Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

イリジウムの1の合成（III）錯体<ol><li> [2 -ClのIr（PPY）] 2の 53.6 mgの（50マイクロモル）を秤量し、塩化メチレン5mlに溶解します。撹拌棒を備えた50mlの三角フラスコにこの溶液を加えます。 </li><li> AgOTfの26.2 mgの（100マイクロモル）を秤量し、メタノール5mlに溶解します。 </li><li>溶解にAgOTf [IR（PPY）2 -Cl] 2溶液を添加し、1時間撹拌します。 注：クリーム色のスラリーが生じるはずです。 </li><li> 1時間後、25×95ミリメートルのドラムバイアルにシリカゲルを通してスラリーをフィルタリングし、ロータリーエバポレーター（5~10分）を使用して残りの溶媒を蒸発させます。 </li><li>溶媒の大部分が除去されると、油状の黄色の残留物をバイアル中に残っていることを確認します。この残渣に、製品を再溶解し、黄色の固体生成物を得た1-2日間凍結乾燥するメタノール1mlを追加。 </li><li> &lt;HによってIR（PPY）2（H 2 O）2 +製品（Ir1を）を特徴づけますSUP&gt; 1 NMR、ESI及び紫外-可視（CDCl 3中）前述のように23 </li></ol>様々なアミノ酸とIr1を2.相互作用<ol><li>メタノール中Ir1を2 mM溶液（MW 537.10グラム/モル）を準備します。固体の完全な溶解を確実にするために渦。 </li><li>準備HEPESで、次のアミノ酸及び生体分子の100μMのソリューションは、生理食塩水（HBS、100mMのHEPES、137mMのNaClを、pH7.4）でのAla、Aspの、Cysを、彼の、イル、リジン、セリン、試してみてください、ヴァルをバッファリング。 </li><li>ピペット黒色96ウェルプレートに各アミノ酸を100μl。ブランクとして機能するようにプレートにHBSの100μlを添加します。 </li><li>各サンプルに2 mMのIr1を溶液の2.5μLを加え、10分間プレートシェーカー上でプレートを横に振ります。 </li><li> 10分後、96ウェルプレートリーダー（365 EX / EM 400〜700）を使用して、試料の発光スペクトルを取得します。 <ol><li>楽器でプレートを置き、新​​しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。 </li><li>新しいEXPを設定波長365nmの励起波長とトップの位置に光学系で9ナノメートルのスリット幅で蛍光スキャンを読み取るためのeriment。 </li><li> 5nmのステップサイズで300〜700 nmでの発光を読みます。 </li><li>データ分析のためのデータをエクスポートします。 </li></ol></li><li>透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを使用して発光をサンプルを転送します。 </li></ol> BNT-IIとIr1を3.滴定<ol><li> HBS中BNT-II（MW 8233.6グラム/モル）の1mMストック溶液ならびにメタノール中Ir1を2mMの溶液を調製します。 </li><li>ストック溶液から、HBS中の100μMのBNT-IIの1ミリリットルを準備します。サンプルは混合であることを確認するためにマイクロチューブをボルテックスし。 </li><li>シリアル1.56μMBNT-IIの最終濃度になるようにHBSに半分に100μMのBNT-IIを希釈。 </li><li> HBSは96ウェルプレートのウェルに、空白となると、三連で、各希釈液100μlを追加します。各サンプルに、2 mMのIr1を2.5μlを添加します。 </li><li> SHプレートシェーカー上で10分間、プレートAKE。 </li><li>振とう後、96ウェルプレートリーダーを用いて510nmで（365nmの励起）の発光強度を読み取ります。 <ol><li>楽器でプレートを置き、新​​しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。 </li><li> 510ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長と蛍光エンドポイントを読み取るための、新しい実験を設定します。トップの位置に光学系と、9nmに両方の波長用のスリット幅を設定します。 </li><li>プレートを読み、分析用のデータをエクスポートします。 </li></ol></li><li>透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを用いて滴定を、サンプルを転送します。 </li></ol>生物層干渉法Ir1を/ BNT-IIシステムの4リアルタイム速度論的解析<ol><li>黒色96ウェルプレートの最初の列の8ウェルに、プラスチックセンサーに板を挿入し、運動緩衝液200μl（0.02％のTween-20と1×リン酸緩衝生理食塩水KB）を追加しますホルダー。慎重に先端がバッファのウェル中に懸濁されるように、プラスチック製のホルダーに最初の列に8のNi（II）NTAバイオセンサーを転送します。干渉器の左側にプラスチック製のホルダーを配置します。 </li><li> KBでBNT-IIの0.5μM溶液2mlを準備します。 </li><li> KBにIr1を10μMの溶液500μlを用意し、シリアルKB単位で0.156μMまで半分に希釈します。 </li><li>新しい黒96ウェルプレートにKBのピペット200μlの列AとCの全8ウェルに</li><li>同じプレートでは、列Bのウェルに0.5μMBNT-II溶液をピペットを200μl </li><li>よくD1にブランクとしてKBで始まるピペットD列にIr1をの各希釈液200μlを、。ウェルが列ダウンIr1を濃度の増加ように希釈液を追加します。 </li><li>事前湿潤センサーを含むプレートの右にある器具で、このプレートを置きます。 </li><li>生体層干渉ソフトウェアでは、基本的なKINETを設定ICプレートを定義することによって、実験、分析、およびセンサチップ。 <ol><li>プレートを定義するには、画面上の列を選択し、右クリックして、井戸のための適切な定義を選択します。列Dの列Bの列AとCの「バッファ」、「ロード」、および「サンプル」を選択</li><li> （「追加」をクリックします）、次のステップを追加することで、次のタブでのアッセイを定義します。平衡化（カスタム）、60秒;読み込み中、120秒。ベースライン、60秒;協会、120秒。と解離、300秒。平衡化工程を選択し、（列B）、ベースライン（列C）、協会（列D）、および解離（列C）をロードするための列Aの繰り返しをダブルクリックします。ニッケル（II）NTAセンサーを選択します。 </li><li>次のタブに移動し、センサーはプラスチック製のセンサホルダの列Aであることを確認。 </li><li>実験が正しく概説されていることを確認し、ファイル名を挿入し、「遅延実験」がチェックされ、キーを押していることを確認し、「行きます。」 N注意速度実験を概説された後にプログラムとしてにより機器の自動化された性質のために、手順が発生します。 </li></ol></li><li>運動の実行が完了すると、提供処理ソフトウェアでデータを処理します。 <ol><li>左側のパネルの下部にある目的のファイル名でフォルダをダブルクリックします。次に、パネルの上部に「速度論」の下に対応するフォルダをダブルクリックします。 [処理]タブに移動します。 </li><li>センサー選択画面を開くには、左の減算ボックスにチェックを入れます。右だけでなく、A4をクリックして、リファレンスのウェルにウェルタイプを変更します。 </li><li> Y軸の位置を調整するには、次のボックスをチェックし、選択されたステップは、ベースラインであることを確認してください。ベースラインの最後の5秒（約55〜60秒）であることが時間範囲を指定します。 </li><li>インター段階補正のためのチェックボックスをオンにして、解離に整列を選択します。サビツキー·ゴーレイフィルタボックスがチェックされていることを確認し、キーを押し、「プロセスデータ！̶1; </li><li> [Analysis]タブに移動します。 1：「協会と解離は「分析とモデルが1であることをするためのステップのための選択であることを確認してください。ローカル、フルフィットを選択し、Enterキーを押し、「フィットカーブを！」 </li><li>テーブル内のすべての曲線を強調表示し、右の色にすべてのカーブを設定する]をクリックします。次に、センサーによって色とRmaxのリンク解除によってグループ化されたグローバル（フル）フィットを、選択します。を押して「カーブにフィット！ &quot;グローバル動態データを取得します。 </li></ol></li></ol> 5.オンビーズIr1を有するBNT-IIの検出とrcHRP-II <ol><li> 1ミリリットルをBNT-IIおよびTweenでHBSでrcHRP-IIの1μM溶液をそれぞれ準備（HBSTを、0.025％Tween 20でHBS）。 </li><li>直列15.6 nMでの最終濃度にHBSTに半分に各タンパク質を希釈します。 </li><li>ピペット最高濃度下欄に最下位から順に希釈液の白色96ウェルプレートに三重の各希釈液100μl、、。 </li><li> 50ミクロンのNi（IIのピペット10μL）NTA磁性アガロース粒子各希釈ウェルに。 <ol><li>粒子が懸濁した滞在を保証するために、各ピペッティングした後、磁性粒子を含むマイクロチューブをボルテックスし。 </li></ol></li><li>粒子とサンプルをインキュベートし、15分間プレートシェーカー上でプレートを置きます。 </li><li>このインキュベーション期間の後、96ウェルプレートの磁石上に板を置き、粒子が溶液からの撤退をするための30秒を待ちます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、元のサンプルをやってのけるし、廃棄物として廃棄します。磁石からプレートを取り外します。 </li><li>各ウェルマルチチャンネルピペットを使用してHBSTの200μlを添加します。磁性粒子を洗浄するには、上下に数回バッファをポンプ。 </li><li>背面磁石の上に板を置き、粒子が溶液からの撤退をするための30秒を待ちます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、緩衝液200μlをやってのけるし、廃棄物として廃棄します。磁石からプレートを取り外します。 </li><li>繰り返しは5.8 througステップH 5.10 2回は、粒子の3回の洗浄を完了します。 </li><li> 2 mMのIr1を2.5μlのに続いて、各ウェルを含有する磁性粒子にHBSTの100μlを添加します。 </li><li> 1時間プレートシェーカー上Ir1を有する粒子をインキュベートします。 </li><li> 1時間後、96ウェルプレートリーダーを用いて510nmで（365nmの励起）の発光強度を読み取ります。 <ol><li>楽器でプレートを置き、新​​しい実験をセットアップするために、プレートリーダーソフトウェアを開きます。 </li><li> 510ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長と蛍光エンドポイントを読み取るための、新しい実験を設定します。トップの位置に光学系で、9 nmの両波長用のスリット幅を設定します。 </li><li>プレートを読み、分析用のデータをエクスポートします。 </li></ol></li><li>透明な96ウェルプレート及び画像にUVトランスイルミネーターを用いて滴定を、サンプルを転送します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

微粒子ベースの診断ツールは、現代の診断技術の最前線に来ているように、直接、粒子の表面上の標的生体分子の検出は、大きな利点です。そのようなELISAおよびPCRなどの従来の分子検出法は、その中にそれらが検出25の非常に低い限界を達成することができ、有利で ​​す。しかし、これらのアッセイは、広範囲な試薬および長いプロトコルが必要です。このアッセイは、時間および試薬の要求（ 図5）なしにELISA型サンドイッチの相互作用を模倣するように設計されました。典型的なELISA用抗体のコストはサンプルあたり$ 0.20から0.30であるのに対し、さらに、サンプルあたりIr1をプローブのコストは、ペニーの周りにあると推定されました。 上記の方法は、マラリア、バイオマーカーの検出のためのシクロメタル化イリジウムプローブに依存しているので、このプローブは、 すなわち （他の検出方法に共通の故障モードの影響を受けやすいではありません。フルオロフォアquenchiNGおよび抗体/酵素分解）。ヒスチジンは、その金属結合特性に独特です。概説仕事は、金属含有錯体を有する典型的なELISAサンドイッチに抗体を置き換えることによって、この現象を利​​用しています。ニッケル（II）、NTAは、粒子の表面上にrcHRP-IIを捕捉し、Ir1を、タンパク質の存在を示します。アッセイの中で最も重要なステップは、磁性粒子は、サンプルとプローブと混合することを可能にします。 96ウェルELISAプレートにおいて、生体分子および試薬は、ウェルの底部の二次元表面に平衡に達します。磁性粒子は、利用可能な結合部位を減少させるそれらの緻密な酸化鉄コアに溶液から沈降する傾向があります。したがって、粒子は、最大結合を確認するためにアッセイ時間中に混合しなければなりません。 疾患の診断のための試薬を設計するとき、人は心の中で、患者試料の形だけでなく、バ​​イオマーカーの生理的濃度を維持する必要があります。のためにマラリア、患者の血液中のPF HRP-IIの濃度が高いナノモルの低いピコモルから変化させることができます。このアッセイは、感染のより高いレベルのために臨床的に関連するが、検出限界は、PF HRP-II循環低いピコモルで無症候性の患者を検出するために改善する必要があります。上記に概説した方法では、「スイッチオン」Ir1をによって生成された信号は、ヒスチジンの存在下で起こります。マラリアのバイオマーカーは、ヒスチジンが豊富であるが、例えば、ヒト血清アルブミンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質のような他の血清タンパク質は、プローブの信号応答を誘発するであろう。これにより、偽陽性の診断につながります。これは有益なステップは、その中で目的のタンパク質を迅速に患者試料から抽出することができる粒子の表面上のタンパク質の捕捉を行います。さらに、二機能性プローブの設計、堅牢な分子認識素子に結合ヒスチジンリッチなペプチド（ すなわち 。アプタマーこと）、アッセイに特異性の別の層を追加することができます。ペプチドは、アプタマーに結合する前に、イリジウムでロードされることになります。アプタマーと標的特異性を達成しながら、このような設計では、安定したIr1をプローブは依然として利用することができます。これは、複雑なマトリックス（ すなわち、血漿又は全血）中に、ネイティブHRP-IIを検出し、非特異的結合効果を低減するためのプローブの適用を可能にします。さらに急速な診断テスト信号を高めるために、アッセイは、PF HRP-IIは、電気化学的読み出し26としてRDTsに検出することができる電気化学発光（ECL）システムに組み込むことができます。この次世代イリジウムプローブが大幅疾患バイオマーカーの検出のための私達の上にビーズELISAアッセイを高めるであろう。

比色および蛍光標識は、生化学分子の検出と追跡のための重要な方法であり、1,2を処理します。最も一般的な蛍光マーカーは、低分子量の有機色素3,4あるが、これらの分子は、常に理想的な光学特性を有していません。蛍光色素は、多くの場合、小さなストークスシフトを有し、重複励起及び発光スペクトルを有していてもよく、光退色する傾向があります。比色標識は、多くの場合、イムノアッセイ定量5,6において有用な増幅された信号を持っている酵素標識の使用によって達成されます。これらの酵素はまた、感光性、反応条件、およびショート基板の貯蔵寿命を含む、それらの欠点を有します。これらの特性は、高価な試薬を用いて十分に制御された条件下で行われるイムノアッセイ及びタンパク質標識法を必要とする傾向があります。 発光遷移金属錯体は、FO代替標識アプローチとして検討されています生化学的検出rを。具体的には、イリジウム（III）が10、触媒11、及びタンパク質/細胞染色12-14を感知ダイオード（OLED）7-9酸素有機発光との関連で研究されているシクロメタル化。高い光と量子効率は、プローブのこのクラスの生体分子検出15,16のための良好な候補を作ります。これは、以前に、不可逆的にヒスチジンを結合して、青緑色の信号応答12,17を引き出す+形のシクロメタル化イリジウム（III）錯体、こと[2 IR（C ^ N）2（SOLV）]が見つかりました。これらの複合体はsolvento状態で非発光であるが、ヒスチジンが溶媒分子を置換し、金属中心に結合する場合、それらは長波長のUV照射後の強いリン光信号を放出します。このシグナルは、リガンドの置換の後に発生し、三重項状態の電子の結果は、金属配位子電荷移動（3 MLの活性化を介して基底状態に弛緩されCT）とリガンド中心転送（3 LC）は8,15の経路。これらの複合体は、潜在的に、ヒスチジンが豊富なタンパク質の検出用プローブとして用いることができます。 ヒスチジンに富むタンパク質およびそれらの規制値は、肝硬変、癌、および血栓性疾患を含む、多くの疾患において重要である。18熱帯熱マラリア原虫のヒスチジンリッチプロテインII（pfHRP-II）、特にマラリア原虫感染症によく検証バイオマーカーです。このタンパク質は、主に特性AHHAHHAAD繰り返しモチーフ19内に、67 kDaであり、34％のヒスチジンが含まれています。これらのヒスチジン反復は、ホスト、血液中の遊離金属イオン19とヘム複合体20を結合することができます。 pfHRP-IIは、一般的に免疫クロマトグラフィ迅速診断テスト（RDTs）を用いた低リソースの設定で検出されましたが、これらのテストが原因サンプル条件、低バイオマーカー濃度、貧しい製造基準、および抗体の劣化21にしばしば不正確です。 [IR（PPY）2（H 2 O）2] +（Ir1を）の使用は、pfHRP-IIの分岐鎖状ペプチド模倣は、22を検討しています。この相互作用の速度論は、生物層の干渉技術を使用してリアルタイムでモニターしました。アッセイは、検出のナノモル限界が達成された上でビーズELISA型のフォーマットに適合させました。それは代わりに4-5時間、典型的なELISAを用いて、必要な生物学的試薬の、抗体を含まない試薬を用いて、2時間未満で行うことができるので、このアッセイは、伝統的なELISA法を超える利点を保持しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

この作品は、非発光の合成を概説し、シクロメタル化イリジウム（III）錯体、IR（PPY）2（H 2 O）2ヒスチジンに配位したときに迅速な、長寿命のリン光信号を誘発+（Ir1を）、磁性粒子の表面に固定化されたタンパク質を含有します。高収率でIr1をの合成は、完全なO / Nであり、親の分割を含む溶媒和複合体の2当量にイリジウム（III）クロロ架橋二量体をシクロメタル化。 特異性を確認するために、合成されたプローブを添加した場合にいくつかのアミノ酸は、配位活性についてプローブした、唯一のヒスチジンは、信号応答を誘発しました。 BNT-II、マラリアバイオマーカーヒスチジンリッチプロテインII（pfHRP-II）の分岐鎖状ペプチド模倣を使用して、イリジウムプローブは、HRP-IIを検出するためのツールと​​して確認されました。 L-ヒスチジン/ Ir1をと比較した場合、消光効果はBNT-II / Ir1を滴定で認められたが、これらは立体障害及びトリに帰属し、plet状態消光。生物層干渉はBNT-IIとの相互作用のIr1をリアルタイム動態を決定しました。システムを最適化した後、プローブを使用してrcHRP-IIの検出限界は、溶液中で12.8 nMであることが見出されました。このタンパク質は、50ミクロンの磁性アガロース粒子の表面上に固定化した場合には、検出限界は14.5 nMでした。堅牢な信号この無機プローブの応答だけでなく、溶液中での使用の柔軟性や表面上に固定化は、診断での使用からの撮像に、種々の用途に向けて自分自身を貸すことができます。

図1、金属中心に不溶性のAgClの形の塩化物の沈殿による親二量体中の塩化物橋のIr1をsolvento錯体関与分裂の合成と水の分子の会合に示すように。 Ir1をの形成は、1 H NMR及びESIにより確認しました。 365 nmで励起した場合に加えて、金属配位子電荷移動の特性UV可視バンドとπ-π*遷移がさらにIr1をの形成を検証する、スペクトルに割り当てられていた。これは、複雑な展示ノー発光文字を溶媒和しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> 図1：Ir1をの合成とキャラクタリゼーションジクロロテトラキス（2-（2-ピリジニル）フェニル）二イリジウム（III）の塩化物架橋分割反応はアコ錯体Ir（PPY）2（H 2 O）2を作成します</サブ&gt; +（Ir1を）。 L-Hisの水性緩衝液中のアコ錯体に添加すると、蛍光信号がオンになっています。 複合体が合成され、特徴付けられた後、以前に同様のイリジウムアナログ17を用いて説明したように、アミノ酸の選択は、分析した。 図2Aは、365 nmで励起した場合にのみ、ヒスチジンは、510 nmでの信号応答を誘発することを示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> 図2：アミノ酸選択性とヒスチジンリッチペプチドとIr1をの滴定（A）、50μMと各種アミノ酸（システイン、セリン、ASP、Gluの、Pheで、リジン、アルギニン、のTyr、Trpで、彼の）の200μMの相互作用。 HBSでIR1。スペクトルスキャンは、黒色の96ウェルプレート中で365nmでの励起波長で400〜700ナノメートルから採取しました。すべてのアミノ酸Bからの相対蛍光単位におけるシグナル（RFU）esidesヒスチジン（破線の黒のトレース）はごくわずかでした。 BNT-II（▪）とrcHRP-II（♦）の（B）ナノモル濃度は、HBSでIr1を用いて滴定しました。ヒスチジンリッチペプチドは、365nmの光で励起した後、510 nmでの発光を読み取る前に溶液中で15分間プローブと共にインキュベートしました。検出限界は、yは3σ ブランクを = xの値として算出しました。 この「オンスイッチ」イリジウムプローブのリン光のヒスチジンがコーディネートされたときのIr（III）バイオコンジュゲートの一重項励起状態（1 MLCT / 1 LC）は、三重項励起状態（3 MLCT）へ項間交差を受けるために発生金属中心へ。このプローブは、マラリア、バイオマーカー熱帯熱マラリア原虫のヒスチジンに富むタンパク質II（PF HRP-II）のペプチド模倣BNT-IIに適用しました。 Ir1を有するBNT-IIの滴定では、濃度依存性のシグナル応答が観察されました（ <stronG&gt;図2B）。組換えHRP-II（rcHRP-II）は、溶液中で同様の反応を示しました。溶液中のBNT-IIとrcHRP-IIの検出限界は、それぞれ、54.8 nmおよび12.8 nMでした。生体層干渉法を用いて、BNT-IIに結合するIr1をのK Dは、Ni（II）上に固定化されたNTA表面は2.05μM（ 図3）であることが見出されました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> 図3：ニッケル（II）NTAガラスセンサーの表面にBNT-IIに結合するIr1を種々の濃度の動態分析のためのBNT-II生物層の干渉とIr1をのリアルタイム速度論的解析 。 KB（領域A）にセンサーを平衡化した後、センサーは0.5μMBNT-II（領域B）がロードされます。ペプチドは、センサ上にロードされると、ベースラインは前BNT-II（領域D）にIr1をの結合を測定する（領域C）が確立されています。後に会合の期間は、センサは、解離（領域E）を測定するためにKBに戻されています。全体の動態​​解析処理が30分未満を要します。 磁性粒子プラットフォームに溶液ベースのアッセイから移行すると、システム内の粒子の追加された複雑さを考慮に入れなければなりませんでした。に見られるように、それは、上述し24ブラック蛍光プレートは、溶液アッセイのためにうまくいった。これらの粒子を効率的にマラリアのバイオマーカーPF HRP-IIに結合することが、これまでの研究から知られているが、白色プレートは、上の粒子検出プラットフォームに適したました図4A。白色板では、光は、このように、粒子の表面に結合Ir1をすることによって、より良い吸光度を可能にする、バックサンプルに反映されています。上の粒子アッセイにおいて、rcHRP-IIの検出限界は、14.5 nMで（ 図4B）であると決定されました。溶液中とオンビーズrcHRP-IIの検出限界はSTATISました対応のないt検定（P = 0.731）に基づいてtically同じ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> 図4：オンビーズBNT-IIおよびHRP-IIの検出が50μmのNi黒（II）NTA磁性アガロース粒子の表面にBNT-IIに結合したIr1をから検出された信号との間の（A）の違い96。白色96ウェルプレートに対してウェルプレート（実線）（点線）。粒子は、365nmの光で励起し、発光は510 nmで測定しました。 rcHRP-IIの（B）滴定は、磁性粒子上に固定化し、Ir1をを使用して検出しました。検出限界は、VAのように算出しましたxのLUE yは3σ ブランクを =。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> 図5：Ir1を持つrcHRP-IIのオン·ビーズ検出の概略図 HRP-IIの一般的なスキームは、Ni（II）NTA粒子の表面に結合し、Ir1をで標識されました。粒子は、15分間のヒスチジンリッチペプチドとインキュベートします。このインキュベーション期間の後、粒子を溶液から粒子を引き寄せるために、磁石を用いHBSTで洗浄します。最後に、ペプチドに結合した粒子は、365 nmの光で励起した後、510 nmでの発光を読み取る前に1時間Ir1をインキュベートします。

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IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

マラリアのタンパク質バイオマーカーヒスチジンリッチプロテイン-IIの検出のためのイリジウム（III）発光プローブ

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.1K ビュー.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

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LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

アイス結合タンパク質の調査用のLabVIEWオペ新規ナノリッター浸透圧計

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

化学

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

コロイドプローブナノスを使用して、粒子間相互作用の定量的および定性的調査

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

小オリゴマー形成膜タンパク質の沈降平衡：五量体安定性に対するヒスチジンプロトン化の影響

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

グリコシダーゼ活性の検出のためのインドキシル配糖体の合成

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシンのHPLC測定、

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE  - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

合成 Cathinones の急速な検出のための推定ツールとして色スポット テスト

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

疾患バイオ マーカーの探索のための子供から息コレクション

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...