We wish to acknowledge the partners in the Helmholtz-Alberta Initiative, the Helmholtz Association and the University of Alberta, for the support resulting from participation in this collaboration. Research funding is provided by the Helmholtz Association's Initiative and Networking Fund, the participating Helmholtz Centers and by the Government of Alberta through Alberta Environment's ecoTrust program.
Dr. Tanushree Ghosh is gratefully acknowledged for her critical inputs at a number of crucial stages.

הערה: בצע את פרוטוקולי הניסוי לפי הסדר המתואר להלן. פרוטוקול תרבית החיידקים נדון בסעיף 1 (ראה גם איור 1). סעיף 2 מתאר את פרוטוקול להעשרת התרבות בינוני באמצעות תוספים חיצוניים. סעיף 3 מתאר את הפרוטוקולים למיקרוסקופיה במצב מרובה. משקולות של כל הרכיבים הבודדים ניתן למדוד באמצעות איזון אנליטיים. נפח של כל פתרון ניתן למדוד באמצעות גליל נפח. הערה: פרוטוקולי בטיחות ביולוגי פרופר חייבת להיות במעקב במשך סעיפי 1 - 2. התייעץ במשרד הבטיחות המוסדי לפרטים. 1. תרבית חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות חיידקים - אגר פלייט הכנה בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב ציוד וחומרי גלם כגון צלחות פטרי, בקבוק, טריס-בסיס, HCl, אגר, מי Millipore, pH מטר etc.Sterilize כל המכולות על ידי מעוקר ב 121 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר של 0.13 בתמיסה מימית M של טריס-חיץ על ידי ערבוב 15.75 גרם טריס בסיס עם 1 ליטר מים Millipore. כדי להוריד את רמת ה- pH של התמיסה המקורית (pH 10.4) להוסיף 2,800 μl של HCl (ריכוז 50%). בדוק ברציפות באמצעות מטר pH להגדיר pH = 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הפתרון למאגר 1 L לשני חלקים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 800 מ&quot;ל של פתרון זה. מחלקים אותו באופן שווה לשני חלקים של 400 מ&quot;ל כל אחת. ממיסים 8 גרם (NH 4) 2 SO 4 על פתרון אחד ותמצית שמרים 16 גרם לפתרון אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הסכום הנותר (200 מ&quot;ל של) פתרון ומחלקים אותו שוב לשני חלקים של 100 מ&quot;ל כל אחת. מערבבים 2 גרם (NH 4) 2 SO 4 לאחד. הוסף 4 גרם תמצית שמרים 4 גרם אגר לקצה השני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי 4 הפתרונים בנפרד לאחר גלישת צלוחיות בהתאמה באל רדיד דבק קלטות חיטוי. הערה: אם יחידת החיטוי המעבדתיים בשימוש, הנפח צריך להיות מוגדר 500 מיליליטר (טמפרטורה ולחץ אוטומטically שצוין כפונקציה של נפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלקחו אותם מן החיטוי, להגדיר הפתרונות שני 400 מ&quot;ל בצד צעד 1.3.1 (להלן). מערבבים הפתרונות שני 100 מ&quot;ל יש פתרון 200 מ&quot;ל. יוצקים את התערובת לתוך 10 - 12 צלחות פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיידקים - צלחת אגרה הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המניה חיידקי מהמקפיא (-80 ° C) ולאפשר לו להפשיר. לאחר ההפשרה כראוי, למקם את מניית חיידקי הצלחת אגרה בתוך ברדס biosafety. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את micropipette של ממד הקטן זמין (0.5 - 10 μl הן בחירה טובה) כדי לפשוט את הקצה עם מניית Sporosarcina pasteurii. Streak צלחת אגר עם קצה micropipette. מניח את הצלחת אגרה המפוספסת בתוך חממה שאינה רועדת ב 31 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 48 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה חזותית לבחון לקיומו של מושבות אחת. אם אין מושבות אחת, ולאחר מכן למקם אותו tהוא חמם עוד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עד מושבות אחת מזוהות. אין לעבור 7 ימי משפט. הערה: אם מושבות אחת אינה מופיעות אפילו אחרי שבוע, אז הוא הגיע למסקנה כי הצעדים לא הקפידו כראוי את כל התהליך יש לחזור משלב 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיידקים - מדגם סופי כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני פתרונות 400 מ&quot;ל (טריס חיץ + (NH 4) 2 SO 4 ו טריס חיץ + תמצית שמרים (1.5.1) יחד כדי להשיג 800 מ&quot;ל פתרון. העבר 125 מ&quot;ל של פתרון זה לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בדיקה ויזואלית של פני השטח של הצלחת אגרה לזהות אזורים עם ריכוז גבוה של מושבות אחת. בעדינות דחיפה ולשבור אחת המושבות עם טיפ micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים אותו קצה micropipette לתוך 125 מ&quot;ל בבקבוק ומערבבים אותו ביסודיות כדי להבטיח כי מספר מספיק של תאים לכפל חזקים מקבלים הועברו. מניחים את הבקבוק בתוך חממה רועד ב 150 סל&quot;ד, 30 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. לאחר 2 - 3 ימים, להסיר את הבקבוק מן החממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיידקים - ספירת כדוריות סופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע דילול סדרתי של הפתרון לתרבות הלא-מדולל באמצעות PBS להשיג דילול של לפחות עשרה מיליון (10 -7) כדי להבטיח מופיעים מושבות אחת מנייה. צייר שבעה קווים מקבילים במרחק שווה על אחד-הצלחות אגרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים זאת על ידי ציור קווים נועזים על המשטח התחתון של צלחת פטרי, מספיק בולט כדי להיות גלוי מלמעלה. ירידה של 3 טיפות קטנות של פתרון שאינו מדולל לתוך קטע אחד. הוסף 1 מ&quot;ל של פתרון שאינו מדולל ל 9 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) כדי להשיג דילול 1:10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן (~ 0.1 מ&quot;ל) של פתרון בדילול החדש הזה עם טפטפת ושחרר 3 יותר טיפות קטנות על הקטע הבא. מעביר את הפתרון החדש מדולל בבקבוק חדש ועשר פעמים מדוללות יותר (10x) על ידיהוספת PBS. זה מוריד את הדילול עד 10 -2 או 1: 100. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות זו 1: פתרון 100 במגזר הבא. חזור על פעולה זו הוא לעבד עם כמויות קטנות של פתרונות בדילול טרי באמצעות העברתם ברציפות צלוחיות חדשים דילול ברציפות פי עשרה (10x) בד בבד עם PBS להשיג יותר דגימות לדלל יותר מ 10 -3 או 1: 1,000 כל הדרך עד 10 -7 או 1:10 מיליון לתוך הקטע האחרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע יחידת קולוני-פורמינג (CFU) ספירת צלחת לספור את מספר התאים הנמצאים הצלחת אגרה לאחר דוגרי צלחת 1 - 2 ימים על 31 מעלות צלזיוס. זה נותן מדד כמותי של ספירת החיידקים במדגם החי. הערה: ערך CFU נמדד בהתבסס על היכולת של המערכת כדי להצמיח מושבות בתנאים הספציפיים של מזין בינוני, טמפרטורה וזמן בהנחה שכל מושבה הוא נפרד שנוסד על ידי תא מיקרוביאלי יחיד קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותםצלחות פטרי עם עצמי איטום סרט ולאחסן פריטים שנותרו במקרר לשימוש עתידי. </li></ol></li></ol> פרוטוקול 2. להעשרה של מזון כדי להאיץ רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 9 מיליליטר של נוזל התרבות המוכן (תאים + בינוני) לתוך צינורות צנטריפוגות כמה מעוקרים, כל אחד 10 מיליליטר נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות 100 מיליליטר של ההעשרה החיצונית מורכב מארבעת מרכיבים בריכוזים הבאים מדיום חדש: אוריאה: 2 g / L, אמוניום כלוריד: 1 גר &#39;/ ל, סודיום ביקרבונט: 212 מ&quot;ג / L, כלוריד סידן: 280 מ&quot;ג / L. בזהירות למדוד את כל המרכיבים באמצעות איזון אנליטיים לערבב את כל אבל אוריאה עם מדיום חדש בכוס ומניחים החיטוי (121 ° C, 15 psi, 15 דק &#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות החיטוי, לערבב את הסכום הדרוש של אוריאה (2 מ&quot;ג) עם 1 מ&quot;ל של מדיום חדש ולהעביר באמצעות מזרק מצויד עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להשלים את תהליך ההעשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1מ&quot;ל של מדיום העשרה זה עם ותוספות צינורות צנטריפוגה מעוקר המכיל 9 מ&quot;ל של נוזל תרבות מוכן (תאים + בינוני) (ראה שלב 2.1). הערה: מבין כל המרכיבים הללו, אוריאה להיות מתכלה בטמפרטורות גבוהות, לא ניתן לעקר ב החיטוי. לפיכך, לאחר הרכיבים האחרים כבר autoclaved (121 ° C, 15 psi, 15 דק &#39;), אוריאה מתווסף האחרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינור אחד באמצעות vortexer מכני ביסודיות. מניח את הנוזלים המועשרים (תאים + תוספות + בינוניות) חממה שאינה רועדת ב 30 ° C. ניטור כל היחידות באופן קבוע עבור חניכה של משקעים. באמצעות מיקרוסקופ אור, להתחיל תצפיות מיקרוסקופיות פעם התפרצות של משקעים מזוהה עם בעין בלתי מזוינת. זה בדרך כלל בין 30 ל - 36 שעות לאחר תחילת הניסויים. </li></ol> 3. פרוטוקול למיקרוסקופיה Multi-mode <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר נפח קטן (~ 1 מ&quot;ל) של נוזל אל-מגניפיקט גבוההיון מיקרוסקופיה-תאי במערכת coverglass לבצע תצפיות ראשוניות עם מצב שדה בהיר. כדי להתחיל עם, להתחיל כל התצפיות עם ההגדלה הנמוכה ביותר (4X). אשר מספקת שטח רחב של כיסויים ומכאן מידע הגלובלי על חלוקת משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזורים מסוימים עם כמויות משמעותיות של משקעים זום (20X, 40X, 60X) על ידי הגדלת הגדלה בהדרגה. הערה: מאחר שאי אפשר לפתור את התאים כמו שצריך שעשויים מהחומרים פולימריים התאי (EPS) תחת בהיר שדה (בשל מדדים שבירים קרובים מאוד), לעבור על מצב שלב בניגוד לפי צורך. במצב זה, רק את קווי המתאר של קרום התא (להיות בפאזה שונה מאשר התא בתפזורת) גלויים, ובכך לאפשר בידול ויזואלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להכתים כמה תאים עם כתם Live / Dead באופן סלקטיבי צבענים הרכיבים לחיות כפי ירוק ואילו צביעת המרכיבים מת באדום. עיין פרוטוקולים סטנדרטיים 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מצב פלורסנט להבחין כראוי בין האזורים האדומים וירוקים. האדום (קובייה מסננת אדומה עם גל עירור של 540 - 580 ננומטר, מראה Dichroic של 595 ננומטר גדר מסננת של 600 - 660 ננומטר) וגרין (קוביית מסנן GFP הארוך לעבור הירוק עם גל עירור של 440 - 480 ננומטר, מראה Dichroic של 505 ננומטר הגדר מסנן של 510 ננומטר) מסנן קוביות משמשים כדי להקל micrographs ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל נתוני המצב מרובה נאספו, בחרו את התמונות הטובות ביותר ואת הכיסוי ידני (brightfield פרט, שלבו בניגוד ותמונות ניאון) כדי להשיג את הניגוד הטוב ביותר האפשרי ובהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע SEM על הדגימות המוצקות היבשות להבין מבנים גבישיים. זהו הליך ומבוסס סטנדרטי. 22 בצעו XPS לזהות חתימה כימית של קבוצות פונקציונליות (קרבונטים). זהו הליך ומבוסס סטנדרטי גם כן. 23 </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+the+Bacillus+pasteurii+group.">An investigation of the Bacillus pasteurii group.</a> Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).</li><li>Greenfield, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+and+concentration+of+calcium+and+magnesium+and+precipitation+of+calcium+carbonate+by+a+marine+bacterium.">Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).</li><li>Phillips, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+applications+of+ureolytic+biomineralization:+a+review.">Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review.</a> Biofouling. 29, 715-733 (2013).</li><li>Dhami, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+carbonates+and+their+engineered+applications:+a+review.">Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review.</a> Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).</li><li>Cuthbert, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+on+the+rate+of+ureolysis+and+the+morphology+of+carbonate+precipitated+by+S.+Pasteurii+biofilms+and+limits+due+to+bacterial+encapsulation.">Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation.</a> Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).</li><li>Okwadha, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimum+conditions+for+microbial+carbonate+precipitation.">Optimum conditions for microbial carbonate precipitation.</a> Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).</li><li>Stocks-Fischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+precipitation+of+CaCO3.">Microbiological precipitation of CaCO3.</a> Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).</li><li>Lauchnor, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterially+induced+calcium+carbonate+precipitation+and+strontium+coprecipitation+in+a+porous+media+flow+system.">Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 1557-1564 (2013).</li><li>Al Qabany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+Affecting+Efficiency+of+Microbially+Induced+Calcite+Precipitation.">Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation.</a> Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).</li><li>Morita, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcite+precipitation+by+marine+bacteria.">Calcite precipitation by marine bacteria.</a> Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).</li><li>Chafetz, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+peloids:+A+product+of+bacterially+induced+carbonate+precipitation.">Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation.</a> Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).</li><li>Whiffin, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , (2004).</li><li>Paassen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale+up+of+BioGrout:+a+biological+ground+reinforcement+method.">Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method.</a> Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbially+enhanced+geologic+containment+of+sequestered+supercritical+CO2.">Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2.</a> Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+risk+of+well+bore+leakage+of+CO2+using+engineered+biomineralization+barriers.">Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers.</a> Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).</li><li>Jonkers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+bacteria+as+self-healing+agent+for+the+development+of+sustainable+concrete.">Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete.</a> Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).</li><li>Tobler, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+Sporosarcina+pasteurii+in+sandstone+and+its+significance+for+subsurface+engineering+technologies.">Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies.</a> Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).</li><li>Mortensen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+factors+on+microbial+induced+calcium+carbonate+precipitation.">Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation.</a> Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).</li><li>Phillips, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+CO2+leakage+reduction+through+biofilm-induced+calcium+carbonate+precipitation.">Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation.</a> Environmental science &amp; technology. 47, 142-149 (2013).</li><li>vander Heide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , (2011).</li><li>Wiley, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+an+alkaline+pH+and+ammonia+for+substrate+oxidation+by+Bacillus+pasteurii.">Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii.</a> Journal of Bacteriology. 84, (1962).</li><li>Tagliaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+strain+localisation+processes+in+bio-cemented+sand+using+x-ray+imaging.">Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging.</a> Granular Matter. 13, 247-250 (2011).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).</li><li>Valiei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>. LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf</a> (2004)</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

קריטי שלבים: כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקולים עבור culturing מדגם קיימא של ס pasteurii. לאחר בתרבות כבר הכינה, זה חייב להיות מועשר כראוי. זהו צעד מפתח חיוני להצלחת הניסוי בגלל חוסר היכולת לספק את הסביבה הכימית הנכונה מוביל או קשקשי זמן רבים מאוד של משקעים או חוסר מוחלט ממנו. ס pasteurii הוא די רגיש לכמה גורמי חוץ חייב להיות מתורבת עם רמה גבוהה של טיפול ודיוק כדי להבטיח יציבות ואת הדירות ביוכימיים. ההיקף והמינון של העשרה כיום ידוע להכתיב את האופי הכימי של משקעים ולכן חייבים להיות מבוקר במדויק גם כן. שינויים / פתרון בעיות: היבטים אחדים עשויים להיות שונים עם שונות מעט-תוצאות סופיות. ספירת הצלחת לא צריכה להתבצע על פי הטכניקה המתוארת לעיל (דילול הסדרה לכל הדואר מיילס מיסרה שיטה). הנה, דילול הסדרה שבוצע על צלחת אגרה יחיד על ידי חלוקה אותו לשבעה אזורים לפי אקורדים שהונחו על פני התחתונה שלה. זו אינה חובה. זה גם מנהג נפוץ להשתמש צלחת אגרה כולו עבור דילול מסוים על ידי הכנת צלחת התפשטות. דילול סדרתי מבוצע על שורה של הצלחות רצופות התפשטות ואת אחד עם מספר מנייה של מושבות אחת (20 - 200) נבחר עבור החישוב הסופי. כל טכניקות ספירת תאים השונות אחרות עשויים להיות מיושמים גם כאן. מיקרוסקופי ניתן לבצע גם עם מכסה מחליק פשוט או שקופיות. יחידה קאמרית היא בכלל לא חובה. לפעמים, החיידק עלול להיכשל כדי ליצור משקעים. כדאי להעביר כמות קטנה של התרבות קפואה לתוך מדיום נוזלי ראשון. קווים מפוספסים עשויים להתבצע לאחר הצמיחה שחלה הראשון הנוזלי. מגבלות: זוהי טכניקה איטית עם נוmber של צעדים, אחד מוביל למשנהו. ישנם סיכויים משמעותיים של זיהום, זיהום צולבות ופגמי תרבות אחרים בכלל הצעדים. חייב להישמר טיפול אינטנסיבי בכל העת. בסביבות 180 מ&quot;ג של משקע נוצר לכל מיליליטר של תמיסת התרבות. המשמעות: הפרוטוקול הנוכחי מתאר בפירוט את כל הצעדים הדרושים כדי להבטיח כי תרבות של החיידק S. pasteurii משקעים קלציט בנאמנות בהשפעת enrichments הוסיף חיצוני. למרות התרבות של החיידק הזה עצמו הוא פרוטוקול ומבוסס, את כל התהליך של עשיית עושר וכימות אינו. בעיה זו טופלה כאן. יישומים עתידיים: זה עשוי להיות אפשרי כראוי לווסת החיידק הזה כדי לזרז באופנים שונים אשר בתורו יכול להיות מהונדס ליישומים שונים בהתאם לאופי של משקעים. זה הוזכר בעבר כי שםקיימים מספר אלמונים ביחס MICP מעורב ס pasteurii. חלק אלמונים אלה כוללים תפקיד הדינמיקה המצרפית של ס pasteurii בתהליך MICP, תפקידה של הסביבה microscale 26,27 כגון השפעת התקשורת נקבובי זרימת הנוזל. פרוטוקול סטנדרטי ניתן לפתח מבטיח ממטרים מהר עם הזדמנות ברורה לביצוע מיקרוסקופיה מצב המרובה נכון.

Sporosarcina pasteurii הוא חיידק חיובי גרם מסוגל לשרוד בסביבות בסיסיות מאוד (pH ~ 10) 1 והוא אחד מיני חיידקים שיכולים להיות סוכן סיבתי של תופעה הנקראת מיקרוביולוגי מושרת קלציט רטיבות (MICP) 2-4. MICP הוא תהליך שבו משקעים של סידן פחמתי הוא המושרה על ידי חיידקים מסוימים בתנאים סביבתיים מתאימים. ס pasteurii מקבלת משנה חשיבות בשנים האחרונות בשל זיהויו כסוכן האפשר גרימת בהיקפים משמעותיים של MICP בתנאים מסוימים. אפשרות זו נובעת מהעובדה ש יש pasteurii את היכולת הייחודית להפריש כמויות עצומות של באוראז האנזים. אנזים זה פועל כזרז, קידום תמוגה מואץ של אוריאה (תרכובת ביוכימית טבעית עם אספקה ​​נרחבת בשפע) בנוכחות של מולקולות מים. דרך מפל של תגובות, תהליך זה אולטימטיביly מוביל לדור של יונים טעונים שלילית קרבונט. יונים אלה, בתורם, מגיב עם יוני מתכת חיוביים כמו הסיד ולבסוף ליצירת משקעים של סידן פחם (קלציט); ומכאן תווית MICP 5-9. תהליך MICP כבר ידוע ולמד במשך כמה עשורים 10,11. במהלך השנים האחרונות, MICP נחקרה על מגוון רחב של הנדסה ויישומים סביבתיים כולל בנייה ירוקה מלמטה למעלה 12, שיפור של מבנים בקנה מידה גדול 13,14 ו קיבוע פחמן ואחסון 15,16. לדוגמה, et 17 Cunnigham. אל עצב כור זרימת טמפרטורה מתונה בלחץ גבוה המכיל גרעין חול ברא. הכור היה מחוסן עם החיידקים ס fridgidimarina ובתנאים של הזרקת פחמן דו חמצני סופר קריטי בלחץ גבוה, הצטברות מסיבית של ביומסה בתוך הכרך הנקבוביumes נצפתה, אשר הובילה יותר מ -95% הפחתה חדיר. 18 Jonkers ו Schlangen בחן את ההשפעה של זנים מיוחדים של חיידקים על תהליך ריפוי עצמי בבטון. מים חיצוניים מועברים לרשת הנקבובית נכנסת הדרך הנקבובית השטח צפוי להפעיל את החיידקים הרדומים אשר בתורו לעזור חוזק מבנים באמצעות MICP. טובלר 19 et al. השוו את פעילות ureolytic של ס pasteurii עם מיקרוקוסמוס ureolytic תהום הילידים בתנאים לטובת MCIP בקנה מידה גדול ומצא כי ס יש pasteurii יכולת עקבית כדי לשפר ממטרי קלציט גם כאשר קהילות ילידים חסרות פעילות באוראז מוקדמת. Et.al 20 מורטנסן חקרו את ההשפעות של גורמים חיצוניים כמו סוג הקרקע, ריכוז של אמוניום כלוריד, מליחות, ריכוז חמצן תמוגה של תאים על MICP. ההפגנה שלהם כי תהליך הטיפול הביולוגי הוא מאוד חזק עם שו&quot;תect כדי וריאציה רחבה בחלל פרמטר ממחיש את הכושר של תהליך זה עבור יישומי משיקום בקנה מידה גדולה שונים הניתנים תהליך העשרה ראוי לחזק את החיידקים נעשה. Et 21 פיליפס. אל תוכנן ניסויים כדי ללמוד את השינויים בחדירות וכוח של טור חול גרעין חול לאחר שהוזרק לו ס תרבויות pasteurii. הם גילו כי בעוד חדירות ירד 2 - 4 פעמים ואילו הכוח לשברים שלוש פעמים. Pasteurii ס ותפקידה MICP הם נושאים של מחקר פעיל וכמה סוגיות הנוגעות למנגנון של משקעים כימיים עדיין אינם מובנים במלואם. לאור זאת, חשוב מאוד להיות קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים עקביים במדויק תרבות מניה מועשרת נאות ס pasteurii להשיג MICP. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קפדני שיבטיח דירות ויכולת שחזור. ma זהnuscript מתאר את הפרוטוקולים המפורטים culturing ס pasteurii ובאופן הולם להעשיר את המדיום תרבות להשרות משקעים. התהליך הוא נחקר באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות שונות כגון מיקרוסקופי אלקטרונים אופטיים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונת אלקטרוני ספקטרוסקופיה (XPS). ההתמקדות של כתב היד היא על התהליך של MICP. נהלים כמו SEM ו SIMS, להיות פרוטוקולים סטנדרטיים ומבוססים, אינם מתוארים בנפרד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Petridish</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:255px;">Petridishes being used as Agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:224px;">Pyrex Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S63268</td>
			<td style="width:255px;">Corning Erlenmeyer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tris-Base</td>
			<td style="width:108px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">H5133</td>
			<td style="width:255px;">being used to make Tris-Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9892</td>
			<td style="width:255px;">1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:224px;">Agar Powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td style="width:255px;">microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418</td>
			<td style="width:255px;">for Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Yeast extract powder</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51475</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Measuring Cylinder</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">CP08559GC</td>
			<td style="width:255px;">Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:108px;">OHAUS</td>
			<td style="width:119px;">AX124E</td>
			<td style="width:255px;">being used to measure weight of reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave</td>
			<td style="width:108px;">Brinkmann</td>
			<td style="width:119px;">58619000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Autoclave Tape</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52428864</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z185140</td>
			<td style="width:255px;">being used to seal the flask before placing it in Autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Bacterial Stock</td>
			<td style="width:108px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:119px;">11859</td>
			<td style="width:255px;">-80&#176;C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:224px;">Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume</td>
			<td style="width:108px;">Biohit</td>
			<td style="width:119px;">725010</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 14005976</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Micropipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">212772B</td>
			<td style="width:255px;">Used for scratching Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Binder</td>
			<td style="width:119px;">80079098</td>
			<td style="width:255px;">Microbiology Incubator,BF Series</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">Shaking Incubator</td>
			<td style="width:108px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14004300</td>
			<td style="width:255px;">VWR Signature Benchtop Shaking Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7059</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:224px;">BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device</td>
			<td style="width:108px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">357590</td>
			<td style="width:255px;">Marketed by VWR under catalog number 53106220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Parafilm</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793</td>
			<td style="width:255px;">Being used to seal Agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urea</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U1250</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8875</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td>Enrichment for nutrient medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbiologically induced calcite precipitation mediated by sporosarcina pasteurii

החיידק המסוים תחת החקירה כאן (pasteurii ס) הוא ייחודי ביכולתו, בתנאים המתאימים, כדי לגרום הידרוליזה של האוריאה (ureolysis) ב טבעי סביבות באמצעות הפרשה של באוראז אנזים. תהליך זה של ureolysis, דרך שרשרת של תגובות כימיות, מוביל להיווצרות של משקעי סידן פחם. תופעה זו ידועה בשם מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות (MICP). פרוטוקולי התרבות הראויים MICP מפורטים כאן. לבסוף, ניסויים להדמיה תחת מצבים שונים של מיקרוסקופיה בוצעו להבין היבטים שונים של התהליך המשקע. טכניקות כמו מיקרוסקופיה אופטית, מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונה אלקטרונים ספקטרוסקופיה (XPS) הועסקו לאפיין את המוצר הסופי כימית. יתר על כן, היכולת של משקעים אלה כדי לסתום נקבוביים בתוך מדיום נקבובי טבעי הודגמה באמצעות ניסוי איכותי שבו ספוגברים שימשו לחקות נקבובית-רשת עם מגוון של סולמות אורך. בר ספוג טבול מדיום התרבות המכיל תאי חיידקיים מתקשה בשל סתימת הנקבוביות שלה הנובעים התהליך המתמשך של משקעים כימיים. בר ספוג מוקשה זה מפגין כוח עליון בהשוואה ברה ספוג שליטה אשר הופך דחוס ולחץ תחת הפעולה של עומס חיצוני מיושם, ואילו הבר המוקשה הוא מסוגל לתמוך המשקל הזהה עם עיוות קטנה.

ס pasteurii להיות 24 alkaliphile יכול לשרוד בתנאים קשים יחסית. כאשר פרוטוקול התרבות הנ&quot;ל מלווה, וס &#39; pasteurii הוא גדל בתוך חדר, החיידקים מובילים המשקע של סידן פחם לאורך הזמן (איור 2 א). איור 2 (ב) מראה תמונה מיקרוסקופית אופטית שלב בניגוד מאוכלוסיית תא החיידק בתוך המדיום לתרבות. תאים בודדים ניתן להבחין בבירור, עם צורות מוט דמוי מאפיין של מעמד חיידק חיידקים די ברורים. חצים חומים קטנים שימשו כדי להדגיש במיוחד שני תאים בודדים. משקעים של סידן פחמתי מתרחשת על פני תקופה של מספר ימים. איור 2 א מראה כיצד משקעים להתיישב בחלק התחתון של צינור צנטריפוגות. ניתן לראות זאת בבירור בעין בלתי מזוינת כאבקה לבנבן יושב מתחת במדיום נוזלי עםניגוד חריף בצבע בניגוד הנוזל הצהבהב. הנוזל הצהבהב מכיל חיידקים מושעים במדיום תרבותם. המשקעים הלבנים נאספו ומיובשים מאוחר צלמו באמצעות SEM (איור 2 ג). באיור 3 א, קווי המחשוף המוגדרים היטב, סימן היכר של crystallinity, ניתן לזהות בקלות. איור 3 ב מציג את גרף XPS עבור אותו המדגם לאפיון. פסגות המתאימות לנקודת סיכת קבוצות קרבונט קיומו של סידן פחם. לכן, איור 3A ו- B יחד באופן חד משמעי להוכיח את הדור של קלציט כמו הכימי זרז. ניסוי ואיכותי כדי להעריך את היכולת של MICP כדי לשנות את המאפיינים של בתווך נקבובי. לשם כך, ביצענו ניסוי מעורבים ספוגים אשר צפויים לחקות נקבוביבינוני עם מגוון של סולמות אורך של מבנים הנקבוביות, כפי שניתן למצוא מבנה טבעי טיפוסי. בר ספוג (מר נקי, P &amp; G) היה שקוע בפתרון של ס pasteurii לתקופה של 7 ימים ולאחר מכן מיובש. ספוג לאחר חשיפה ממושכת לתהליך MICP מוקשה ומוצג משופרת חוזק לחיצה. זה מתואר באיור 4 הספוג, לפני הטבילה (במקרה שליטה), הראה דחיסה משמעותית כאשר נתון משקל 1 ק&quot;ג (איור 4 א - ב).. מצד השני, אחרי שהייתי חשוף טבילת ס פתרון pasteurii, שספג הנקבוביות סתימה בשל משקעי קלציט שהתקבלו. זה הוביל לעלייה מסיבית כוח הנובע גישור של נקבוביות, ובהמשך לאפשר לבר לתמוך עומס 1 ק&quot;ג מבלי לאפשר דחיסה משמעותית (4C איור - D). רעיון וכמותיותניתן להשיג בכל הקשור לתהליך התקשות באמצעות מדידות של סטיה גובה של הבר טעון. המדגם ספוג המקורי הוא בר מלבני עם גובה של 4.5 ס&quot;מ. הסטייה של דגימת השליטה, קרובה מאוד לנקודת יישום של עומס, היא כ -1.6 סנטימטר. במקרה של דגימת מטופלים, הסטייה מקטינה ל 0.6 סנטימטר. בהמשך כימות הקפדני של תהליך ההתקשות הוא גם אפשרי. לדוגמה, הסבר מכניסטי של תהליך זה במונחים של הגדלת כוח גזירה, מתח deviatoric השיא וזוויות dilatancy הוצע על ידי 25 et Tagliaferri. אל דרך הדמית רנטגן מתאם תמונה דיגיטלית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig1.jpg" /> איור 1. מתאר לפרוטוקול התרבות המיוצגת כקובץ אלגוריתמי סכמטי. כדי להתחיל עם, טריס-חיץ פתרון אגר הוא poureד בצלחת פטרי. לאחר הצלחת אגרה מוכנה, הוא מפוספס עם טיפ שורץ החיידקים. הצלחת המפוספסת היא מודגרות לגדול מושבות אחת. אחד המושבות האחת מועבר בבקבוק תקשורת וטופח שוב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig2.jpg" /> איור 2. תאים ואת המשקעים (א) התאים במדיום התרבות הכלוא יחדיו להוביל צינור צנטריפוגות כדי לנקות משקעים כימיים ניתן לצפייה (לאחר 5 - 7 ימים). כי נרגע בתחתית גלויה לעין בלתי המזוינת. (ב) אוכלוסייה של חיידקים משותקים על משטח לראות תחת-בניגוד שלב. תאי מוט בצורה אישיים (חיידקים, שכותרתו Sp) ניתן לראות בבירור (כמה מהם מודגשים על ידי חיצים). (C) תמונה SEM של המשקע הלבן מראה תאים הן (Sp) וקריסטלים (CC). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig3.jpg" /> איור 3. גבישים אפיונם. (א) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של המשקע יבשים. גבישים בודדים וקווי מחשוף הקשורים גלויים לעין. (ב) X-Ray ספקטרוסקופיה תמונת האלקטרונים (XPS) גרף של המשקע הכימי; פסגות ספקטרומטריית מסה מתאימות קרבונט קבוצה פונקציונלית לחזק את אפשרות קיומו של קלציט. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן VI</a>EW גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53253/53253fig4.jpg" /> איור 4. ניסוי וכמותיות עם ברים ספוגים הגשה כמו Prototype נקבובי מדיה. (א) ו- (ב) הם דוגמאות יבשות טריות לא טבלו. (ג) ו- (ד) הם דוגמאות רטובות נוטפות פתרון של מדיום ותאי; הם מפגינים עלייה משמעותית התנגדות חומר בשל סתימת הנקבוביות הנובע ממטרי קלציט כפי שניתן לראות כאן, כתוצאה מלחץ מופחת תחת הפעולה של משקל קבוע. דגימות מטופל הם נקבוביות טבעי ולסבול הפחתה מסיבית נפח כאשר נתון משקל 1 קילו. הנקבוביות לסחוט באוויר החוזה, שמוביל הפחתה כוללת בגודל. מצד השני, במדגם המטופלים צבר כמות משמעותית מלאכותי של קשיחות מכוח הסתימה נקבובית. זה מדגים שיפור ניכר בחוזק כשזה בנוחות תומך אותו העומס ללא דחיסה כלשהי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53253/53253fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii at JoVE.com

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות בתיווך<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

microbiologically-induced-calcite-precipitation-mediated-sporosarcina

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

21.7K Views.  University of Alberta. Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Video: Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

זהב Nanostar סינתזה עם שיטת Seed כסף מתווכת צמיחה

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...