המכונים הלאומי לבריאות (NIH R15 NS067536-01A1 לDC), הלאומי וולוודיניה אגודה (הפרס לDC), ומקאליסטר המכללה תמכו ביצירה זו. CB קיבל מלגה מהתכנית בקמן חוקרי מקאליסטר המכללה, ממומנת על ידי ארנולד ומייבל בקמן הקרן. BTF וTM נתמכים על ידי JDRF 2-2011-662. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ייסון Schenkel וד&quot;ר יוליאנה לואיס לייעוץ טכני, וכל החברים הנוכחיים ולשעבר המעבדה Chatterjea לעזרה והתמיכה שלהם.

הערה: נקבות עכברים ישנות 8-12 שבוע ND4 השוויצרי וובסטר, כמקובל שוכנו עם גישה חופשית למזון ומים, שמשו למחקרים אלה פרוטוקול הניסוי בשימוש (B13S1) אושר על ידי IACUC של מקאליסטר המכללה.. 1. רגישות ואתגר עם Oxazolone <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא הרדמה על ידי הוספת 3 מיליליטר isoflurane למגבות סופגים ממוקמות מתחת רשת בתחתית צנצנת זכוכית עפעפי 4 L. לנקבות עכברי ND4 משמשים כאן, זמן בחדר הוא 30-60 שניות עד שהנושא הוא הרדים כראוי; לייעל ממשל הרדמה לשימוש בלחצן העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח בחזרה של כל עכבר הרדים ולאגף באמצעות גוזם שיער בעלי חיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 2% של 4 ethoxymethylene-2-פניל-2-oxazolin-5-אחד (שור) לתוך אתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדיםעכברים בהרדמה isoflurane כמתואר ב1.1.1 ולהחיל של 2% שור 100 μl למגולח בחזרה במספר יישומים הסידוריים של כ -20 μl כל אחד. חכה 5-10 שניות בין יישומים הסידוריים לפתרון לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל כדי למנוע שפיכת 2% פתרון השור באזורים אחרים מאשר הגב, ולחכות לפתרון לייבוש בין יישומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימים 5-7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 1% מ( שור) באתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות אך בתקיפות לשתק את העכבר בעורפו של בסיס הצוואר וזנב עם בטן כלפי מעלה וצוואר מעט מוטה כלפי מטה (בדומה לאחיזה לזריקת intraperitoneal) ולהחיל של 1% שור 100 μl לאגף המגולח במספר יישומים סידוריים ולקחת את הזמן כדי לייבש את העור לאחר מכן כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכברי שליטה, תחול רכב אתנול מוחלט 100 μl לפלאן המגולחk. </li></ol></li></ol> 2. עור הצלע קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ובלו האזור הרצוי של עור אגף (~ 25 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ של עור) עם מספריים כירורגיות 10 סנטימטרים בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין נקי, חד כירורגית, לגרד ממנו את עודפי השומן ורקמת חיבור של עור האגף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 חתיכות של עור אגף מן 3 עכברים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר RT HBSS [עם פנול אדום, ללא סידן או מגנזיום, 5 מ&quot;מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 10 מ&quot;מ 4 (2-hydroxyethyl) -1- חומצת piperazineethanesulfonic (HEPES), ו -10% בסרום שור עוברי (FBS)]. </li></ol> כביסה רקמות 3. טרום עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף תקופת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התוכן של הצינור באמצעות מיקרומטר 70מסננת כדי לבטל את החיץ לשטוף ולאסוף את הרקמה. מסננת אחת ניתן לעשות שימוש חוזר בכל ההליך כולו בתוך קבוצת טיפול ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, להעביר את עור האגף מן המסננת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 10 מיליליטר של תקשורת טרי, RT HBSS (המכיל EDTA, HEPES, וFBS כפי שתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג 12.5 סנטימטר של מספריים לנתח ניתוח השקוע לתוך הצינור, ברר בכל פיסת עור אגף כך שפיסת הרקמה הממוצעת היא כ 2.2 מ&quot;מ x 2.2 מ&quot;מ באזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה </li></ol> 4. Collagenase עיכול של עור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התוכן של הצינור דרך מסננת 70 מיקרומטר, לאסוף ולהעביר את חתיכות עור אגף לתוך צינור חדש 50 מיליליטר חרוטי המכיל 10 מיליליטר fresh, תקשורת RT HBSS בתוספת 0.7 מ&quot;ג / מיליליטר collagenase ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום מכיל בינוני עיכול ושברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכן מערבולת של צינור במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכן מסנן של צינור דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש; לשמור על הזרימה דרך מכיל רקמה מתעכל וזורקים את המסננת ולאגף עור פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הזרימה דרך 50 מיליליטר של תקשורת HBSS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 גרם, ולמזוג supernatant. </li></ol> צנטריפוגה שיפוע 5. צפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 3 מיליליטר 67% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות RT במלח 1X פוספט (PBS) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר RT 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בHBSS עם פנול אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ֶנטֶלמֶןשכבת ly 5 מיליליטר של 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות המכילה את התאים על גבי 67% מדגם תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בעזרת פיפטה סרולוגיות. הקפד להגדיר pipettor למהירות האיטית ביותר, ולמקם את פיפטה לאורך הקיר של צינור חרוטי. היזהר שלא ללחוץ, לשבש, או להפוך את השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההאצה נקבע להגדרה הנמוכה ביותר, להתנתק הבלם, ו צנטריפוגות השיפוע ב931 XG במשך 20 דקות ב RT ולוודא כי צנטריפוגות היא מאוזנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את השיפוע מצנטריפוגות, ועדינות להעביר לספסל המעבדה מחזיק הצינור זקוף. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק 5 מיליליטר, להסיר את שכבת התאים בממשק של תקשורת 44% ו 67% שיפוע צפיפות צנטריפוגה והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. אם הממשק הוא לא נראה לעין, פשוט להסיר על 2 מיליליטר של נוזל בגבול 67% -44%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור חרוטי המכיל תאים מinterface עם 2% FBS בPBS קר כקרח 1X, תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG, ולמזוג supernatant. הערה: זו הפעם הראשונה שיכולים להיות מקוררים התאים / שמרה קרה מאז צעדי עיכול הם על 37 מעלות צלזיוס וצעדי תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות הם ב RT. ניתן להשיג דילול 1 Trypan כחול ורוזנים ומידע כדאיות בנקודה זו: ניתן resuspended תאים ב1. </li></ol> 6. חסימה ומכתים לניתוח תזרים cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק FcγRII / קולטנים שלישי בתאים כדי למנוע הכתמת נוגדן שאינו ספציפית. לניסויים שתוארו כאן, לעשות תערובות אדון הנוגדן בPBS עם 2% FBS המכיל 1: 100 דילול של נוגדן unconjugated נגד CD16 / 32 (2.4G2) כדי לאגד ולחסום קולטני FcγRII / III. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים חסומים בתערובות אדון מתאימות של נוגדנים נגד CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), וLy-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), כמו גם כתם מבריק ויולט 510 חי / מת לזהות תאים מתים. להשתמש בכל הנוגדנים או בדילול מומלץ על ידי יצרנים או בעבר מותאם על ידי חוקרים. לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בכל הנוגדנים בשעת 1: 100 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים וגלולים בμl 50 חיץ מכתים 1X PBS עם 2% FBS. שמור על קרח עד שניתן לרכוש נתוני הקרינה על cytometer זרימה. הערה: חשוב לי פרמטרים פיצוי מראש מותאמים עם רקמת הלימפה ואנטיגן שטח פני תא משותף (כמו CD4 או CD8) לפני הרכישה של נתוני הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיל את מספר התאים לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח, לרכוש נתונים מדגימות כל תאים מוכתמים. </li></ol> 7. ניתוח cytometry זרימת נתונים תוך שימוש בשיטות רגילה כדי להשיג את הצעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, שער באזור הלימפוציטים של הפיזור קדימה(אזור) על ידי צד פיזור עלילה (אזור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות הפיזור קדימה (רוחב) על ידי צד פיזור (רוחב), כדי להימנע מניתוח כפילויות. זה גם יכול להיות מושלם עם גובה פיזור קדימה על ידי עלילת גובה פיזור צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, שער על שושלת (CD11b, CD11c, וCD45R / B220) -שלילי וCD3 חיובי אירועים, להוציא מקרופאגים, תאים דנדריטים, ותאי B, בהתאמה, ולתחום ניתוחים לתא תא T, אם המטרה היא, כפי שהוא כאן, על מנת להעריך חדירת תאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, שער על תאי חיים שלא לכלול את הכתם החי / מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, שער על אוכלוסיית התא של עניין (ראה סעיף תוצאות נציג). </li></ol>

<ol>
	<li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010:+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions.">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li><li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model:+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis.">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li><li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+psoriasis.">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Innate+Immunity.">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention.">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li><li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells.">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li><li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche.">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li><li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-&#915;+for+autoreactive+CD8++T+cell+accumulation+in+the+skin.">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-&#915; for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).</li><li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions.">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue.">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li><li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis.">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li><li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells:+The+effect+of+trypsin.">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis.">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).</li><li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells.">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).</li><li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice.">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673 (2013).</li><li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation:+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood.">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li><li>Thomas, M. L., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family.">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li><li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice.">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li></ol>

יש הסופרים לא כספיים או אחרים אינטרסים לחשוף.

אפיון שינויים בכדוריות דם לבנות עור-תושב במודלים של מכרסמים של מחלות עור כגון אטופיק דרמטיטיס או פסוריאזיס הוא חשוב להבנת קשרים בין מכניסטית זרם תא הדלקתי ופתולוגיה מחלה. כאן אנו מתארים טכניקה חסכונית לבודד את כדוריות דם לבנות מרקמת עור עם ציוד בסיסי שנמצא ברוב מעבדות מחקר ביו-רפואיות. טכניקה מהירה יחסית זה תמנע את השימוש במכונות רקמה יקרה ניתוק וצינורות מותאמים אישית וריאגנטים, עוזרת לשמר משאבים תוך מזעור ידיים על זמן על ספסל המעבדה. האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה להסיר את רוב תאי האפיתל ופסולת, והתאים המבודדים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים ניתוח התזרים cytometric, מיון תא, העברה, תרבית תאים ובמבחני גירוי חוץ גופית. יש אנזימתי לעכל עם Collagenase D אין כל השפעה על שלמות T פני תא סמן, וpreserכדאיות תא Ves. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות לעבד עור מאזורים אחרים מאשר האגף. השלבים הקריטיים ביותר בהליך זה הם 1) הסרת יסודיות כל שומן ורקמת חיבור בעת קצירת העור, 2) טיפול ועיבוד רקמות במהירות כדי למקסם את חדירת תשואת תא תוך מזעור מוות של תאים, 3) בעדינות שכבות הצבע, ו- 4) בזהירות חילוץ הממשק של השיפוע. לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדולה, חשוב לתרגל שכבות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות והסרת ממשק. אפשר לתרגל תאי קציר משיפוע צפיפות רציף על ידי ריסוק טחול עכברי כל דרך מסננת 70 מיקרומטר למאגר מכתים 1X PBS וביצוע שיפוע הצפיפות כפי שתואר לעיל בשלב 5. זה הרבה יותר קל לראות ולחלץ את הממשק בין תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 44% ובתקשורת 67% צנטריפוגה שיפוע צפיפות באמצעות splenocytes, בשל המספר הגדול של תאים חיסוניים הנוכחיים. כאשר עובדים עם מילויים צפיפות, יש להימנע בועות תוך pipetting, וצריכים להיות ממוזערים שיבושי שיפוע. צינור חרוטי המכיל את השיפוע צריך להיות מטופלים בעדינות והחזיק אנכי בכל העת. פתרונות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות תמיד צריכים להיות ב RT, pipettors סרולוגיות להגדיר למהירות האיטית ביותר האפשרית השחרור, צנטריפוגות שמרה על RT, מוגדרת נמוכה ההאצה עם הבלם התנתק, וזהירות מאוזנת לפני ספינינג. כאשר עובדים עם הכנות עור שתנבנה מספרים קטנים של לויקוציטים הסתננות, תאים לא תמיד נראים לעין בממשק השיפוע. לפיכך, חשוב לעשות 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות עם HBSS המכיל פנול אדום כך שניתן דמיין את הממשק בקלות גם כאשר שכבה של תאים לא ניתן להבחין. בנוסף, חשוב להיות עדין אבל מהיר כאשר חילוץ, כביסהועיבוד רקמות עור כדי למנוע מוות של תאים לפני העור ממוקם בתקשורת HBSS. אם כדאיות תא או טוהר הוא נמוכות, פעמים עיכול קצר יותר (~ 20 דקות), ריכוזים נמוכים מעט של D collagenase (~ 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר), או לטחון את הרקמה יותר דק עשויות להיות מועילות. בגלל עשוי לתרום על-עיכול ופירוק של רקמה למוות של תאים, חוקרים יצטרכו לייעל את זמן עיכול המינימלי המספק גודל מספיק גדול מדגם תא 17. התהליך צפוי לדרוש כמה סיבובים של אופטימיזציה בידיהם של חוקרים פרטיים כדי לתקן את הטכניקה. רמת פעילות D Collagenase עשויה גם להשתנות בין המון ייצור והתאמות לזמן עיכול תצטרך להתבצע לכל מנה של אנזים בשימוש. במהלך אופטימיזציה, חשוב השעיות התייחסות כתם תא (למשל טחול) מטוהרות עם ובלי האנזימטית לעכל צעד עם כתם מת אמין חי / כמו גם תא חיסון ליןסמני eage (למשל CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, וכו &#39;) כדי לוודא שאוכלוסיות תאים וסמנים של עניין משטח נשמרים בתהליך עיכול רקמה. במידת האפשר, כדאי לבצע אופטימיזציות על cytometer זרימה שיכולה למדוד קדימה ורוחב צד פיזור או גובה, כמו גם אזור, להוציא אגרגטים תא. לבסוף, יש לבחון השעיות התא תחת מיקרוסקופ האור להערכה חזותית של כדאיות ומורפולוגיה תאית כללית. ניתן לספור את התאים באופן ידני באמצעות 0.4% הדרת צבע Trypan הכחול תחת מיקרוסקופ אור או על cytometer זרימה באמצעות חרוזים ספירה. ללימודים שדורשים כימות מחמיר יותר של סוגי תאים מסוימים ברקמה הניכרת, חוקרים יכולים לשקול או למדוד את עוצמת הקול של שברי רקמה לפני ואחרי עיכול, ולהשתמש במידת העיכול להעריך בצורה מדויקת יותר מספרים של תת תא הנוכחיים ביצור הרקמה מְנוּתָח. מגבלה אחת של זהפרוטוקול הוא שהוא מותאם במיוחד לטיהור של תאי מערכת חיסון. אם מישהו מעוניין בבידוד, טיהור, וניתוח של אוכלוסייה אחרת סלולרית (למשל עור תאי אפיתל), הגדרת שיפוע צפיפות והאנזימטית לעכל פרוטוקול שניהם סביר צריך להיות שונה ומותאם לבודד הטוב ביותר התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה מאפשר בידוד וטיהור של שני תת תא הלימפה ומיאלואידית ולכן יכול להיות מותאם ליישומים החיסוניים ביותר. מגבלה נוספת היא שפרוטוקול זה אינו יכול לשמש להבחנה בין אוכלוסיות תאים שחדרו דרמיס לעומת האפידרמיס של העור. כדי להשיג רמה זו של בידול, פרוטוקול זה היה צריך להיות מותאם נוסף בצעדים נוספים על מנת להפריד בין אנזימי הדרמיס והאפידרמיס לפני או במקום הצעדים המפורטים כאן. כאן, דגימות נאספו מ~ 3 עכברים כדי להקל על ניתוח התזרים cytometric רב פרמטר ולכן קשהלזהות השתנות בין משכפל ביולוגי. עם זאת, בהתאם ליישום במורד הזרם של בחירה, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות להניב ודוגמאות שימוש מנושאים בודדים. לבסוף, הפרוטוקול מובא כאן לצעירים, נקבות עכברי ND4 ייתכן שיהיו הצורך לשנות לעכברים בגילים שונים, מין או זנים בהתאם לצרכים של חוקרים. לסיכום, השילוב הזה של האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה מספקת שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית של טיהור תאים חיסוניים מנגעים בעור דלקתיים בעכברים. ניתן להשתמש בו ומותאם באופן רחב על פני מגוון רחב של מודלים של מכרסמים של פתולוגיות עור ככלי נוח להערכת חדירה חיסונית ולבודד אוכלוסייה טהורה, בת-קיימא של לויקוציטים ליישומים במורד הזרם.

בעיות עור הנעים בין דלקת עור ממגע, אקזמה, פסוריאזיס, צלוליטיס, זיהומים פטרייתיים ומורסות לסרטן העור שאינו מלנום נמצאו להיות בין 50 המחלות הנפוצות ביותר בעולם, והסיבה הרביעית המובילה העולמית של מחלות שאינן קטלניות בשנת 2010 1. בהתאם לכך, החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס מחלות עור שונים הוא אזור חיוני ופעיל של מחקר. מודלים של מכרסמים היו להפליא שימושיים בהבנה של מצבי עור דלקתיים כגון אטופיק דרמטיטיס 2, 3 פסוריאזיס, או זיהום Staphylococcus aureus 4. פרוטוקולים זולים, יעילים, ופשוט לעיכול אנזימטי של רקמת עור עכבר יכולים לספק הכנות של תאים שיכולים לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עור טוב יותר. הנה, שיטה פשוטה וחסכונית מתוארת להאנזימטית תקציר של עור עכבררקמה ובידוד של לויקוציטים הסתננות עור שיכול לשמש לתרבית תאים, in vivo העברת מאמצת, ניתוח תזרים cytometric ומיון או מחקרי ביטוי גנים. המטרה הכללית של הליך זה היא להכין השעיה תא בודדת של כדוריות דם לבנות-הסתננות עור עם כדאיות תא גבוהות תוך מזעור עלויות הקשורות בדרך ערכות מגיב מותאם אישית וdissociators המכני. שיטות ניתוק רקמת עור קיימות 05-07 מאי לגרום לשלמות סמן כדאיות תא ומשטח נמוכה, או לדרוש ערכות אנזים מותאמות אישית ומכונות דיסוציאציה הרקמה יקרה 8-11. בעוד העיכול של רקמת עור אוזן עכבר הוא נפוץ למדי 12-13, לעכל רקמת עור keratinized מאוד (למשל מהאגף) יכול לגרום להכנות תא מזוהמות בכמויות גדולות של פסולת בלתי תאית. במחקר שנערך לאחרונה, זייד ועמיתים מתעכלים עור אגף עכבר על 90 דקות ב2.5 מ&quot;ג / מיליליטר dispase, folloנישא ב -45 דק &#39;ב 3 מ&quot;ג collagenase / מיליליטר 7. במחקר אחר, חוקרים אלה משמשים incubations מרובה עם עיכול שילוב של 2.5 שעות, כוללים השימוש בטריפסין / EDTA, collagenase III, וdispase 5. השימוש בטריפסין אינו מומלץ לעיכול עור האנזימטית, כטיפול עם טריפסין מיצרנים שונים הוכח להשפיע מדידה השלמות של חלבונים בתא שטח בתאי יונקים 14-15. בנוסף, dispase יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולות שגשוג של תאי CD4 וCD8α T ולהשפיע שפע פני השטח של לפחות 20 מולקולות, כולל סמני הפעלת תא T הנפוץ כגון CD62L 16. פרוטוקולים אחרים משתמשים RPMI 1640 במדיום העיכול 6. עם זאת, הנוכחות של Mg 2 + Ca 2 + בRPMI יכולה לגרום לתא נרחב צבירה 17. פרוטוקול אידיאלי לניתוק רקמה צריך לשאוף לכדאיויות תא גבוהות, נמוכותהרמות של צבירת תא, ונזק מינימאלי לתא חלבוני פני השטח. הכנות תא סטרומה הבלוטה לימפה באיכות גבוהה שהושגו עם פרוטוקולים המשתמשים incubations אנזים קצר יותר, 2 + תקשורת חופשית Ca 2 + וMg, ולהימנע מטריפסין וdispase 18. עם זאת, פרוטוקולים מסוג זה לא נקבעו לניתוק של עור עכבר כולו. כאן, פרוטוקול מתואר לנתק, לבודד, ולהעשיר את כדוריות דם לבנות-הסתננות עור מעור אגף עכבר-תיגר אלרגן. בקצרה, עור נכרת הוא-מודגרות מראש במאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) עם 10% בסרום שור עוברי עבור שעה 1 כדי לרכך את הרקמה לעיכול ולהסיר את כל רקמת עור או שומן עודף מת. זה ואחריו צעד עיכול אנזימטי 30 דקות עם 0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל collagenase ד Collagenase D יש השפעות מינימליות על צפיפות של סמנים פני תא, ואין כל השפעה על התפשטות תאי T במבחנה 16,18, שהופך אותומתאים מאוד ליישומים הכוללים אפיון של חלבוני פני השטח. בעקבות עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה הייתה משמשת להסרת תאי אפיתל ופסולת מהשעית התא הבודד ולהעשיר לתאי hematopoietic. חשוב לציין, בהליך זה ימנע ריאגנטים יקרים מבוסס עמודת תא מגנטי הפרדה וניתוק מכונות רקמה 8-11, וניתן לבצע עם ציוד וחומרים הנמצא במעבדת מחקר ביו-רפואית בסיסית. הנה פרוטוקול זה שימש כדי לבודד לויקוציטים מעור אגף פעמים תיגר שלוש עם oxazolone hapten (השור) בעכברי ND4 השוויצריים רגישים בעבר (המותאם מ 19). תאים נותחו באמצעות cytometry זרימה רב-פרמטרית. טכניקה זו הניבה השעיה תא עם מינימאלית פסולת ו&gt; כדאיות 95% של לימפוציטים המבודד שנותחו על ידי זרימה רבת-פרמטרית cytometry למדוד את החדירה של לימפוציטים מסוג T ונויטרופילים לsk המושפעב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1213">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">55021C</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">EDTA disodium salt solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E7889</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td>
			<td style="width:179px;">MidSci</td>
			<td style="width:181px;">S01520HI</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile until day of usage.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Percoll, pH 8.5-9.5 (25&#176;C)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P1644</td>
			<td style="width:396px;">Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:457px;">Trimmer Combo Kit</td>
			<td style="width:179px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:181px;">CL9990-1201&#160;</td>
			<td style="width:396px;">Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">E0753-10G</td>
			<td style="width:396px;">Dissolve in 100% EtOH at 50&#176;C for 15 minutes on a rotating plate.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:457px;">Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">70-0161</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:457px;">anti-CD3e-BV650 (145-2C11)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">564378</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">47-0042-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD8a-BV785 (53-6.7)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">100749</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0112-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0114-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD44-BV711 (IM7)</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">563971</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45-FITC (30-F11)</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">35-0451-U025</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td>
			<td style="width:179px;">eBioscience</td>
			<td style="width:181px;">48-0452-80</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">104431</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td>
			<td style="width:179px;">BioLegend</td>
			<td style="width:181px;">108407</td>
			<td style="width:396px;">Antibody used to stain cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">Ghost Dye-BV510</td>
			<td style="width:179px;">Tonbo Biosciences</td>
			<td style="width:181px;">13-0870-T100</td>
			<td style="width:396px;">Viability dye for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:457px;">LSR Fortessa</td>
			<td style="width:179px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td style="width:396px;">Cell analyzer (18 parameters)</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:457px;">Collagenase D from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:179px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:181px;">11088858001</td>
			<td style="width:396px;">Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&#160; Store immediately at -20&#176;C for up to six months.</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:457px;">ND4 Swiss female mice</td>
			<td style="width:179px;">Harlan</td>
			<td style="width:181px;">0-32</td>
			<td style="width:396px;">8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#39;s IACUC guidelines.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Collagenase D טופל splenocytes מראה רמות דומות של α CD4 ו CD8 על תאי T בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה בתקשורת ראשית, כל השפעות פוטנציאליות של collagenase D בשפע התדירות ופני שטח של סמני שושלת והפעלה בתת תא T הוערכו באמצעות רקמת הלימפה משנית כביקורת. השעיה של splenocytes התקבלה מעכברי ND4 ורחצה עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS. לאחר מכן, מחצית התאים נתון של 0.7 מ&quot;ג / מיליליטר Collagenase D (כמתואר בסעיף 4 לעיל). התאים הנותרים היו resuspended במדיום HBSS שליטה. בשלב הבא, שני שברי splenocyte עובדו באמצעות שיפוע צנטריפוגה צפיפות כפי שתואר בסעיף 5 לעיל. תאים אז היו מוכתמים בנוגדנים נגדן CD4 וCD8α, ונותחו על cytometer הזרימה. אחת, לחיות, CD45 +, שושלת שאינו T - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + תאים היו מגודר לניתוח, שלא לכלול תאי B, מקרופאגים, תאים דנדריטיים. חלבוני CD4 וCD8α התגלו באותה מידה על פני השטח של splenocytes שהיה נתון לcollagenase עיכול D ואלה שלא נחשפו לאנזים עם כ -60% מסוג CD4 + CD8α - תאים ו -30% CD4 - CD8α + תאים מזוהים גם עם טיפול ( איור 1 א). לכן, collagenase D לעכל לא השפיע על השכיחות היחסית של CD4 וCD8α. העוצמות שלהן CD4 ויחידות הקרינה ממוצעת גיאומטרי CD8α (gMFI) בתת אלה היו גם להשוות בין שני הטיפולים; ערכי gMFI לCD4 היו 2,271 לבהתאמה טופל אנזים ו2,243 לsplenocytes שליטה, וערכי gMFI לCD8α היו 536 לטופלו אנזים ולsplenocytes 520 שליטה. טיפול אנזימתי גם לא היה השפעה על הצפיפות של הפעלת תא T משטח סמני CD44 או CD62L על תאי CD4 + T (איור 1). ערכי עוצמת הקרינה ממוצעים גיאומטריים לCD44 היו 669 לטופל אנזים ולsplenocytes 654 שליטה; ערכי gMFI לCD62L היו 1,523 לטופל אנזים ו1,517 לsplenocytes שליטה. כעיכול Collagenase D שומר על השלמות של חלבוני פני השטח בתאים מבודדים, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בביטחון לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח. עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בכדאיות סלולרית גבוהה תשואת תא וכדאיות אחוזים מהשעית התא השיגה מעל הוערכו באמצעות הדרת צבע Trypan הכחול 20. פרוטוקול הפרדת עיכול ושיפוע זה הניב כ -250 תאי קיימא חיסוניים למ&quot;מ 2 של רקמת אגף בעכברי תיגר-שור ועל 4 תאים חיסוניים קיימא למ&quot;מ 2 של רקמה בעכברים-תיגר רכב<html> שרגיש בעבר עם שור (טבלה 1). עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בהתאוששות חזקה של תאי מערכת חיסון בשלב הבא, במידה של חדירת חיסון בעור נקבעה על ידי ניתוח השפע של חלבוני פני השטח CD45 על תאים מבודדים מהאגף של שור-תיגר ועכברים שליטה להעריך התאוששות של תאים חיסוניים-הסתננות עור באמצעות השיטות שתוארו כאן. CD45 הוא סמן שושלת פאן-hematopoietic 21. 95% מנמוכים קדימה וצד-פיזור, תאים בודדים (gating לא מוצג) בעכברי תיגר-שור ו -71% של תאים אלה בבקרה-תיגר רכב היו CD45 + תאי חיים (איור 2). גידול של פי 67 ~ בתאי CD45 + חיסוני חדירה זוהה בעור האגף הבא 3 אתגרי שור יומיים באמצעות ההליך המתואר במסמך (טבלת 1). s = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within-page =&gt; שלושה אתגרי שור אגף &quot;1&quot; לגרום לחדירה בולטת של תאי T ונויטרופילים הטכניקה שלנו הניבה אוכלוסיית תאים מעור אגף שיכול לשמש כדי לזהות מגוון של מיאלואידית ותת תא הלימפה כמו-1 + Gr נויטרופילים 22, תאי CD4 T ותאי T CD8α. אנו נצפו ~ פי 6, 7 ~ פי, ו~ עליות 73 פי בנויטרופילים, תאי CD4 T, ותאי T CD8α, בהתאמה, לאחר 3 אתגרים יומיומיים שור (טבלת 1). חישבנו עליות אלה על ידי הכפלת המספר הכולל של תאי קיימא שהושגו (נספר באמצעות הרחקת trypan כחולה) על ידי אחוז של בר תא החיסון ניתנו מחוץ לשער תאי קיימא במהלך ניתוח התזרים cytometric. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים חיסוניים הכולל קיימא, Gr-1 +, מסוג CD4 +, או CD8α + תאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים המקביל לעכברי שליטה ברכב, שנתן לנולקפל עלייה בתת הלימפוציטים. GR-1 + נויטרופילים היוו 42% מCD45 היחיד, חי + B220 - CD11b - CD11c - תאים בעכברים שטופלו-שור ו -10% מאוכלוסייה זו בעכברים שטופלו EtOH (איור 2). בעכברים שטופלו-שור, ~ 52% של תאי CD3 + T מגודרות היו CD8α + ו~ 34% היו מסוג CD4 +, ואילו בפקדי רכב, ~ 9% מתאי T היו CD8α + ו -57% היו מסוג CD4 + (איור 2 ג) . לכן, עם הטכניקה שתוארה כאן, עור אגף אלרגי ולא אלרגי יכול להיות מעובד להניב השעיות תא בודדות מתאימות לאפיון התזרים cytometric ברזולוציה גבוהה של חדירה תת תא חיסון. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאים תת עור מאגף העכבר </td><td> שור / שור (3) </td><td> השור / EtOH (3) </td><td> מקפלים הרחבה (שור / Ethanol) </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> למ&quot;מ 2 רקמות </td></tr><tr><td> מספר כולל של תאים </td><td> 262.7 </td><td> 5.3 </td><td> 49.3 </td></tr><tr><td> תאי CD45 + חיסוני </td><td> 250.7 </td><td> 3.8 </td><td> 66.7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 - תאים </td><td> 6.5 </td><td> 0.9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> CD4 - CD8 + תאים </td><td> 10.6 </td><td> 0.1 </td><td> 72.9 </td></tr><tr><td> נויטרופילים </td><td> 8.6 </td><td> 1.5 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. תשואות ניידים מעור אלרגי אגף בנקבות עכברי ND4. תאי קיימא מבודדים מעור האגף נספרו באמצעות הרחקת Trypan הכחולה, ומנורמלים לתאים / מ&quot;מ 2 רקמות המבוססות על השטח של העור מבודד ומספר העכברים ונקווה לTISלתבוע הכנה. חישבנו כוללת תשואת תא חיסון המבוסס על זיהוי של CD45 hematopoietic אנטיגן על פני התא, ותשואות משנה הלימפוציטים המבוססים על סמני משטח שושלת ספציפית. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים לעכברי שליטה ברכב, נותן לנו לקפל עלייה בתת הלימפוציטים. הנתונים שמוצגים לייצג נתונים ונקווה 2-3 עכברים בכל טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> איור 1. טיהור מערכת עיכול ואנזימי שיפוע של splenocytes לשמר תת הלימפוציטים וסמני הפעלת תא. Splenocytes שטף עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS, הודגרו עם או D collagenase או תקשורת HBSS לבד ומטוהר באמצעות שיפוע צפיפות כדי להסיר שאריות ותאי דם אדומים. תאי T זוהו כחי, CD45 +, שושלת (B220, CD11b, CD11c) &lt;sup&gt; -, וCD3ɛ +. התדר של CD4 ותאי T CD8α לא השתנה לאחר עיכול אנזימטי (). צפיפות שטח של CD44 וCD62L על תאי CD4 + T לא השתנתה בעקבות עיכול אנזימטי (B). הנתונים המוצגים מייצגים אספו נתונים 2-3 עכברים לטיפול מניסוי בודד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> איור 2. עיכול האנזים וטיהור שיפוע של תאי עור לחשוף חדירה חיסונית מובהקת בשליטה לעומת עור אגף עכבר-תיגר אלרגן. שלושה אתגרי שור האגף לייצר גידול ~ 67 של פי תאים חיסוניים-הסתננות עור בעכברי ND4 השוויצרי רגישים בעבר ( ). שלושה אתגרי שור גם provאישור מאיזה עלייה ~ פי 6 בGr-1 + נויטרופילים (ב &#39;), ו~ 73- ועלייה של 7 פי ~ של תאי CD8α + CD4 + T ו, בהתאמה (C). CD45 חי + תאים חיסוניים הם מגודרת מתאי פיזור יחידים, נמוכים קדימה וצד; נויטרופילים ותאי T מגודר מB220 - CD11b - CD11c - תאים בודדים חיים. ספירה בוצעה באמצעות דילול 1: כחול Trypan 1 הבא הפרדת צפיפות שיפוע. הנתונים שמוצגים מייצג אספו נתונים 2-3 עכברים בכל קבוצת טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation at JoVE.com

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Views.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

Video: Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...