Name: in vitro assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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This work was supported by NIH grants ARRA RO3 AI078145 and 1SC3GM113743 to RZ.

1.細胞抽出物の準備<ol><li> 20mMのpH7.4のHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのヘムを補充した1×M199からなる培地中で26ºCで気密キャップで密封滅菌プラスチックボトルにリーシュマニア細胞を増殖させます振盪せずに、0.35グラム/ LのNaCO 2 H、0.1mMのアデニン、および2 / mlのビオプテリン。これらは1〜2×10 7 / mlの細胞密度に達したときに4ºCで5分間1,500 gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li>ピペットで上清を捨て、冷リン酸緩衝生理食塩水（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKClを文化のボリュームの半分に血清学的ピペットで細胞ペレットを再懸濁することによって細胞を洗浄、10 mMのの Na 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4の）。 BL2の安全ガイドラインに従って、細胞上清を廃棄してください。 </li><li> 4ºCで5分間1500グラムで再び遠心細胞。ピペットで上清を捨てます。トンを続行次のステップOまたは（3ヶ月まで）-80ºCで長期保存のために液体窒素中で細胞ペレットを凍結スナップ。 </li><li> 2X溶解バッファー（0.5Mスクロース、0.1MのトリスHCl、pH7.5の、2mMのEDTA、および2倍プロテアーゼ阻害剤カクテル）を準備し、氷上で4ºCで保管してください。 </li><li> 2X溶解緩衝液の等量（新鮮または凍結した）細胞ペレットを再懸濁します。ガラスビーズの1倍のボリュームを追加します。 10分間4ºCで激しくボルテックス。 </li><li> 1×溶解バッファーの2容量を加え、混合します。破壊されていない細胞および核をペレット化するために10分間、4ºCで1,500×gで遠心分離細胞抽出物。 </li><li>新鮮なクールな遠心管にピペットで上清を移し、実験終了まで氷上で細胞抽出物を保持します。 </li></ol> 2.このようなビシンコニン酸アッセイなどのタンパク質推定キットを用いて細胞抽出物のタンパク質濃度を決定します<ol><li> S（II）、BCAと銅を混合することにより、ビシンコニン酸（BCA）溶液（1ミリリットル/チューブ）を準備49の比でulfate：1（v / v）です。 </li><li> BCA溶液1mlアリコートに10 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を希釈することによって、0のタンパク質標準を準備10、20、30、40、50、および60μgの/ mlでした。 </li><li>重複でBCA溶液1ml中の細胞抽出物の2μLを加えます。予め温めておいた60℃の水浴中で10分間、標準およびタンパク質サンプルをインキュベートします。 </li><li>転送サンプルを3分間氷に。 562ナノメートルの波長で分光光度計を用いて基準とタンパク質試料の吸光度を測定します。 </li><li>製造業者のプロトコルに記載されているように参照としてBSA標準を使用して細胞抽出物のタンパク質濃度を計算します。 1×溶解緩衝液で10mlのMG /タンパク質濃度まで細胞抽出液を希釈します。 </li></ol>チューブあたり200μl中3酵素アッセイ注：化学フードで次の手順を実行します。 <ol><li> 15ミリリットルの重複の各サンプルをテストコニカルチューブ。チューブあたり20μlの1 MトリスHCl pHが7.5を用意し、氷上で保管してください。クロロホルム/メタノール2mlを調製（1：1（V / V）溶液停止）を各チューブのための室温​​です。 </li><li>ピペットで氷の上の各15ミリリットルコニカルチューブ中の1MトリスHCl pH7.5の20μlの。 </li><li>ここで上から放射線安全ガイドラインに従ってください。 SAMの50.06μMの合計チューブあたり[メチル- 3 H]アデノシル-L-メチオニンおよび50μM冷たいSAM - 0.06μM（0.2μCiの）Sと同等のものを追加します。冷水μlの追加xここで、x = 200-（20（+細胞抽出物のための20（）+寒さと放射性SAMのボリューム）バッファ用）チューブあたり。 </li><li>予め温めておいた30ºCの水槽に各コニカルチューブに移します。反応を開始するために各チューブに細胞抽出物（タンパク質200μgの相当）の20μLを加えます。所望の時間（0〜45分）インキュベートします。 </li><li>クロロホルム/メタノール2mlを加えて反応を停止し（1：1、V / V、停止液）を各チューブにします。 RT（20〜25にコニカルチューブを転送6; C）。 </li></ol> 4.脂質抽出注：化学フードで次の手順を実行します。 <ol><li>酵素反応試料を含む各チューブに水700μlを添加します。 30秒間激しくボルテックス。 RTで5分間1,500×gで遠心分離し、水相から有機を分離します。 </li><li>ピペットで新しい15ミリリットルコニカルチューブに低い有機相を転送します。 30秒間激しくボルテックスチューブとを含む各「下相」への水の1ミリリットルを追加します。遠心分離は、再び5分間1500×gで水相から有機を分離しました。 </li><li>ピペットを用いてシンチレーションチューブに低い有機相を転送します。 N 2気流下で乾燥したサンプル。放射線のガイドラインに従って非取り込まれた放射性SAMを含む水相と放射性コニカルチューブを廃棄してください。 </li><li> 2ミリリットル/シンチレーション液のチューブを追加します。シンチレーションCOUに取り込まれた放射能を測定しますメーカーのプロトコルと、機器の用途に応じてNTER。 </li><li>以下の一般式を使用して、ナノモル/ mgのタンパク質における酵素活性を計算します。 CPM値は×10 3×[SAM（MM）の合計（放射性およびコールド）濃度]放射性SAM（CI /ミリモル）xの×5特異的活性[放射性SAMの濃度（mM）の] 注：上記のプロトコルは、依存のSAM濃度またはタンパク質依存PEMTアッセイのために変更することができます。 SAM濃度依存的酵素アッセイについては、時間（線形範囲内である15分）、一定に維持され、タンパク質依存PEMTアッセイ、SAM濃度（ここでは0.05 mMのを選んだ）と時刻ながら冷SAMの種々の量をアッセイに添加します（15分間）一定に保たれます。また、緩衝液のpHは、いくつかのPEMT酵素は異なる最適なpH値を持っている場合、必要​​に応じて変更することができます。 </li></ol>

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興味のある競合が宣言されていません

この単純な、迅速なPEMTアッセイは、タンパク質源として、全細胞抽出物を使用して、PE上にSAMからの放射性のメチル基の転移に起因するPEのメチル化形態の定量化を可能にします。これは、高速の敏感な、再現性、および精製された酵素を17にも適しています。興味のメチルトランスフェラーゼは、これらの基板にではなく、PE 12,13,18,19に固有である場合モノメチルまたはジメチル-PEは、アッセイに追加することができます。精製PEMT酵素が使用される場合、PEがアッセイに添加することができます。このプロトコルの制限は、アッセイは、反応生成物（モノ-PE、ジメチル-PE、またはPC）を識別していないということです。 20,21で説明したようにしかし、反応生成物の同一性（モノメチルPE、ジメチルPE、PC）は、さらに、1次元薄層クロマトグラフィーによって分析することができます。さらに、このようなSの -adenosylhomocysteine ​​及び5&#39;-メチルチオなどのSAMの分解生成物のいくつかはPEMT活性Bを阻害することができますYフィードバック阻害。しかし、 リーシュマニアは、S はアデニンと S -ribosylhomocysteine、およびアデニンとmethylthioribose -1-リン酸23を生成するメチルチオホスへ-adenosylhomocysteine ​​を切断、S -adenosylhomocysteine ​​ラーゼ22を有しています 。しかし、PEMT活性の阻害が生じないようにS -adenosylhomocysteine ​​ヒドロラーゼ及びメチルチオホス活動は、効率的にそれぞれ、Sの -adenosylhomocysteine ​​及びメチルチオを代謝するのに十分に高いかどうかは不明です。例では、それぞれの精製された組換え酵素の添加は、SAM分解産物24,25によるフィードバック阻害を軽減するためにアッセイに添加することができ、目的の細胞には存在しない-adenosylhomocysteine ​​ヒドロラーゼおよび/ ​​または5&#39;-メチル代謝酵素であり、S、 26。 このプロトコルには4つの重要なステップがあります。ⅰ）プロテアーゼ阻害剤カクテル粉末は、使用直前に溶解緩衝液に（ステップ1.1）に添加しなければなりません。 ii）の全細胞抽出物を、ステップ1.4の後に準備（）の後に以下の時間内で利用されるべきです。 iii）の脂質抽出工程（4.2および4.4ステップ）中に、注意が過剰なトリチウム化SAMが含ま相間または水相のいずれかの転送、およびiv）放射性Sをアリコートにしないように適用する必要がある- [メチル- 3 H]アデノシル-L-メチオニン、凍結の繰り返しサイクルとして受信すると、寒さの試薬 ​​とは、不足を説明することができるアデニンと S -pentosylmethionine 26,27,28への加水分解に続いて5&#39;-メチルおよびホモセリンラクトン、にそれを低下させる解凍します測定可能なPEMT活動。悪い全細胞抽出物はまた、無酵素活性に関与し得ます。この場合には、細胞抽出物の品質は、他の既知の酵素活性を測定することによって評価することができます。最後に、PEMT活動の欠如はPEMT専用に依拠することができますモノ-PEまたはジメチル-PEよりもむしろPEに特異的であるザイム。アッセイのモノメチルPEおよび/またはジメチルPE基質の添加は、PEMT活性を回復することができます。 代替的には、非放射性のSAM依存性メチルトランスフェラーゼアッセイは、ホモシステインの酵素的定量化、SAM 29のトランスメチレーション製品に依存すること、開発されました。このプロトコルは、正常PE特定のメチルトランスフェラーゼ活性16を測定するために適用されています。残念ながら、このアッセイは、全細胞抽出物のための精製酵素としないためにのみ適しており、いずれかの反応生成物の同一性を明らかにしません。 本プロトコルは、おそらく任意の細胞型に適用することができます。さらに、このアッセイは、肥満、食事誘導性アテローム性動脈硬化症に対する細菌感染や新規治療薬を戦うために新しい抗菌化合物を試験との関連で関心のPEMTに固有の潜在的な薬をテストするために使用することができます、およびインスリン抵抗性。

ホスファチジルエタノールアミンメチル（PEMT）酵素は、モノメチルPEを与えるためにPE、モノ-PEまたはジメチル-PE上のメチル基供与体としてのS -adenosylmethionine（SAM）を使用して、1つ以上のメチル基の共有結合を触媒ジメチルPE、および/ ​​またはホスファチジルコリン（PC）。これらの酵素は、動物細胞及び真菌におけるほぼ遍在しています。彼らはまた、いくつかの植物1および細菌の約10％、真核生物2と相互作用する特にで見つけることができます。 PEMTsはだけでなく、他の重要な細胞機能を果たすことにより、動物細胞における主要な脂質クラスのPCの生産に貢献することによって、細胞の生物学に関連します。哺乳類では、PEMTsは、主に、それらは非常に低密度リポタンパク質の正常な分泌のために必要とされる肝臓で発現され、それらはまた、食餌誘発性肥満3、アテローム性動脈硬化4に寄与し、インスリンレジストンス5。さらに、哺乳類のPEMTも低いレベルにあるが、脂肪細胞に発現し、脂肪沈着6、7に参加しています。癌発生8、9アポトーシス、及び細胞増殖10 PEMT役割も実証されています。細菌では、PEMT酵素は、正常な細胞増殖2、毒性2、および宿主植物11との共生のために重要であることが示されています。 本プロトコルの目的及び論理的根拠は、酵素を精製することなく、全細胞抽出物からPEMT活性を測定することです。二つの異なるプロトコルがPEMT活性を測定するために開発されています。最初の、そして最も一般的なものは、この記事のトピックであるPE、上に放射性SAMからトリチウム化メチル基の転移を測定します。このプロトコルは、本来understを得るために12酵母および哺乳動物細胞（肝臓）13からPEMT活性を測定するために開発されましたこれらの酵素の特異性を決定するために、これらの細胞におけるPC生合成の論理積ならびに。以降、この技術は、（15けれどもアッセイの基本的なpH値を使用して）細菌2及び原虫寄生14などの他の細胞型に適用されています。この技術は、全細胞抽出物、ならびに精製された酵素を用いて使用することができ、潜在的に任意の細胞抽出システムにも適用することができます。非放射性のアッセイはまた、Sの -adenosylhomocysteine、SAM 16のトランスメチレーション産物の酵素の定量化に依存しているように設計されています。それは放射能を含まないように後者のアッセイは、より便利かもしれないが、それは精製された酵素にのみ適しています。

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Aliquot the reagent and freeze at -20 &amp;deg;C; follow radiation safety guidelines while using this reagent</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>dilute it fresh&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass beads, acid washed, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA stock solution (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation liquid&amp;nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5&#039;-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

図1は、基質としての内因性のPEを使用して、酵素源としてリーシュマニア全細胞抽出物を用いて行った時間依存PEMTアッセイを示します。有機相中の放射能の量をシンチレーション計数によって定量しました。得られた数値を、PEに転写トリチウム化メチル基の量を計算するために利用されました。 PEMT活性は、約20分間のリニアました。それは、それがさらに15分間一定にとどまった後、約30分でプラトーに達しました。予想されるようになし、細胞抽出物は、アッセイ（ 図 2）に添加しなかった時、PEMT活性が検出されませんでした。また、この活動は、Lの阻害剤である100μMのオクタデシルトリブロマイドの存在下で廃止されました大手 PEメチルトランスフェラーゼLMJ PEM1およびLMJ PEM2 14。 PEMT活性はまた、タンパク質濃度たdependenトン、そしてこの活動は、酵素アッセイ（ 図3）に適用されるタンパク質の量に直線的に比例しました。最後に、SAM濃度依存PEMTアッセイ（ 図4）SAMの増加する濃度を試験した中で、行いました。 PEMT活性は、約0.5mmのSAM濃度でプラトーに達しました。すべて一緒に、これら四つのアッセイはPEMT活性は特異的であり、酵素を精製することなく、全細胞抽出物から測定することができることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53302/53302fig1.jpg" /> 図1時間依存PEMTアッセイ。酵素アッセイは、時間の関数としての全リーシュマニア細胞抽出物の0.2ミリグラムと重複して2回行いました。 PEMT活性は、タンパク質およびp 1mg当たりPEに転写ナノモルのメチル基のように表されますERの時間。 SAMを含有するアッセイ溶液に添加する前に：（1容量、1）時間 &quot;O&quot;は、細胞抽出物は、最初にクロロホルム/メタノールから成る停止溶液2mlと混合しました。標準偏差が示されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53302/53302fig2.jpg" /> PEMT活性を図2特異性。PEMTアッセイは、0.05 mMのSAMの存在下で15分間、二重に2回行いました。 1、0.2 mgのタンパク質抽出物。 2、無細胞抽出物; 3、0.2mgのタンパク質および0.1mMオクタデシルアンモニウムブロミド。標準偏差が示されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53302/53302fig3.jpg" /> 図3タンパク質依存PEMTアッセイは酵素アッセイは2回行いました。15分間0.05 mMのSAMに存在しない状態で（点O &#39;&#39;）またはリーシュマニアタンパク質の様々な量の存在を複製します。標準偏差が示されています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53302/53302fig4.jpg" /> 図4は、PEMTアッセイは、15分間のSAMの種々の濃度の存在下で、 リーシュマニア全細胞抽出物の0.2ミリグラムと重複して2回行った。標準偏差が示されています。

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In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

9.8K ビュー.  St John's University. The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine. 

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Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

生化学

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

免疫・感染学

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

遺伝学

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular mechanism for learning and memory. Palmitoylation regulates localization and function of many synaptic proteins including AMPA-Rs, auxiliary factors and synaptic scaffolds in an activity-dependent manner. We identified the synapse differentiation induced gene (SynDIG) family of four genes (SynDIG1-4) encoding brain-specific transmembrane proteins that associate with AMPARs and regulate synapse strength. SynDIG1 is palmitoylated at two cysteine residues located at positions 191 and 192 in the juxta-transmembrane region important for activity-dependent excitatory synapse development. Here, we describe an innovative biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest and demonstrate its utility with the SynDIG family of proteins in mouse brain lysates.

Palmitoylation entails the incorporation of a 16-carbon palmitate moiety to cysteine residues of target proteins in a reversible manner. Here, we describe a biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest in mouse brain lysates.

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

計測<em&gt;インビトロ</em酵素特性評価のための&gt; ATPase活性

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

生物学

Phospholipase Activity Assay: A Gel Diffusion Assay to Determine Phospholipase Activity in Crude Venom Extract from Anthopleura dowii

Source: Ram&#237;rez-Carreto, S., et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63630">Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we demonstrate an assay to establish the presence of phospholipase in the crude venom extract from Anthopleura dowii&#8212;a marine sea anemone. The assay utilizes an agarose gel diffusion technique, in which the enzyme phospholipase diffuses and breaks down phospholipids incorporated in the solid media in a radial manner.

ホスホリパーゼ活性アッセイ:Anthopleura dowii由来の粗毒抽出物中のホスホリパーゼ活性を測定するためのゲル拡散アッセイ

Source: Ram&#237;rez-Carreto, S., et al., Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward ...

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

要約

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リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム・ディフィシルから合成酵素の活性

計測

ホスホリパーゼ活性アッセイ:Anthopleura dowii由来の粗毒抽出物中のホスホリパーゼ活性を測定するためのゲル拡散アッセイ

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

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リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

計測

ホスホリパーゼ活性アッセイ:Anthopleura dowii由来の粗毒抽出物中のホスホリパーゼ活性を測定するためのゲル拡散アッセイ

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム・ディフィシルから合成酵素の活性