学は、この作品を支持しました。 CBはアーノルドとメイベルベックマン財団によって資金を供給マカレスター大学ベックマン学者プログラムからのフェローシップを受けました。 BTFとTMはJDRF 2-2011-662によってサポートされています。我々は、技術的な助言のために博士ジェイソン・シェンケル博士ジュリアナ・ルイスに感謝し、彼らの助けと支援のためのChatterjeaラボのすべての現在および元メンバー。

注：8-12週齢の雌ND4 Swiss Websterマウスは、従来から食料と水に自由にアクセスさせて飼育、これらの研究のために使用した（B13S1）使用される実験プロトコルは、マカレスター大学のIACUCによって承認されました。 オキサゾロン1.感作とチャレンジ<ol><li> 0日目<ol><li> 4 L蓋付きガラス瓶の底にメッシュの下に配置された吸収性タオルに3ミリリットルイソフルランを追加することによって、麻酔室を準備します。被写体が十分に麻酔されるまで、ここで使用ND4雌マウスでは、チャンバー内の時間は30〜60秒です。使用しているマウス株のための麻酔管理を最適化します。 </li><li>動物の毛のトリマーを使用して、各麻酔したマウスの背中や脇腹を剃ります。 </li></ol></li><li> 1日目<ol><li>無水エタノール中の4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン（OX）の2％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。 </li><li>簡単に言うと麻酔1.1.1に記載されており、約20μlの各いくつかのシリアル・アプリケーションに戻って剃っに2％牛の100μLを適用するようイソフルラン麻酔を使用してマウス。乾燥するためのソリューションのためのシリアル・アプリケーションとの間に5〜10秒待ってください。 </li><li>バック以外の領域に2％牛液をこぼすないように注意してください、とアプリケーションの間に乾燥するためのソリューションを待ちます。 </li></ol></li><li>日5-7 <ol><li>無水エタノール（牛）の1％溶液を作製し、インキュベーター内で回転板上で15分間、50℃でインキュベートします。 </li><li>静かにしっかりと（腹腔内注射のために保留に類似）を上向きと首がやや下向きに傾いた腹部と首と尾ベースの首筋にマウスを固定化し、いくつかのシリアル・アプリケーションで剃っ脇腹に1％牛の100μLを適用そして上記のように、その後、皮膚を乾燥させるために時間をかけ。 </li><li>対照マウスでは、剃ったフランに無水エタノール車の100μLを適用K。 </li></ol></li></ol> 2.フランクスキン収穫<ol><li>二酸化炭素吸入を使用して、マウスを安楽死させる、と慎重に10センチメートル手術用ハサミで脇腹の皮膚の所望の領域（皮膚の〜25ミリメートル×25 mm）を切り出します。 </li><li>きれいな、鋭い外科用メスを使用して、脇腹の皮膚から余分な脂肪および結合組織を削り取ります。 </li><li>カルシウムまたはマグネシウムを含まないフェノールレッド、5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いて[10 mlのRT HBSSを含む50 mlのコニカルチューブに3匹のマウスの側腹部皮膚の3枚を配置し、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および10％ウシ胎児血清（FBS）]。 </li></ol> 3.事前消化組織洗濯<ol><li> 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。 </li><li>インキュベーション期間の終わりに10秒間激しくボルテックス。 </li><li> 70ミクロンを介してチューブの内容ひずみストレーナーを洗浄緩衝液を廃棄し、組織を収集します。単一ストレーナーは、生物学的治療群内で手順全体を通して再利用することができます。 </li><li>ピンセットを使用して、（上記のようにEDTA、HEPES、およびFBSを含む）新鮮な、RT HBSS培地の10 mlを含む新しい50 mlのコニカルチューブにストレーナーから脇腹の皮膚を転送します。 </li><li>組織の平均ピースが面積約2.2ミリメートルX 2.2ミリメートルになるようにチューブに浸漬し、外科的解剖ハサミ12.5センチペアで、脇腹の皮膚の各部分をミンチ。 </li><li> 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーター中で30分間回転板上の皮膚断片を含む場所チューブ。 </li><li>インキュベーションの終わりに10秒間激しくボルテックス</li></ol>肌の4.コラゲナーゼ消化<ol><li> 70μmのストレーナーを介してチューブの内容をひずみ、10ミリリットルFREを含む新しい50mlコニカルチューブに脇腹の皮膚片を収集し、転送SH、RT HBSSメディアは、0.7 mg / mlのコラゲナーゼDに補足しました</li><li> 37℃に維持し、乾燥非ガス処理インキュベーターで30分間、回転板上で消化培地および皮膚断片を含む場所チューブ。 </li><li>インキュベーションの終わりに勢いよく10秒間チューブの渦内容。 </li><li>新しい50mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを通してチューブのフィルタの内容。消化された組織を含むフロースルーを維持し、ストレーナを破棄し、皮膚の破片に隣接しています。 </li><li> 350×gで5分間、HBSS培地、遠心分離機50mlにフロースルー洗浄し、上清をデカントします。 </li></ol> 5.密度勾配遠心<ol><li>血清学的ピペットを使用して、各サンプルについての新しい15 mlのコニカルチューブに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3 mlのRT 67％密度勾配遠心分離媒体を加えます。 </li><li> 5ミリリットルフェノールレッドとHBSS中のRT 44％の密度勾配遠心分離培地で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>ヘント血清学的ピペットを使用して67％の密度勾配遠心分離媒体試料の上に細胞を含む44％の密度勾配遠心分離媒体のLY層5 mlです。最も遅い速度にピペッターを設定し、円錐管の壁に沿ってピペットを配置することを確認します。 、振る崩壊させる、またはグラデーションの色を反転しないように注意してください。 </li><li>最も低い設定に設定し、加速、ブレーキを解除し、遠心分離器がバランスであることを確認し、室温で20分間、931×gで勾配を遠心します。 </li><li>遠心分離した後、慎重に遠心分離機からグラデーションを削除して、静かに直立管を保持する実験台に運びます。 5 mlのプラスチック製トランスファーピペットを用いて、新しい15 mlのコニカルチューブに44％および67％密度勾配遠心分離媒体および転写の界面で細胞層を除去します。インターフェイスが表示されない場合は、単純に67％-44％の境界で液体の約2mlを削除します。 </li><li> INTEから細胞を含むコニカルチューブを埋めます2％1X氷冷PBSでFBS、350×gで5分間遠心分離細胞、上清をデカントでrface。 注：消化工程は37℃であり、密度勾配遠心分離媒体のステップは室温であるので、これは、セルを冷却することができることが初めてでは、/コールド保ちます。細胞を1に再懸濁することができる：1トリパンブルーに希釈し、計数し、生存率情報は、この時点で得ることができます。 </li></ol>フローサイトメトリー分析のための6ブロッキングと染色<ol><li>ブロックのFcγRII/ IIIは、非特異的な抗体染色を防ぐために、細胞上の受容体。非コンジュゲートと結合するCD16 / 32（2.4G2）に対する抗体とブロックのFcγRII/ III受容体の100倍希釈：ここで説明する実験のために、1を含む2％FBSを含むPBS中の抗体のマスターミックスを作ります。 </li><li> CD3ɛ（145-2C11）、CD4（RM4-5）、CD8α（53-6.7）、のCD11b（M1 / 70）、のCD11c（N418）、CD44（IM7）、CD45（に対する抗体の適切なマスターミックスでブロックされた細胞をインキュベート30-F11）、CD45R（RA3-6B2）、CD62L（MEL-14）、およびLY-6G / LY-6C（GR-1）（RB6-8C5）と同様に、ブリリアントバイオレット死んだ細胞を同定するために510生/死染色。希釈メーカーが推奨する、または以前の研究者によって最適化ですべての抗体のいずれかを使用してください。 100希釈：ここで説明する実験のために、1ですべての抗体を使用しています。 </li><li> 2％FBSを含む50μlの1×PBSの染色緩衝液中で細胞を再懸濁を洗ってください。蛍光データは、フローサイトメーターで取得できるようになるまで氷上で保管してください。 注：これは、蛍光データの取得の前にリンパ組織および（CD4またはCD8のような）一般的な細胞表面抗原で事前に最適化された補償パラメータを有することが重要です。 </li><li>下流のフローサイトメトリー分析のために細胞の数を増加させるために、染色された細胞の全サンプルからデータを取得します。 </li></ol> 7.以下の手順を解決するための標準的な方法を用いて、フローサイトメトリーデータの分析<ol><li>前方散乱のリンパ球領域上にまず、ゲート側方散乱（面積）のプロットにより（面積）。 </li><li>次に、二重の分析を避けるために、側方散乱（幅）によって前方散乱（幅）を使用して単一のセルを選択します。これはまた、側方散乱高プロットによって前方散乱の高さを用いて達成することができます。 </li><li>目標がある場合はその後、それぞれマクロファージ、樹状細胞、およびB細胞を排除する系統のゲート（のCD11b、CD11cの、およびCD45R / B220）陰性およびCD3陽性のイベント、および閉じ込めるは、T細胞区画に分析しますそれがここにあるように、T細胞の浸潤を評価します。 </li><li>次に、生/死染色を排除し、生細胞上のゲート。 </li><li>最後に、目的の細胞集団上にゲート（代表的な結果を参照）。 </li></ol>

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著者らは、開示する金銭またはその他の利害関係はありません。

このようなアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患のげっ歯類モデルにおいて皮膚常駐白血球の変化を特徴づけることは炎症性細胞の流入および疾患の病理との間に機械的な接続を理解するために重要です。ここでは、ほとんどの生物医学研究室で見つかった基本的な機器を用いて皮膚組織から白血球を分離するために経済的な手法について説明します。この比較的急速な技術は実験台でハンズオンタイムを最小限に抑えながら、資源の節約に貢献し、高価な組織解離機やカスタムチューブおよび試薬の使用を回避します。穏やかな酵素消化及び不連続勾配分離上皮細胞および破片の大部分を除去し、単離された細胞は、フローサイトメトリー分析、細胞選別、転写、細胞培養およびインビトロ刺激アッセイを含む下流の種々の用途に使用することができます。コラゲナーゼDによる酵素消化は、T細胞表面マーカーの完全性に影響を及ぼさない、とPRESERVESの細胞生存率。このプロトコルは、簡単にフランク以外の領域からの皮膚を処理するために修正することができます。 この手順の中で最も重要なステップは、細胞死を最小限に抑えながら、細胞収率を浸潤最大にするために急速に皮膚、2）取り扱いおよび処理組織を採取しながら、十分に慎重に）3）穏やかに勾配を積層し、図4に示すように、任意の脂肪および結合組織を除去する）1であります勾配のインターフェースを抽出します。大規模な実験を開始する前に、密度勾配遠心分離媒体積層界面の除去を実施することが重要です。一つは、それが見るとの間のインターフェースを抽出するためにはるかに簡単である1×PBS染色バッファに70μmのストレーナを介して全体のマウスの脾臓を破砕し、手順5で説明したように密度勾配を行うことにより、不連続密度勾配から収穫細胞を練習することができますSPを使用して44％の密度勾配遠心分離媒体および67％の密度勾配遠心分離媒体現在の免疫細胞の多数によるlenocytes、。 密度勾配で作業する場合、気泡がピペット操作しながら、避けるべきである、と勾配の混乱を最小限に抑える必要があります。勾配を含むコニカルチューブを静かに取り扱い、常に垂直に保持されるべきです。密度勾配遠心分離メディアソリューションは、常に室温であるべきである、最も遅い可能なリリース速度に設定血清学的ピペットは、室温に維持遠心分離機は、外れブレーキと低加速度に設定され、紡績前に慎重にバランスの取れました。白血球浸潤の小さな数字をもたらす皮膚の準備で作業する場合、細胞は、勾配の界面で常に表示されません。これにより、インタフェースが容易に細胞の層を識別できない場合であっても可視化することができるように、HBSSをフェノールレッドを含有する44％の密度勾配遠心分離媒体を作ることが重要です。さらに、それは優しいが、抽出する際に迅速、洗濯することが重要ですそして皮膚をHBSS培地中に置かれる前に、細胞死を回避するために、皮膚組織を処理します。 細胞生存率や純度が低い場合は、短い（〜20分）消化時間は、より微細組織をミンチコラゲナーゼD（〜0.5 mg / mlの）、またはわずかに低い濃度が役に立つかもしれません。オーバー消化および組織の劣化細胞死に寄与する可能性があるため、研究者らは、十分な大きさの細胞試料のサイズ17を提供し 、最小限の消化時間を最適化する必要があります。プロセスは、可能性の高い技術を標準化するために、個々の研究者の手に最適化のいくつかのラウンドを必要とします。コラゲナーゼD活動レベルも消化時間に製造ロットや調整の間で異なる場合があります使用される酵素のロットごとに行う必要があります。最適化中に、信頼性の高い生/死染色ならびに免疫細胞LINと歩調を消化酵素でとせずに精製された（例えば、脾臓）染色参照細胞懸濁液に重要ですEAGEマーカー（例えばCD45、CD3ɛ、のCD11b、CD11cの、など）は、細胞集団と関心の表面マーカーは、組織消化プロセスを通じて保存されていることを確認します。可能な場合は、そのフローサイトメーターで最適化を実行することが有用である前方の測定および側方散乱幅または高さだけでなく、地域、細胞凝集物を除外することができます。最後に、細胞懸濁液は、生存率および一般的な細胞形態の視覚的評価のための光学顕微鏡下で検査されるべきです。細胞は、光学顕微鏡下で計数またはビーズを用いて、フローサイトメーター上で0.4％トリパンブルー色素排除を使用して手動で計数することができます。切除された組織内の特定の細胞型のより厳密な定量化を必要とする研究のために、研究者は、計量または前に、消化後の組織フラグメントの量を測定し、より正確に組織されることに存在する細胞サブセットの数を推定するために、消化の程度を使用することができ分析しました。 これの一つの限界プロトコルは、それが特異的免疫細胞の精製に適合されていることです。一つは、他の細胞集団（例えば、皮膚上皮細胞）の単離、精製、及び分析に関心がある場合、密度勾配セットアップおよび酵素プロトコルダイジェスト最良に変更し、最適化される可能性が高い必要性の両方が目的の細胞を単離します。しかしながら、このプロトコルは、両方のリンパ系および骨髄系細胞サブセットの単離および精製を可能にし、したがって、ほとんどの免疫学的な用途に適合させることができます。別の制限は、このプロトコルは、真皮対皮膚の表皮に浸潤する細胞集団を区別するために使用することができないことです。分化のこのレベルを達成するために、このプロトコルは、さらに前に、ここで説明する手順にまたはその代わりの真皮と表皮を分離酵素的に追加の手順を適合させなければならないだろう。ここでは、サンプルは、することが困難マルチパラメータフローサイトメトリー分析を容易にするために、〜3匹のマウスからプールされ生物学的反復間の変動を検出します。しかし、選択した下流側のアプリケーションに応じて、このプロトコルは、簡単に、単一の被験者からサンプルを得ると使用するように変更することができます。最後に、若い、ND4雌マウスのためにここで紹介するプロトコルは、研究者のニーズに応じて異なる年齢、性別、系統のマウスで変更する必要があります。 要約すると、穏やかな酵素の組み合わせは、消化及び不連続勾配分離は、マウスにおける炎症性皮膚病変の免疫細胞を精製する、単純、有効かつ経済的な方法を提供します。これは、広く免疫浸潤を評価し、下流のアプリケーションのための白血球の純粋な、実行可能な集団を単離するための便利なツールのような皮膚病変の齧歯類モデルの多様な範囲を越えて使用し、適合させることができます。

皮膚接触性皮膚炎、湿疹、乾癬、蜂巣炎、真菌感染症および膿瘍からの非黒色腫皮膚癌が世界50最も一般的な疾患の一つであることが判明した範囲の条件、および2010年1における非致死的疾患の第四世界的なリーディング原因。したがって、多様な皮膚の病変の基礎となる分子・細胞メカニズムの研究は、研究の必要と活性領域です。げっ歯類モデルは、アトピー性皮膚炎2、乾癬3、または黄色ブドウ球菌感染 4のような炎症性皮膚状態の理解に非常に有用でした。マウスの皮膚組織の酵素消化のための、安価で効率的、かつ簡単なプロトコルは、優れた皮膚疾患の病態生理を理解するために、下流の様々な用途に使用することができる細胞の調製物を提供することができます。ここでは、簡単かつ経済的な方法は、マウスの皮膚の酵素消化のために記載されています組織および細胞培養、in vivoでの養子移入のために使用することができる皮膚浸潤白血球の単離は、サイトメトリー分析および選別または遺伝子発現研究を流します。この手順の全体的な目的は、典型的には、カスタムの試薬キットや機械的解離剤に関連するコストを最小限に抑えながら、高い細胞生存率で皮膚浸潤白血球の単一細胞懸濁液を調製することです。 既存の皮膚組織解離方法5-7は、低細胞生存率および表面マーカーの完全性をもたらす、またはカスタム酵素キットや高価な組織解離機8-11が必要な場合があります。マウス耳皮膚組織の消化は、合理的に、12-13流行高度角化皮膚組織を消化し ​​ている間（例えば、サイドから）非細胞破片の大量の汚染された細胞調製物をもたらすことができます。最近の研究では、ザイドらは、2.5 mg / mlのディスパーゼ、follo 90分間マウスの脇腹の皮膚を消化しました3 mg / mlのコラゲナーゼ7で45分までに結婚。別の研究では、これらの研究者は、トリプシン/ EDTA、コラゲナーゼIIIの使用を含む、2.5時間の組み合わせ消化で複数のインキュベーションを使用し、5をディスパーゼ。異なる製造業者からのトリプシン処理は、測定可能な哺乳動物細胞の14-15上の細胞表面タンパク質の完全性に影響を与えることが示されているようにトリプシンの使用は、皮膚の酵素消化には ​​推奨されません。さらに、ディスパーゼは、CD4およびCD8αT細胞の増殖能力に有意な効果を有しており、例えば、CD62L 16などの一般的なT細胞活性化マーカーを含む少なくとも20の分子の表面の存在量に影響を与えることができます。他のプロトコルは、消化媒体6に RPMI 1640を使用しています。しかし、RPMI中のMg 2+およびCa 2+の存在は、大規模な細胞凝集17を引き起こす可能性があります 。 組織解離のための理想的なプロトコルは、低、高細胞生存率を目指す必要があります細胞凝集、および細胞表面タンパク質への最小限の損傷のレベル。高品質のリンパ節間質細胞調製物は、短い酵素インキュベーション、 の Ca 2+およびMg 2+を含まない培地を使用するプロトコルを用いて達成し、トリプシンを回避し、18をディスパーゼされています。しかし、このタイプのプロトコルは、全マウス皮膚の解離のために確立されていません。 ここでは、プロトコルは、解離分離、およびアレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚から皮膚浸潤白血球を豊かにするために記載されています。簡単に説明すると、切除された皮膚は、消化のために、組織を柔らかくし、余分な死んだ皮膚または脂肪組織を除去するために、1時間、10％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）中でプレインキュベートします。これは、0.7ミリグラムで30分間酵素消化工程が続く/ mLのコラゲナーゼD.コラゲナーゼDはそれを作る、細胞表面マーカーの密度、 およびインビトロ16,18 における T細胞の増殖に影響を与えずに最小限の効果を有します表面タンパク質の特徴付けを含む用途に非常に適しています。酵素消化の後、不連続密度勾配遠心分離は、単一細胞懸濁液からの上皮細胞及び破片を除去し、造血細胞を富化するために使用しました。重要なことには、この手順は、高価なカラムベースの磁気細胞分離試薬および組織解離機8-11を回避し 、かつ基本的な生物医学研究室で見つけ機材を用いて行うことができます。ここでは、このプロトコルは、脇腹皮膚から白血球を分離するために使用された（19から適応）以前に増感ND4のスイスマウスにハプテンオキサゾロン（OX）で3回挑戦しました。細胞を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて分析しました。この技術は、最小限の破片と、影響を受けたSKにTリンパ球および好中球の浸潤を測定するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって分析された、単離されたリンパ球の&gt; 95％の生存率と細胞懸濁液が得られましたに。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1213">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">55021C</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">EDTA disodium salt solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E7889</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td>
			<td style="width:179px;">MidSci</td>
			<td style="width:181px;">S01520HI</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Percoll, pH 8.5-9.5 (25&#176;C)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P1644</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Trimmer Combo Kit</td>
			<td style="width:179px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:181px;">CL9990-1201&#160;</td>
			<td style="width:396px;">Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E0753-10G</td>
			<td style="width:396px;">Dissolve in 100% EtOH at 50&#176;C for 15 minutes on a rotating plate.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">70-0161</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:457px;">anti-CD3e-BV650 (145-2C11)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">564378</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">47-0042-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD8a-BV785 (53-6.7)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">100749</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0112-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0114-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD44-BV711 (IM7)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">563971</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45-FITC (30-F11)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">35-0451-U025</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0452-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">104431</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">108407</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">Ghost Dye-BV510</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">13-0870-T100</td>
			<td style="width:396px;">Viability dye for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">LSR Fortessa</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td style="width:396px;">Cell analyzer (18 parameters)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:457px;">Collagenase D from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:179px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:181px;">11088858001</td>
			<td style="width:396px;">Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&#160; Store immediately at -20&#176;C for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:457px;">ND4 Swiss female mice</td>
			<td style="width:179px;">Harlan</td>
			<td style="width:181px;">0-32</td>
			<td style="width:396px;">8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#39;s IACUC guidelines.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

コラゲナーゼDは 媒体処置対照と比較した場合、 脾臓細胞は、T 細胞上の CD4及びCD8αの同様のレベルを示して扱わ まず、T細胞サブセット上の系統及び活性化マーカーの頻度及び表面豊富にコラゲナーゼDの任意の潜在的な影響は、対照としての二次リンパ組織を使用して評価しました。脾臓細胞の懸濁液を、ND4マウスから得て、HBSS培地で1時間洗浄しました。次に、細胞の半分は0.7 mg / mlのコラゲナーゼD（上記のセクション4で説明したように）を行いました。残りの細胞は、コントロールHBSS培地中に再懸濁しました。次に、両方の脾細胞画分は、上記セクション5に記載されるように密度遠心分離勾配を用いて処理しました。次いで、細胞を表面にCD4およびCD8αに対する抗体で染色し、フローサイトメーターで分析しました。シングル、ライブ、CD45 +、非T細胞系譜- （B220 -のCD11b -CD11c - ）は、CD3ɛ+細胞は、B細胞、マクロファージ、樹状細胞を排除するために、分析のためにゲートしました。細胞を、30％のCD4 - -治療のいずれかを用いて検出CD8α+細胞（CD4およびCD8αタンパク質が等しくコラゲナーゼD消化に供された、それらが約60％CD4 +CD8αを有する酵素に暴露されていない脾細胞の表面上で検出されました図1A）。したがって、コラゲナーゼDダイジェストは、CD4およびCD8αの相対頻度に影響を与えませんでした。これらのサブセットの表面CD4およびCD8α幾何平均蛍光単位（GMFI）の強度は、2つの治療間で同等でした。 CD4のためのGMFI値は、それぞれ制御脾細胞のための酵素処理および2243のために2271年だった、とCD8αためGMFI値は、酵素処理および対照脾細胞のための520のために536でした。酵素処理は、また、T細胞活性化マーカーCの表面密度に影響を及ぼさありませんでしたCD4 + T細胞（ 図1B）でD44またはCD62L。 CD44のための幾何平均蛍光強度値は、酵素処理および制御のために、脾細胞654のために669でした。 CD62LのためGMFI値は、制御脾細胞のための酵素処理および1517のために1523年でした。コラゲナーゼD消化は、単離された細胞上の表面タンパク質の完全性を保持するように、ここで説明するプロトコルは、下流のフローサイトメトリー分析のために安心して使用することができます。 酵素消化および高い細胞生存率の脇腹皮膚細胞の結果の勾配精製 上記で得られた細胞懸濁液の細胞収率およびパーセント生存率は、トリパンブルー色素排除20を使用して評価しました。この消化と勾配分離プロトコルは、OX-チャレンジしたマウスにおけるフランク組織の1mm 2当たり約250の実行可能な免疫細胞や車両チャレンジしたマウスにおける組織の1mm 2当たり約4実行可能な免疫細胞が得られましたそれは、以前にオックス（ 表1）で感作しました。 酵素消化および免疫細胞の強固な回復で脇腹皮膚細胞の結果の勾配精製 次に、皮膚における免疫浸潤の程度は、OX-チャレンジし、ここで記載された方法を用いて、皮膚浸潤性免疫細胞の回復を評価するための対照マウスの脇腹から単離された細胞上のCD45表面タンパク質の存在量を分析することによって決定しました。 CD45は汎造血系統マーカー21です。前方低側方散乱、単一細胞の95％牛、チャレンジしたマウス（図示せずゲーティング）と車両チャレンジコン ​​トロールにおけるこれらの細胞の71％が生CD45 +細胞（ 図2）でした。浸潤CD45 +免疫細胞における〜67倍の増加は、本明細書に記載した手順（ 表1）を使用して、3毎日牛の課題を以下の脇腹の皮膚で検出されました。 三フランク牛の課題は、T細胞および好中球の顕著な浸潤をもたらします 我々の技術は、GR-1 +好中球22、CD4 T細胞およびCD8αT細胞として骨髄およびリンパ細胞サブセットの多様を検出するために使用することができる脇腹皮膚から細胞集団を得ました。我々はそれぞれ〜73倍の好中球の増加、CD4 T細胞、およびCD8αT細胞は、3毎日牛の課題（ 表1）以下、約7倍〜6倍の観察、および。我々は、フローサイトメトリー分析中の生存細胞のゲートのうち、所定の免疫細胞の断片のパーセント（トリパンブルー排除を用いて数えて）得られた生存細胞の総数を乗算することによってこれらの増加を計算しました。それから、私たちを与え、ビヒクル対照マウスについて、対応する番号によって牛処置マウスにおける総生存免疫細胞の数、GR-1 +、CD4 +、またはCD8α+細胞を分割しましたリンパ球サブセットの増加を折ります。 CD11b - -のCD11c -牛処置マウスにおける細胞とエタノールで処理したマウスでは、この集団の10％GR-1 +好中球は、単一の、ライブCD45 + B220の42％を占めました （ 図2B）。牛処置マウスでは、〜ゲーテッドCD3 + T細胞の52％がCD8α+であり、ビヒクル対照で、〜T細胞の9％はCD8α+であり、57％がCD4 +（ 図2C）であった〜34％は、CD4 +でした。従って、ここに記載された技術、アレルギー性​​および非アレルギー性​​脇腹皮膚と免疫細胞サブセットの浸潤の高分解能フローサイトメトリーの特徴付けに適した単一細胞懸濁液を得るために処理することができます。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> マウスの脇腹の皮膚からの細胞サブセット </td><td> 牛/牛（3） </td><td> OX /エタノール（3） </td><td> （オックス/ E拡張を折りますthanol） </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> mm 2の組織あたり </td></tr><tr><td>細胞の総数</td><td> 262.7 </td><td> 5.3 </td><td> 49.3 </td></tr><tr><td> CD45 +免疫細胞</td><td> 250.7 </td><td> 3.8 </td><td> 66.7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 -細胞</td><td> 6.5 </td><td> 0.9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> CD4 - CD8 +細胞 </td><td> 10.6 </td><td> 0.1 </td><td> 72.9 </td></tr><tr><td>好中球</td><td> 8.6 </td><td> 1.5 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> ND4雌マウスにおけるアレルギー性脇腹の皮膚から表1細胞収量 。脇腹の皮膚から分離された生細胞をトリパンブルー排除を用いて計数し、細胞/ mm 2隔離皮膚の領域に基づいて、組織とTISごとにプールしたマウスの数に正規化しました。準備を訴えます。私たちは、系統特異的表面マーカーに基づいて、造血細胞表面上の抗原CD45、およびリンパ球サブセットの利回りの検出に基づいて総免疫細胞の収量を計算しました。それから、私たちは、リンパ球サブセットの増加倍与え、ビヒクル対照マウスに対する番号で牛処理マウス中の細胞数を割りました。示したデータは、処理当たり2-3匹のマウスからプールしたデータを表し、2つの独立した実験の代表です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> 図1酵素消化および脾細胞の勾配精製は、リンパ球サブセット、細胞活性化マーカーを保持する。脾細胞を、HBSS培地で1時間洗浄しただけではコラゲナーゼDまたはHBSS培地のいずれかと共にインキュベートし、破片および赤血球を除去するために、密度勾配を用いて精製しました。 T細胞は（B220、のCD11b、CD11cの）、CD45 +、ライブ系統として同定されました&lt;SUP&gt; - 、およびCD3ɛ+。 CD4およびCD8αT細胞の頻度は、酵素消化（A）の後に変化しませんでした。 CD4 + T細胞上のCD44とCD62Lの表面密度は、酵素消化（B）以下の変化しませんでした。示されるデータは、一回の実験からの処理当たり2-3匹のマウスからプールしたデータを表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> 図2.酵素消化および皮膚細胞の勾配精製は、アレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚対コントロールに明確な免疫浸潤を明らかにした。三フランク牛の課題は、以前に増感ND4スイスマウスの皮膚浸潤免疫細胞（中〜67倍の増加をもたらしますA）。三牛の課題もプロブ〜6倍のGR-1 +好中球（B）の増加、および〜73-それぞれ約7倍の増加CD8α+およびCD4 + T細胞、（C）を oked。ライブCD45 +免疫細胞は、単一の前方低側方散乱細胞からゲートされ、 CD11b - -のCD11c - B220からゲートされた好中球およびT細胞の生単一細胞。密度勾配分離後1トリパンブルーに希釈：カウントが1を用いて行きました。示されるデータは、各治療群では2〜3匹のマウスからプールされたデータを表し、2つの独立した実験の代表例である。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K ビュー.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

脳浸潤白血球の分離

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

免疫・感染学

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...