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マイクロ流体デバイスの作製1。 <ol><li> T-マイクロチャネルの輪郭を描画する図形レイアウトソフトウェア（ 例えば、AutoCADの）を使用します。 T-マイクロチャンネルでは、2つの供給チャネルは、90ミクロン、幅2,500μmの長さ、および合流チャネルは180ミクロン、幅3000ミクロンの長さです。 1100ミクロンの直径を有する個々の円に、各チャネルの端を接続します。 </li><li>マーク「クリア」と暴露し、対象地域のために「暗い」、それぞれ。ネガ型フォトレジストの場合（ 例えば、SU-8）は、T-マイクロチャネルの形状は、「クリア」であり、その周辺で「暗いです」。 </li><li>クロム·オン·ガラスマスク上にT-マイクロチャネルのパターンを転写するために442ナノメートルの波長2μmの最小特徴サイズを有するレーザパターン発生器を使用します。 </li><li>フォトマスクは、基板（ 例えば、片面研磨されたシリコンウェーハ）と永久エポキシフォトレジストを使用して（ 例えば、、SU-8）は、標準的なリソグラフィプロセスを介して金型を作ります。フォトレジスト層は55.2ミクロンの厚さです。一般的に、フォトレジストの厚さは、対物レンズ17-19の相関の深さよりも薄くする必要があります。 </li><li> T-マイクロチャネル20を製造するための金型及びポリジメチルシロキサン（PDMS）などの透明な材料を使用してください。 </li><li>流体接続のために、パンチの外径2mmのステンレス鋼管を使用する貫通孔PDMS上の円形パターンに整列されます。 </li><li> PDMSと30秒60 Wの酸素プラズマによるスライドガラスの表面を処理します。スライドガラスにPDMSを取り付けます。 2つの材料の酸化表面は強固な結合を作成します。 120℃で5分間ホットプレート上に接着PDMS構造を配置します。 </li><li>流体接続するためのパンチ穴にテフロンチューブを挿入します。 </li></ol> 2.実験セットアップ<ol><li> Hoffmaからマイクロスケールシュリーレンシステムを構築凝縮器の前側焦点面にスリット板を除去し、5倍の対物レンズ3の後側焦点面でのナイフエッジと変調器を置き換えることにより、n個の変調コントラスト顕微鏡。対物レンズ17-19の開口数に依存する相関関係の深さは、マイクロ流体デバイスの全体の深さをカバーするのに十分であるべきです。ナイフエッジの表面は、その反射率を低減するために、陽極酸化アルミニウムにより黒化されます。 </li><li> Cマウントアダプタを介して、顕微鏡の三眼鏡筒にハイスピー​​ドカメラをマウントします。カメラは、ビームスプリッタを介して顕微鏡の光路に面しています。イーサネットケーブルを介して、デスクトップコンピュータにカメラを接続します。そのグレースケールの読み出しは入力輝度に比例するように、カメラを1にガンマ補正を設定します。 </li><li>光源をオンにします。過剰な熱を避けるために、LED（発光ダイオード）照明を使用。 </li><li>画像処理ソフトウェア（ 例えば、&lt;使用/ EM&gt;はMATLAB関数の関数imread）が取得した画像の階調値を取得します。ナイフエッジを削除し、画像の平均階調読み出しが最大値よりも約10％小さくなるように照明、絞りと露光時間を調整します。これは、0％のカットオフのバックグラウンド強度を示し、我々は、8ビットの画像のために230の値を使用します。 </li><li>完全に入射光を遮断するナイフエッジを挿入します。画像の平均グレースケールの読み取りを記録します。これは、100％のカットオフのためのバックグラウンド強度を示し、値は約15 8ビットの画像のためにあります。 </li><li>ナイフエッジの位置を調整するように、取得された画像の平均階調読み出し、0％と100％のカットオフ値の中間にあります。ここで遮断の程度は50％に設定されています。 </li><li>構成成分として、互いに完全に混和性であることが知られている屈折率21を有する2つの透明な液体を準備します。屈折INDの依存性を評価するために、混合物の濃度のEXは、文献21を確認するか、グラッドストーン-デール式22を使用しています。曲線が全範囲にわたって非線形であれば、他の流体コンポーネントを選択します。その後、溶液の屈折率は濃度に比例して変化するの下に指定された組成物を選択します。例えば、作動流体として0​​.05​​と水の質量分率でエタノール水溶液を希釈してください。 </li><li>試料ステージ上にT-マイクロチャネルを配置します。ナイフエッジにコンフルエントチャンネルパラレル（ 図1）となるようT-マイクロチャンネルを配置します。 </li><li>シリンジAは、基準流体（水）として機能する作動流体で満たされ、そしてシリンジBは​​、他の作動流体（水、エタノールを希釈）が充填されている二つの同一の注射器を準備します。注射器の大きさは、所望の流量Qと、シリンジポンプの仕様に依存する：Q =πD2 V / 4、dは SYRの内径インゲとVは、プランジャの速度です。脈動は、通常、V 23を増大させるために小さな注射器を選択することによって防止することができます。 </li><li>ビーカー内のT-マイクロチャネルからの出口流体を収集します。確認テフロン出口管をビーカーの壁に固定され、その端部が、液滴切離しに起因する振動を避けるために、ビーカー中の液体レベルより下です。 </li></ol> 3.キャリブレーション<ol><li>混合2流体および参照画像の画像を取得します。 <ol><li>シリンジポンプの流量を設定された所定のレイノルズ数Reにおいて、Q。Qは、Q =μ（W + D）のRe /μ、ρは作動流体の粘度および密度である4ρ、およびWから計算されます及びDは、それぞれ、T-マイクロチャネルの合流流路の幅および深さです。 </li><li>シリンジAとSYと他のポンプと負荷つのポンプringe Bのは、テフロンチューブを介してAとシリンジBを注射器T-マイクロチャネルの2つの入口を接続します。同一の体積流量でT-マイクロチャネルに作動流体を供給するようにシリンジポンプを起動します。 </li><li>定常流が確立するまで待ちます。定常流状態が定常シュリーレンパターンの出現によって定義されます。 </li><li> 30fpsのフレームレートで流体混合の20フレームを記録するカメラ制御ソフトウェアを使用してください。 </li><li>のみ一定の速度でT-マイクロチャネルの合流チャネルに一つの入口を介して基準流体（水）をシリンジポンプBにロードされているポンプを停止します。 </li><li>定常流状態に到達し、何のシュリーレンパターンが観察されなくなるまで待ちます。 </li><li>光学的な不均一性は、T-マイクロチャネル内に存在しない場合には、参照画像を撮るためにカメラ制御ソフトウェアを使用してください。 30fpsのフレームレートで20フレームを記録します。 </li><li>異なるレイノルズ数で3.1.7に3.1.1を繰り返します。= 1 再、5、10、20及び50複雑な流れ構造は、T-マイクロチャネル24の合流領域に出現しないようにします。 </li></ol></li><li> iおよびjは画素インデックスである参照画像I 0（i、j）は 25で取得された画像I（i、j）を分割する画像処理ソフトウェアを使用します。 </li><li> T-マイクロチャンネル内で指定された流体の混合をシミュレートするCFD（計算流体力学）パッケージを採用しています。 <ol><li> T-マイクロチャネルのジオメトリの三次元モデルを構築します。構造格子への流れドメインを離散化。精度を高めるために、合流及びT-マイクロチャネルの中央領域に細かいメッシュを使用します。 </li><li>流体の物理的性質を割り当て、フロードメインに境界条件を確立します。解決プロセスの間、最後に得られた濃度から濃度依存性の拡散係数を決定します局所濃度を更新するために反復26。 </li><li>グリッド研究27を行うことにより、演算結果の感度を調べます。 </li></ol></li><li> =（X I、Y jの ）W：各ノードの（x i、y i）とのxy -planeに、台形則によって、チャネルの深さを横切る濃度フィールドの平均値を取るようにCFDポスト処理ツールを採用{Σkの [（X I、Y jを 、Z K）W + W（X I、Y jを 、Z K +1）]∙（Z kを 1 - ZのK）/ 2} Dが / D 28、チャネル深さ。 derivaを計算するために、中央差分スキームを使用してクロスストリーム方向に対する濃度の的：（W /∂∂Y）I、J = [（X I、Y jを+1）W - W（X I、Yの J -1）]（/ Y jを 1 - Y jを -1）。 </li><li>正と負の両方の勾配のために、 私は / I 0（3.2）で得られたグレースケール値の比率や、Y = 0（中心線、流れ方向として指定された場所で（3.4）で得られたW /∂∂yの質量分率の勾配を抽出方向）または様々な指定されたX（クロスストリーム方向）。 </li><li>結果をプロットし、I / I 0との間の関係を決定し、W /∂∂Y、I / I 0 </suB&gt; = /∂Y + C 2、W C 1∂（C 1、C 2は定数）、線形回帰と。 </li></ol> 4.定量<ol><li>繰り返して、ターゲットマイクロ流体デバイス内で混合するために3.1〜3.2を繰り返します。ターゲットマイクロ流体デバイスの深さは同一またはT-マイクロチャンネルのそれに近いものであるべきです。非定常現象が予想される場合、代わりにステップ3.1.4でビデオクリップ（一連の画像）を取得。露光時間が2.4、2.5、3.1.4と3.1.7で使用される値と同じである必要がありながら、フレームレートは、明らかに過渡流れのダイナミクスを解決するのに十分高くなければなりません。 </li><li>ターゲットマイクロ流体デバイス内の質量分率の勾配にグレースケール値の比を変換するために、ステップ3.6で得られた関係を使用してください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

マイクロ流体デバイス内の流体の混合のために、マイクロスケールのシュリーレン法は、光強度の変化を定量化することを介して濃度勾配の大きさを測定することができます。この技術の原理は、光伝播の交代を検出することに依存しているため、作動流体とマイクロ流体デバイスは、入射光に対して透明でなければなりません。作動流体の予備的評価が不可欠となるように加えて、プロトコルは、溶液およびその組成の屈折率との間の線形関係を必要とします。本明細書において実証エタノール水溶液に加えて、マイクロシュリーレン法が正常塩分勾配29とsolutocapillary対流30を測定するために適用されます。較正手順で使用される正確な測定値、絞り範囲、照明レベル、暴露時間、対物レンズとマイクロチャネルの深さについて定量手順で使用されるものと同一でなければなら。また、対物レンズの相関関係の深さは、マイクロ流体デバイスの全体の深さをカバーするのに十分に大きくなければなりません。 T-マイクロチャンネル内での混合のキャリブレーション処理は、マイクロスケールシュリーレン技術​​の正確な定量において最も重要なステップです。提案手法の実装を成功させるために、ユーザは、適切にチューブ接続を揃える余分な熱を減少させるためにLED光源を使用し、フロー発振23を回避するために、流体送達のための小さな注射器や空気圧を利用する、低レイノルズ数でのキャリブレーション手順を実施する必要があります24、および高次光学効果31を除去するために、焦点にマイクロ流体デバイスを配置します。最低測定勾配（明るいパターン、Y &lt;0は、∂/∂W）W /∂∂yの最高測定可能な勾配（明暗パターン、一方、カメラのダイナミックレンジにリンクされています&gt; 0）が到達したときにナイフエッジが完全に遮断偏向光を。濃度勾配の広い範囲を検出するために、高ISO値であれば黒つぶれや白とびが発生しないように有利です。マイクロシュリーレンシステムが識別することができない、それ以下の検出限界は、カメラが解決することができる最小の強度変化に依存します。最小限の強度変化は、ノイズの程度や色調、階調のレベルによって制限されます。したがって、大きなピクセル深度で高感度カメラは、低信号用途に望まれます。 マイクロシュリーレン法の重要性は、二つの折り目です。一方で、それは簡単な光学構成でリアルタイムに非定常フルフィールド測定を可能にします。いかなる異物が流れ場を乱すために導入されないように、他方では、非侵襲的です。マイクロシュリーレン法はmicrof三次元不均質性の二次元投影を生成するので既存の方法によって包まれたままluidicデバイス、複雑な混合現象が明瞭に見ることができます。この技術の将来のアプリケーションは、電気化学的処理中に濃度勾配を定量化やマイクロ流環境中の微生物の走化性を研究するために栄養勾配を決定することを含みます。

流体混合は、多くの工業プロセス及び生物系に見られる重要な問題です。マイクロフルイディクスの出現により、マイクロスケールでの混合による質量輸送機構の間で拡散支配でその課題に多くの注意をもたらしています。定量的な検証が必要な有効マイクロミキサーを設計しているので、いくつかの測定方法は、5-7を開発しました。それにもかかわらず、一般的に効率的なマイクロミキサ5に見られる三次元構造は、一般的な測定技術は、配信に失敗濃度フィールドのより正確な表現を必要とします。による角度8または反応速度6の視聴制限のために、上記の方法は、正確に、混合物の均質性を考慮していない誤った結果を生成することができます。 光学的に透明な微細構造中での混合、光学的に透明な流体、マイクロシュリーレン技術3,9-14用</SUP&gt;不均一性とを混合し、分析するための魅力的な代替手段を提供します。過去において、マイクロシュリーレン法は、主に圧縮性流れ9-13、15または位相勾配16を可視化するために使用されています。簡単な光学レイアウトと高感度の両方からマイクロスケールシュリーレン技術​​の利点と、光障害を引き起こすが、混合を評価するのに使用するのに適している特定のフロー機能の非侵襲的な調査だけでなく、を可能にします。本稿では、顕微鏡の対物レンズの後焦点面でのナイフエッジを挿入することにより、マイクロスケールシュリーレンシステムを構築し、定量的な分析を実現するためのキャリブレーション手順を説明し、マイクロ流体発振器4での検証測定を報告しています。混合流体の屈折率は、組成物に対して直線的に変化し、ターゲットのマイクロ流体デバイスの厚さは、上と同じになるように測定を実施するために、作動流体が適切に選択されますeは、キャリブレーションに使用されます。種の濃度に加えて、マイクロシュリーレン法は、温度や塩分などの線形屈折率に相関している他のスカラ量の傾きを測定するために拡張することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permanent Epoxy Negative Photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>SU-8 2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single side polished silicon wafer</td>
			<td>Light Technology</td>
			<td>S4W1PP5SABUP1</td>
			<td>p-type, diameter: 100&#177;0.5 mm, thickness: 525 &#177;25 mm, orientation: (1 0 0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>kds210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10L2138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoffman modulation contrast microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DM IL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N PLAN</td>
			<td>NA = 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife-edge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>custom made part</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. high speed</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>NX7-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount adapter HC 0.63x</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>541537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera operating software</td>
			<td>Integrated Design Tools</td>
			<td>MotionPro X Studio 2.02.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard-184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tubing, i.e. O.D. x I.D. 1/16 in. x 0.031 in.</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>58700-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro glass slide</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>S2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hot plate</td>
			<td>Yeong-Shin</td>
			<td>HP-303DN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water, i.e. HPLC grade</td>
			<td>Alps Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl alcohol, i.e. reagent grade</td>
			<td>Nihon Shiyaku Reagent</td>
			<td>EA448652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>image processing software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>MATLAB R2009a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>computational fluid dynamics package</td>
			<td>ESI group</td>
			<td>CFD-ACE+ 2008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing mixing inhomogeneity in a microfluidic device by microscale schlieren technique

本稿では、マイクロ流体デバイス内の不均一性を測定するために、混合マイクロシュリーレン技術​​の使用を紹介します。マイクロシュリーレンシステムはスリット板を除去し、ナイフエッジで変調器を置き換えることにより、対物レンズの後側焦点面への容易なアクセスを提供するホフマンモジュレーションコントラスト顕微鏡、から構成されています。マイクロシュリーレン技術の動作原理は、屈折率1-3のばらつきに起因する光偏向を検出することに依存しています。偏向光が逃げるか、それぞれ、明るいまたは暗い帯を生成するためにナイフエッジによって妨害されますか。混合物の屈折率は、その組成物を用いて直線的に変化する場合、像面における光強度の局所的な変化は、光軸に対して垂直な濃度勾配に比例します。マイクロシュリーレン画像は、三次元不均質性によって生成される乱れた光の2次元投影を提供します。 定量的な分析を達成するために、我々は、T-マイクロチャネルで二つの流体を混合する較正手順を説明します。我々は、対応するマイクロシュリーレン画像と密接に相関するT-マイクロチャンネル内の濃度勾配を得るために、数値シミュレーションを行っています。比較すると、マイクロシュリーレン画像のグレースケールの読み出し及びマイクロ流体デバイスにおいて提示濃度勾配との間の関係が確立されます。この関係を用いて、準マイクロシュリーレン画像から混合の不均一性を分析し、マイクロ流体発振器4での測定でマイクロシュリーレン技術の能力を実証することができます。光学的に透明な流体は、マイクロシュリーレン法は、混合プロセスの三次元の特徴を保持する瞬間フルフィールド情報を提供するための魅力的な診断ツールです。

質量分率の正および負の勾配の両方について異なるレイノルズ数下のグレースケール比率I / I 0は、T-マイクロ流路の途中に現れる対称バンドと（ 図2）が示されています。低レイノルズ数では、シュリーレンバンドの尾が原因ミキシングインターフェースを介して分散液に拡大し、ぼやけます。レイノルズ数が増加するにつれて、拡散長は、より狭い帯域につながる短縮します。異なる下流の場所で、強度変化ΔIの変動は/ Iは、クロスストリーム方向0を定量（ 図3）が示されています。較正プロセスの結果は、（ 図4Aに示されています および4B）。 I / I 0〜W /∂∂yの関係が線形とレイノルズNUMとは無関係ですBER。回帰分析から、I / I 0 = -110∂∂Y +∂W /∂Y&gt; 0、I / I 0 = -160∂用1.03 / W /∂Y + 0.83 W∂W /∂Y &lt;0のため、∂∂Y / Wは μmで-1です。相対的な不確実性が±3.8％であり、それぞれ、 図4に3.2％、±します。データ点は平準どこ検出限界に達します。これは、正および負の勾配の傾きのずれが3珍しいことではないことに留意されたいです。これらの式を使用して、マイクロ流体発振器4の時間質量分率の勾配の変化（ 図5）に見られます。混合インタフェースは、キャビティ領域内に偏向され、不安定cを流すれますommences。このビデオ図は明らかに、マイクロ流体発振器内の流れの振動の性質を明らかにし、マイクロ流体デバイスの時間分解全視野の濃度勾配を捕捉するためにマイクロシュリーレン法の能力を実証します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52915/52915fig1.jpg" /> 光学装置の図1の回路図。ナイフエッジの向きは、屈折率の正の勾配で暗いバンドが生成されます。光は、屈折率を増加させる方向に偏向します。対物レンズは、画像を反転させているため、ブロッキング- Y領域は、歪んだ光を遮蔽し、暗いバンドが生成されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52915/52915fig2.jpg" /> unde T-マイクロチャンネル内で混合するためのグレースケールの読み出し図2.レシオ<html>異なるフロー構成をrは正および負の勾配は、それぞれ、暗い部分と明るいバンドをもたらします。レイノルズ数が増加すると、帯域がより濃縮なります。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52915/52915fig3.jpg" /> 図3の正および負の両方のグラデーションのクロスストリーム方向の強度変化の変化。 再 = 1及びRe = 5。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52915/52915fig4.jpg" /> 質量分率の勾配とグレースケール比と図4の関係。正と負の両方の勾配については、グレースケールの比率が質量分率の勾配で直線的に変化します。 915 / 52915fig5.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52915/52915fig5.mp4" target="_blank">図5（ビデオ図）。</a> 再 = 250フロー振動を介して混合特性でマイクロ流体発振器における質量分率勾配の進化に成功マイクロシュリーレン法によって捕捉されます。

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Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

analyzing-mixing-inhomogeneity-microfluidic-device-microscale

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K ビュー.  National Taiwan University. Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image. 

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

腫瘍微小環境を再作成するためのマイクロ流体デバイス<em&gt;体外で</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

生物工学

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

複数の異なった株を勉強するためのマイクロ流体デバイス

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant exogenous molecular probes into cells. This work reports a microfluidic electroporation platform capable of performing multiple molecule delivery to mammalian cells with precise and molecular-dependent parameter control. The system&#8217;s ability to isolate cells with uniform size distribution allows for less variation in electroporation efficiency per given electric field strength; hence enhanced sample viability. Moreover, its process visualization feature allows for observation of the fluorescent molecular uptake process in real-time, which permits prompt molecular delivery parameter adjustments in situ for efficiency enhancement. To show the vast capabilities of the reported platform, macromolecules with different sizes and electrical charges (e.g., Dextran with MW of 3,000 and 70,000 Da) were delivered to metastatic breast cancer cells with high delivery efficiencies (&#62;70%) for all tested molecules. The developed platform has proven its potential for use in the expansion of research fields where on-chip electroporation techniques can be beneficial.

A microfluidic vortex assisted electroporation platform was developed for sequential delivery of multiple molecules into identical cell populations with precise and independent dosage control. The system&#8217;s size based target cell purification step preceding electroporation aided to enhance molecular delivery efficiency and processed cell viability.

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue安定化のためのマイクロ流体デバイスの層ごとのコラーゲン沈着

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.