We wish to acknowledge the partners in the Helmholtz-Alberta Initiative, the Helmholtz Association and the University of Alberta, for the support resulting from participation in this collaboration. Research funding is provided by the Helmholtz Association's Initiative and Networking Fund, the participating Helmholtz Centers and by the Government of Alberta through Alberta Environment's ecoTrust program.
Dr. Tanushree Ghosh is gratefully acknowledged for her critical inputs at a number of crucial stages.

注：以下で説明するために、実験プロトコルを実行します。細菌培養プロトコルは第1節で議論されている（また、 図1を参照）。第2節では、外部添加剤を用いて培地を濃縮するためのプロトコルについて説明します。第3節では、マルチモード顕微鏡のためのプロトコルについて説明します。すべての個々の成分の重量は、化学天秤を用いて測定することができます。各溶液の体積は、体積シリンダーを用いて測定することができます。 注： - 詳細については、制度的安全事務所に相談してください。2.適切なバイオセーフティプロトコルは、セクション1のために従わなければなりません。 1.細菌培養<ol><li> 培養細菌-寒天はミディアム準備をプレート <ol><li>このようなペトリ皿、フラスコなどの機器や食材を組み立て、Tris塩基、塩酸、寒天、ミリポア水、pHメーターetc.Sterilize使用前に121℃でオートクレーブ処理することによってすべてのコンテナ。 </li><li> 0.1の1 Lを用意ミリポア水1Lで15.75グラムトリスベースを混合することによって、トリスバッファーの3 M水溶液。原液（pH 10.4）のpHレベルを低下させることのHCl 2,800μL（50％濃度）を加えます。でpH = 9を設定するには、pHメーターを使用して継続的に確認してください。 </li><li>次のように二つの部分に1Lの緩衝液を分けます。 <ol><li>この溶液800mlを取ります。 400ミリリットルずつの2つの部分に均等にそれを分割します。他の解決策8 G（NH 4）2 SO 4いずれかの解決策および16グラムの酵母抽出物を溶解します。 </li><li>ソリューション残り（の200ミリリットル）に乗り、100ミリリットルずつの2つの部分に再びそれを分けます。 2グラム（NH 4）2 SO 4 1にミックス。他に4グラムの酵母エキス4gの寒天を追加します。 </li></ol></li><li> Al箔にそれぞれのフラスコを包み、オートクレーブテープを貼付した後に、別途4ソリューションをオートクレーブ。 注：卓上オートクレーブ装置が使用される場合、体積を500ml（温度と圧力のオートに設定されるべきです的には）ボリュームの関数として指定されています。 </li><li>オートクレーブからそれらを取り出した後、ステップ1.3.1（以下）のために取って2 400ミリリットルのソリューションを設定します。 200ミリリットルのソリューションを持っているために、2つの100ミリリットルの溶液を混合。 12ペトリ皿 - 10に混合物を注ぎます。 </li></ol></li><li> 培養細菌-寒天平板試料の調製 <ol><li>冷凍庫（-80℃）から細菌株を取り外し、それを解凍することができます。適切に解凍した後、細菌株およびバイオセーフティーフードの内側に寒天プレートを配置します。 </li><li> スポロサルシナパステウリイ株式で先端に寄生する- （10μlの良い選択である0.5）が利用可能な最小寸法のマイクロピペットを選択します。ストリークマイクロピペットチップと寒天プレート。 48時間31℃で非振盪インキュベーター内部に画線寒天プレートを置きます。 </li><li> 48時間後、インキュベーターからプレートを取り外し、視覚的に単一コロニーの有無を調べます。単一のコロニーが存在しない場合には、Tに配置彼は別の24時間インキュベーター。 </li><li>単一コロニーが検出されるまで、このプロセスを繰り返します。試験の7日を超えないようにしてください。 注：単一のコロニーがあっても一週間後に表示されない場合、手順が適切に守られておらず、全体のプロセスは、ステップ1から繰り返されなければならないと結論されます。 </li></ol></li><li> 培養細菌-最終的なサンプル調製 <ol><li> 2 400ミリリットルのソリューション（トリス緩衝液+（NH 4）2 SO 4およびトリス緩衝液+酵母エキス（1.5.1）を一緒に800ミリリットルの溶液を得るために混ぜる。フラスコに、このソリューションの125ミリリットルを転送します。 </li><li>単一コロニーの高濃度の領域を同定するために、寒天プレートの表面の目視検査を行います。静かにナッジおよびマイクロピペットチップを用いてコロニーの一つを破ります。 </li><li> 125ミリリットルのフラスコに、同じマイクロピペットチップを浸しや転属堅牢な乗算のための細胞の十分な数を確保するために徹底的にそれをかき混ぜます。 3日 - 2、150 rpmで、30℃の振盪インキュベーター中でフラスコを置きます。 2後 - 3日間、インキュベーターからフラスコを取り外します。 </li></ol></li><li> 培養細菌-最終セル数 <ol><li>可算単一コロニーが現れる保証するために、少なくとも10百万円（10 -7）の希釈を達成するために、PBSを用いて、非希釈した培養液の連続希釈を行います。寒天プレートの1に7並列等距離線を描画します。 <ol><li>上から見えるようにするのに十分な著名なシャーレの底面に太い線を描画することでこれを行います。 1セグメントに非希釈液の3小さな滴をドロップします。 1:10希釈液を得るために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の9ミリリットルに非希釈液の1ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>ピペットでこの新しく希釈液の少量（〜0.1ミリリットル）を取り、次のセグメントに3以上の小滴をドロップします。して、新しいフラスコに新たに希釈した溶液を移し、さらに希釈した10倍（10倍）PBSを加えます。これは10 -2または1に希釈をダウンさせます：100。 <ol><li>次のセグメントに100解決策：この1を使用します。千のすべての方法：連続して新しいフラスコに転送し、連続して10 -3または1からますます希薄サンプルを得るためにPBSと並行して10倍（10倍）を希釈することによって、彼は新しく希釈したソリューションの小容量で処理これを繰り返します最後のセグメントへのダウンに10 -7または1：10百万円となりました。 </li></ol></li><li> 31℃で2日間 - 1、プレートをインキュベートした後、寒天プレートに存在する細胞の数をカウントする単位（CFU）のプレートカウントコロニー - 形成行います。これにより、希釈せず、試料中の細菌数の定量的な尺度を与えます。 注：CFU値は、すべてのコロニーを分離した単一の生存可能な微生物細胞によって設立されていると仮定した栄養培地、温度、および時間の特定の条件下でコロニーを生じさせるためのシステムの能力に基づいて測定されます。 </li><li>シール将来の使用のために冷蔵庫内のアイテムを残りの自己封止膜と店舗とのペトリ皿。 </li></ol></li></ol>沈殿を加速するための栄養の充実2.プロトコル<ol><li>転送いくつかの滅菌遠心チューブに調製した培養液（細胞+培地）の9ミリリットル、10ミリリットルボリュームの各。 </li><li>尿素：2グラム/ L、塩化アンモニウム：1グラム/ L、重炭酸ナトリウム：212 mg / Lで、塩化カルシウム：280 mgの新鮮な培地中で以下の濃度で4成分からなる外部濃縮100mlの原液を準備/ L。慎重に分析天秤を使用してすべての成分を測定し、オートクレーブ（121℃、15 PSI、15分）でビーカーや場所に新鮮な培地とすべてが、尿素を混ぜます。 <ol><li>オートクレーブ後、新鮮な培地1mlと尿素の必要量（2 mg）を混合し、濃縮のプロセスを完了するために0.22μmのシリンジフィルターを装着したシリンジを通過します。 </li><li> 1を追加します。準備された培養液（細胞+培地）の9ミリリットルを含む滅菌遠心分離管に添加剤と、この濃縮培地1ml（ステップ2.1参照）。 注：すべてのこれらの成分のうち、高温で分解性である尿素は、オートクレーブ滅菌することはできません。他の成分がオートクレーブ処理された後したがって、（121℃、15 PSI、15分）、尿素を0.22μmシリンジフィルターを介して最後に追加されます。 </li></ol></li><li>機械ボルテクサーを用いて徹底的に各チューブをボルテックス。 30℃で非振盪インキュベーターに富む液体（細胞+培地+添加物）を配置します。降水の開始のために、定期的にすべてのユニットを監視します。降水の開始は肉眼で検出された後、光学顕微鏡を用いて、顕微鏡観察を始めます。実験の開始後36時間 - これは通常、30の間です。 </li></ol>マルチモード顕微鏡3.プロトコル<ol><li>高マニフィカへの流体の少量（約1 ml）を転送します明視野モードで初期観測を行うためのイオン顕微鏡のチャンバーカバーガラスシステム。まず、最も低い倍率（4倍）を持つすべての観測を開始します。その析出物の分布についてのカバレッジの広い面積、ひいてはグローバルな情報を提供しています。 </li><li>析出物のかなりのボリュームで特定の領域を選択し、漸進的に倍率を増加させることにより（20X、40X、60X）にズームします。 注：それは正しく明視野下で細胞外高分子物質（EPS）から細胞を解決することは不可能ですので（これは非常に近い屈折率）に、必要に応じて位相コントラストモードに切り替えます。このモードでは、細胞膜のちょうど輪郭（バルクセルとは異なる位相であるが）、したがって、視覚的区別を可能にする、表示されています。 </li><li>最後に、赤で死んコンポーネントを着色しながら、選択的に緑などのライブのコンポーネントを染めるライブ/デッド染色でいくつかの部屋を染色します。標準プロトコル28を参照してください&lt;/ SUP&gt;。 </li><li>適切に赤と緑の領域を区別するために、蛍光モードに切り替えます。レッド（540の励起波長とレッドフィルターキューブ - の660nm - 580nmで、600の595 nmおよびバリアフィルタのダイクロイックミラー） - 480nmでのダイクロイックミラー440の励起波長を持つとグリーン（GFPロングパスグリーンフィルターキューブ505 nmおよび510 nmでのバリアフィルタ）フィルタキューブは、蛍光顕微鏡写真を容易にするために使用されます。 </li><li>一旦全てのマルチモード・データは、可能な限り最高のコントラストと明瞭さを得るために、最高の画像や手動でオーバーレイ（個々の明視野、位相コントラストおよび蛍光画像）を選択し、収集されました。 </li><li>結晶構造を理解するために乾燥した固体試料のSEMを実行します。これは、十分に確立された標準手順である。22は、官能基（炭酸塩）の化学署名を識別するためのXPSを実行します。これは、同様に、十分に確立され、標準的な手順である。23 </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+Bacillus+pasteurii+group.">An investigation of the Bacillus pasteurii group.</a> Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).</li><li>Greenfield, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+concentration+of+calcium+and+magnesium+and+precipitation+of+calcium+carbonate+by+a+marine+bacterium.">Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).</li><li>Phillips, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+applications+of+ureolytic+biomineralization:+a+review.">Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review.</a> Biofouling. 29, 715-733 (2013).</li><li>Dhami, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+carbonates+and+their+engineered+applications:+a+review.">Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review.</a> Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).</li><li>Cuthbert, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+on+the+rate+of+ureolysis+and+the+morphology+of+carbonate+precipitated+by+S.+Pasteurii+biofilms+and+limits+due+to+bacterial+encapsulation.">Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation.</a> Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).</li><li>Okwadha, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimum+conditions+for+microbial+carbonate+precipitation.">Optimum conditions for microbial carbonate precipitation.</a> Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).</li><li>Stocks-Fischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+precipitation+of+CaCO3.">Microbiological precipitation of CaCO3.</a> Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).</li><li>Lauchnor, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterially+induced+calcium+carbonate+precipitation+and+strontium+coprecipitation+in+a+porous+media+flow+system.">Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 1557-1564 (2013).</li><li>Al Qabany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+Affecting+Efficiency+of+Microbially+Induced+Calcite+Precipitation.">Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation.</a> Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).</li><li>Morita, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcite+precipitation+by+marine+bacteria.">Calcite precipitation by marine bacteria.</a> Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).</li><li>Chafetz, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+peloids:+A+product+of+bacterially+induced+carbonate+precipitation.">Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation.</a> Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).</li><li>Whiffin, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , (2004).</li><li>Paassen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+up+of+BioGrout:+a+biological+ground+reinforcement+method.">Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method.</a> Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbially+enhanced+geologic+containment+of+sequestered+supercritical+CO2.">Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2.</a> Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+well+bore+leakage+of+CO2+using+engineered+biomineralization+barriers.">Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers.</a> Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).</li><li>Jonkers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+bacteria+as+self-healing+agent+for+the+development+of+sustainable+concrete.">Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete.</a> Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).</li><li>Tobler, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Sporosarcina+pasteurii+in+sandstone+and+its+significance+for+subsurface+engineering+technologies.">Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies.</a> Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).</li><li>Mortensen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+microbial+induced+calcium+carbonate+precipitation.">Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation.</a> Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).</li><li>Phillips, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+CO2+leakage+reduction+through+biofilm-induced+calcium+carbonate+precipitation.">Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 142-149 (2013).</li><li>vander Heide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , (2011).</li><li>Wiley, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+an+alkaline+pH+and+ammonia+for+substrate+oxidation+by+Bacillus+pasteurii.">Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii.</a> Journal of Bacteriology. 84, (1962).</li><li>Tagliaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+strain+localisation+processes+in+bio-cemented+sand+using+x-ray+imaging.">Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging.</a> Granular Matter. 13, 247-250 (2011).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).</li><li>Valiei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>. LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf</a> (2004)</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

重要なステップ：この原稿を詳細にSの実行可能なサンプルを培養するためのプロトコルについて説明しますパステウリイ 。文化が用意されていたら、それは適切に濃縮されなければなりません。適切な化学的環境を提供するために、失敗は降水量の非常に長い時間スケールまたはその完全な欠如のいずれかにつながるので、これは実験の成功に不可欠の重要なステップである。S.パステウリイは、複数の外部機関に非常に敏感であり、生化学的な堅牢性と再現性を保証するために、ケアと高精度で培養する必要があります。濃縮の程度および投与量は現在、降水の化学的性質を決定することが知られているので、同様に正確に制御しなければなりません。 修正/トラブルシューティング：いくつかの態様は、エンド結果にはほとんど差異で修正することができます。プレートカウントは番目あたり（連続希釈上述の手法ごとに実行される必要はありません電子マイルMisraの方法）。ここで、連続希釈は、その底面に描かれたコードによって、7つの領域に分割して、単一の寒天プレート上で行われています。これは必須ではありません。また、拡散板を調製することにより、特定の希釈全体寒天プレートを使用するのが一般的です。最終的な計算のために選択される - 連続希釈は、連続する拡散板の一連の単一コロニー（200 20）の可算数のいずれかが行われます。種々の他の細胞計数技術のいずれも、ここで適用することができます。顕微鏡がよく、簡単なカバースリップまたはスライドを用いて行うことができます。室内ユニットは、すべての必須ではありません。 時には、細菌は、沈殿物を形成するために失敗することがあります。第一の液体培地に凍結培養物の少量を転送するために有用です。成長は最初の液体中に発生した後ストリーキングを行ってもよいです。 制限事項：これはNUと遅い技術であり、ステップ、別のにつながる1のmber。全ての工程で汚染、交差汚染や他の文化的欠陥の重要なチャンスがあります。インテンスケアは常に維持されなければなりません。沈殿物の約180 mgの培養液1ml当たりに形成されます。 意義は、本プロトコルは、必要なすべてのステップを確実にするために詳細に概説している細菌S.の文化パステウリイ忠実に外部から添加された濃縮度の影響下方解石を沈殿させます。この菌自体の文化が十分に確立されたプロトコルであるが、濃縮および定量化のプロセス全体ではありません。この問題は、ここで対処されてきました。 将来のアプリケーション：適切に順番に析出物の性質に応じて様々なアプリケーションを設計することができることを別の方法で沈殿させ、この細菌を調節することが可能かもしれません。これは、前述したことがありますS.を伴うMICPに関して、いくつかの未知の存在パステウリイ 。これらの未知数のいくつかは、Sの凝集ダイナミクスの役割を含みますMICPプロセスでパステウリイ 、このような多孔質媒体と流体の流れの効果として、マイクロスケールの環境26,27の役割。標準化されたプロトコルは、適切なマルチモード顕微鏡法を実行するための明確な機会を高速沈殿を確実に開発することができます。

スポロサルシナパステウリイは高アルカリ性環境（pH約10）1で生き残ることができるグラム陽性細菌であると（MICP）2-4微生物学誘起方解石の沈殿と呼ばれる現象の原因物質になることができる細菌種の一つです。 MICPは、炭酸カルシウムの沈殿は、適切な環境条件下で特定の微生物により誘発される方法である。S.パステウリイが原因特定の条件下でMICPの重要なボリュームを誘導するための可能な剤 ​​としての同定に近年の重要性を想定しています。この可能性は事実Sから茎パステウリイは、酵素ウレアーゼの大量を分泌するためのユニークな能力を持っています。この酵素は、水分子の存在下での尿素の加速溶解（広範かつ豊富な供給と天然に存在する生化学的化合物）を促進する、触媒として作用します。反応のカスケード、このプロセス究極を通じて、LY負に帯電した炭酸イオンの生成につながります。これらのイオンは、次いで、最終的に炭酸カルシウム（カルサイト）の沈殿物を形成するために、カルシウムのような正の金属イオンと反応します。したがって、ラベルMICP 5-9。 MICPのプロセスは、数十年10,11のために知られ、研究されています。過去数年間、MICPは、エンジニアリングとボトムアップのグリーン建設12、大規模な構造物13,14と炭素隔離およびストレージ15,16の強化を含む環境用途の広い範囲のために検討されています。 例えば、Cunnigham 17ら。アルはベリア砂岩コアを含む高圧中温流反応器を設計しました。リアクターは、細菌S.を接種しましたfridgidimarina高圧の超臨界二酸化炭素の注入、細孔体積内部のバイオマスの大規模な蓄積の条件下リュームは、透過性の95％以上の減少につながった、観察されました。 JonkersとSchlangen 18は、コンクリート中の自己治癒過程上の細菌の特定の特殊株の効果を検討しました。表面の孔を通って入る細孔ネットワーク内に輸送外部水が順番にMICPを経由して構造強度を助ける休眠バクテリアを活性化することが期待されています。トープラー19ら。 S.の尿素分解活性を比較しました大規模MCIPに有利な条件の下で先住民族の地下水の尿素分解縮図でパステウリイとことがわかったS.パステウリイは、先住民コミュニティの前ウレアーゼ活性を欠いていた場合でも、方解石沈殿を改善するための一貫性のある機能があります。モーテンセン20 et.al土壌タイプ、塩化アンモニウム、塩分濃度、酸素濃度とMICPの細胞の溶解の濃度などの外部因子の影響を研究しました。生物処理工程がRESPと非常に堅牢であり、彼らのデモ電気ショック療法パラメータ空間における幅広いバリエーションには行われている細菌を強化するための適切な濃縮プロセスを提供し、様々な大規模な修復アプリケーションのためのこのプロセスの適合性を実証します。フィリップス21ら。アルは、Sを注射された後、砂の列と砂岩コアの透磁率と強度の変化を研究するための実験を設計しましたパステウリイ文化。破壊強度が3倍に増加した4回 - 彼らは、透磁率が2に減少したことがわかりました。 S.のパステウリイとMICPにおけるその役割は、活発な研究のトピックであり、化学的析出のメカニズムに関するいくつかの問題はまだ完全には理解されていません。この観点では、Sの正確文化適当に濃縮された株式に一貫性のある標準化されたプロトコルのセットを持っていることは非常に重要ですMICPを達成するためにパステウリイ 。ここでは、再現性と再現性を確保する厳密なプロトコルの概要を説明します。このミリアンペアnuscriptはSを培養するための詳細なプロトコルを記述するパステウリイと適当に沈殿を誘導するために培養液を濃縮します。プロセスは、光学および走査電子顕微鏡（SEM）及びX線光電子分光法（XPS）などの様々な顕微鏡技術によって調べました。原稿の焦点は、MICPのプロセスです。 SEMおよびSIMSのような手順は、十分に確立された標準プロトコルであり、個別に記載されていません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Petridish</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:255px;">Petridishes being used as Agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Pyrex Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S63268</td>
			<td style="width:255px;">Corning Erlenmeyer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:108px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5133</td>
			<td style="width:255px;">being used to make Tris-Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9892</td>
			<td style="width:255px;">1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:224px;">Agar Powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td style="width:255px;">microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418</td>
			<td style="width:255px;">for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Yeast extract powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51475</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Measuring Cylinder</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">CP08559GC</td>
			<td style="width:255px;">Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:108px;">OHAUS</td>
			<td style="width:119px;">AX124E</td>
			<td style="width:255px;">being used to measure weight of reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave</td>
			<td style="width:108px;">Brinkmann</td>
			<td style="width:119px;">58619000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave Tape</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52428864</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z185140</td>
			<td style="width:255px;">being used to seal the flask before placing it in Autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Bacterial Stock</td>
			<td style="width:108px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:119px;">11859</td>
			<td style="width:255px;">-80&#176;C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:224px;">Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume</td>
			<td style="width:108px;">Biohit</td>
			<td style="width:119px;">725010</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 14005976</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Micropipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">212772B</td>
			<td style="width:255px;">Used for scratching Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Binder</td>
			<td style="width:119px;">80079098</td>
			<td style="width:255px;">Microbiology Incubator,BF Series</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Shaking Incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14004300</td>
			<td style="width:255px;">VWR Signature Benchtop Shaking Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">357590</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 53106220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Parafilm</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793</td>
			<td style="width:255px;">Being used to seal Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urea</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U1250</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8875</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiologically induced calcite precipitation mediated by sporosarcina pasteurii

ここでは、調査中の特定の細菌（S.のパステウリイは ）当然、酵素ウレアーゼの分泌を通して環境を発生中の尿素（尿素分解）の加水分解を誘導するために、適切な条件の下で、その能力において独特です。尿素分解のこのプロセスは、化学反応の連鎖を介して、炭酸カルシウムの沈殿物の形成をもたらします。これは、微生物学誘起方解石沈殿（MICP）として知られています。 MICPのための適切な培養プロトコルはここに詳述されています。最後に、顕微鏡の異なるモードの下で可視化実験は、沈殿プロセスの様々な側面を理解するために行きました。光学顕微鏡、走査電子顕微鏡（SEM）及びX線光電子分光法（XPS）のような技術は、化学的に最終生成物を特徴付けるために使用しました。また、自然の多孔質媒体の内部で毛穴を詰まらせるために、これらの析出物の能力はどこスポンジ定性実験により実証されましたバーは、長さスケールの範囲の細孔のネットワークを模倣するために使用しました。細菌細胞を含む培地に浸したスポンジバーが原因で化学沈殿を連続的プロセスから生じる、その細孔の目詰まりに硬化します。硬化バーは少し変形と同じ重量を支持することが可能であるが、適用される外部荷重の作用下で圧縮され、搾りなり制御スポンジバーと比較した場合、この硬化スポンジバーは、優れた強度を示します。

S.は、好アルカリ菌24は、比較的過酷な条件に耐えることができているパステウリイ 。上記培養プロトコルが続く場合、およびS.パステウリイは、細菌が時間（ 図2A）上の炭酸カルシウムの沈殿につながる、チャンバ内に成長させる。 図2（b）は、培地中で細菌細胞集団の位相差光学顕微鏡像を示します。個々の細胞は、非常に明白な細菌の菌クラスの特性棒状の形で、明確に区別することができます。小さな茶色の矢印は、特に二つの個別のセルを強調表示するために使用されています。炭酸カルシウムの沈殿は、数日間にわたって行われます。 図2Aは、析出物が遠心管の底に落ち着く方法を示しています。これは鮮やかで、液体媒体の下に座って白っぽい粉末として肉眼で見ることができます黄色がかった液体とは対照的に、色のシャープなコントラスト。黄色がかった液体がそれらの培養培地中に懸濁した細菌が含まれています。白い沈殿物を収集し、乾燥させ、後にSEM（ 図2C）を使用して画像化しました。 図3A、明確に定義された切断線、結晶の特徴では、容易に識別することができる。 図3Bは、特徴付けのために、同じサンプルについてXPSグラフを示しています。カーボネート基のピンポイントに炭酸カルシウムの有無を対応するピーク。このように、 図3AおよびBは、一緒に決定的に沈殿した化学物質として方解石の生成を証明します。 定性実験は、多孔質媒体の特性を変更するMICPの能力を評価するために行きました。この目的のために、我々は、多孔性を模倣することが期待されるスポンジを伴う実験を行いました細孔構造の長さスケールの範囲の媒体としては、代表的な天然の構造に見られます。スポンジバー（ミスタークリーン、P＆G）は、Sの溶液に浸漬し、 7日間パステウリイし、次いで乾燥させました。 MICPプロセスに長時間露光後のスポンジは、硬化および圧縮強度を高めて表示します。これは、 図4に示されている1kgの体重（ 図4A - B）にさらされたとき、スポンジは、浸漬（制御ケース）の前に、かなりの圧縮を示しました。一方、Sの浸漬に供された後パステウリイソリューション、それが結果として得られる方解石沈殿による目詰まり細孔を負いました。これは、細孔空間のブリッジングに起因する強度の大幅な増加につながったし、その後大幅な圧縮（ 図4C - D）させることなく1キロの負荷をサポートするためにバーを有効に。 半定量的なアイデア硬化プロセスに関するロードされたバーのたわみ高さの測定によって得ることができます。オリジナルのスポンジのサンプル4.5センチ、高さの長方形のバーです。対照試料のたわみは、非常に負荷の作用点の近くに、約1.6 cmです。処理された試料の場合には、たわみを0.6 cmの減少します。硬化プロセスの更なる厳格な定量も可能です。例えば、剪断強度、ピーク偏差応力とダイラタンシー角の増大の点で、このプロセスのメカニズムの説明はTagliaferri氏25らによって提案されています。 X線撮影およびデジタル画像相関を介しら。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig1.jpg" /> 図1. アルゴリズムの概略図として表さ全培養プロトコルの概要。、トリス緩衝液および寒天液で起動するにはpoureですペトリ皿中のd。寒天プレートの準備ができたら、それは細菌がはびこって先端に画線されます。画線プレートは、単一のコロニーを成長させるためにインキュベートされます。単一コロニーの一つは、メディアフラスコに移し、再びインキュベートする。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig2.jpg" /> 図2. 細胞および析出物 （A）、観察化学沈殿をクリアするには、遠心分離管のリード内部に閉じ込め培地（5後- 7日）のセル。底に落ち着くと肉眼で見えるようになります。 （B）位相コントラストの下で見た表面上に固定化された細菌の人口。個々のロッド状細胞（細菌、標識されたSpが）はっきり見ることができます（矢印で強調表示され、それらのカップル）。 （C）細胞（SP）と結晶（CC）の両方を示す白色沈殿物のSEM像。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig3.jpg" /> 図3. 結晶とそのキャラクタリゼーション。乾燥した沈殿物の（A）走査型電子顕微鏡像。個々の結晶と関連する切断線がはっきりと見えます。化学沈殿物の（B）X線光電子分光法（XPS）グラフ。官能基は、カルサイトの存在の可能性を強化炭酸に対応する質量分析ピーク。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig3large.jpg" target="_blank">viにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をEW。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig4.jpg" /> 図4. プロトタイプ多孔質媒体であるスポンジバーで半定量的実験。（A）と（B）は、浸漬していない新鮮なドライサンプルです。 （C）及び（D）は、培地と細胞の溶液中に浸しウェットサンプルです。それら起因一定重量の作用の下でここに減少圧縮から見た方解石沈殿から生じる細孔の目詰まりを材料耐性の有意な増加を示します。未処理試料は自然に多孔質であり、1キロの重量を受けたときに、ボリュームの大幅な減少を被ります。細孔のサイズは全体的な減少につながる、空気との契約を絞り出します。一方、処理された試料は、人工的に細孔の目詰まりによって剛性のかなりの量を得ています。それは快適に任意の圧縮せずに同じ負荷をサポートしているときに強度の著しい向上を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

微生物学的に誘導された方解石沈殿がによって媒介されます<em&gt;スポロサルシナパステウリイ</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

microbiologically-induced-calcite-precipitation-mediated-sporosarcina

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

21.7K ビュー.  University of Alberta. Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

モデルの声帯ポリープによる三次元流分離の調査

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

電界誘起リリースおよび測定によるエキソソームのバイオマーカーの検出（EFIRM）

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...