この作品は、からJLRRに助成金によってサポートされていました：自閉症は、ウェストンヘブンス財団、NIMH R01 MH081880、およびNIMH R37 MH049428、ニーナアイルランドを話す。 PRWは、台湾の国家科学委員会からのフェローシップによってサポートされていました。 SFSは、F32（MH103003）によってサポートされていました。

<ol>
	<li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices.">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li><li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+of+autism:+increased+ratio+of+excitation/inhibition+in+key+neural+systems.">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain.">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li><li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position.">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6.">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li><li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons.">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition.">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li><li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+&#8220;MGE+Enhancers&#8221;+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of &#8220;MGE Enhancers&#8221; for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).</li><li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex.">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

細胞ベースの治療のための胚性神経節隆起（GES）からGABA作動性皮質介在ニューロンの前駆体の使用は、多くの条件12 -1 4のための約束を示している。正確な分子技術を追跡し、特定のニューロンのサブグループ内の対象の遺伝子を発現するために必要とされる。ここでは、移植前にレンチウイルス胚MGE細胞を標識するための詳細なプロトコルを提供し、この技術は、 インビボでの分析のための特定の皮質ニューロンのサブグループ内の対象の遺伝子を発現させることができるかを示す。 本明細書に記載されたプロトコルを確実に用いることができるが、最適な再現性のために、いくつかの重要なステップに付着することが不可欠である。ウイルス形質導入効率的であるためには、まず、生理的温度およびpHが必要である。これらのパラメータが満たされている場合、MGE細胞が約30分で形質導入することができる。第二に、先に進む前に密集MGEペレットを持っていることを確認してください移植をすることができません。限られた容積の損傷を招くことなく、各サイトで新生児マウスの脳に注入することができ、そして細胞が離れて注射部位から移行するため、移植の際にそれらの密度が何でも懸念の少ないので、これは重要である期待した。最後に、最適なものを注入深さを決定するための蛍光レポーターを表現MGE細胞を用いたいくつかの試験条件を実行します。このプロトコルはMGE細胞を使用しながら、CGE細胞も同様に使用することができる。一つの欠点は、全体CGEまたはCGE由来のニューロンの特定のサブグループの発現を制限する多くのCreドライバ線が存在しないことである。しかし、血管作動性腸管ペプチド（VIP）9は CGE由来細胞のこのサブグループを分離するために使用することができる信頼性のCreラインである。新しいラインが利用可能になるように、複数の遺伝子の精度でこのプロトコルを使用することが可能になる。 以前、我々などが示されているエレクトロポレーションを介して、またはレンチウイルス15、17を、移植前にMGE細胞に遺伝子を導入することの有用性。これらの技術は、in vivoでの分析のために遺伝子を導入するのに有効であったが、MGE組織が ​​不均質であり、複数のニューロンのサブグループ、ならびに非神経細胞を生じさせる4。また、それは、特定のニューロンのサブグループにおいて、目的の遺伝子を発現することが困難であった。長足の進歩がdのVIP-Creリコンビナーゼ 9 PV-2A-Creを、しかし、SST-IRES-Creを 、これらに限定されない、PV-IRES-Creを含む多くの皮質ニューロンのサブグループの発現パターンを再現するトランスジェニック系統を生成するためになされている-11、および新しいラインの出現は、将来的には、追加可能な集団を解明するのに役立ちます。また、Cre依存レポーターおよび本明細書中で使用されるCre依存レポーターベクターを含む発現ベクターの生成に、目的の遺伝子のより正確な表現を達成することができる。 <p c小娘= &quot;jove_content&quot;&gt;制限された細胞内でのCreを発現するマウスの脳へのCre依存レポーターウイルスの注射は強力な方法であるが、ウイルスは注射部位から遠く広がらない。これは、困難な個々の方法で、または離れて注射部位からの形質導入細胞を研究すること、細胞をオーバーラップ密集エリアにつながる可能性がある。対照的に、MGE細胞は、個々の細胞の特性のクリーナー評価を可能にする、注射部位から離れて遊走するユニークな能力を持っている。新皮質への細胞の注入の欠点は、通常の接線移動ルートを横断しないことである。このアッセイを使用して接線方向の移行を探索するための一つの選択肢は、同様に細胞を調製するが、代わりに、新生児の仔WT宿主胚の年齢をマッチさせたMGEにそれらを注入することである。この実験では、移植された細胞は、正常な接線ルートを受けるであろう。空間的に制限されてMGE移植を組み合わせることにより、Cre依存レポーターの発現は、形態学的研究によく適し自体である細胞の特定のサブグループ内の対象またはレポーター遺伝子を発現することの実現可能性を示している。 この技術の一つの限界は1つが確実にレンチウイルスベクターにパッケージ化することができる断片の大きさであってもよい。さらに、このアプローチはまだのAAVでテストされていません。この技術は、個々によって最適化されると、しかし、このアプローチの多くの変形を用いることができる。まず、ここで説明するアプローチは、研究者が、特定のCre-ドライバーラインのMGEのドナー細胞と一緒にCre依存レポーターレンチウイルスを使用して記者を表現できるようになります。この技術は、個々のMGE細胞の形態を評価するために、または潜在的に第二の遺伝子をベクターにクローニングされる場合、別のサブグループにおいて、目的の遺伝子を発現させることができる。第二に、それはまた、Cre依存レポーターMGEドナー細胞またはポテンシアでCreを発現するウイルスを使用することが実現可能であるllyは不均一な集団からの細胞の異なる集団における発現を駆動するために、保存されたDNAエレメント、プロモーターおよびエンハンサーを利用する進化​​。 克服する将来のハードルは、潜在的に、精製および/または細胞の特定の群を研究にヒト由来誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞を標識する。興味深いことに、保存されたDNAエンハンサーはまた、皮質への注入後に、初代培養におけるGABA作動性ニューロンを標的とするウイルス発現系において使用することができ、MGE細胞の移植前に15、18、19。エンハンサーは、この障害に回答することができるとなり分子ツールとして関心のある、新しい技術は、治療において、これらの細胞の有用性を検討するために必要とされる。確かに、潜在的にGABA作動性介在ニューロン20またはグルタミン酸作動性ニューロン21を含む他の神経のサブタイプのいずれかを標識することができ発見エンハンサーへの進出は、進行中である。本明細書において、ウイルス標識方法を使用して、それは、移植前およびインビボ分析に関心の異なる細胞を標識するために細胞型特異的エンハンサーで分化したヒト由来の幹細胞を形質導入することが可能である。

残りは、興奮性グルタミン酸作動性に主ニューロンに対応しながら、GABA作動性、皮質介在ニューロンは、哺乳動物の新皮質におけるニューロンの〜20-30％を含む。介在ニューロンは、1をターゲットに軸索と樹状突起の形態およびシナプス電気生理学的特性において非常に多様であり、興奮性/抑制性トーンの不均衡は、自閉症、統合失調症やてんかん2を含む神経/精神神経疾患のいくつかの表現型の根底にあると仮定される。本明細書に記載されたプロトコルの全体的な目標は、効率的に、遺伝的にin vivoでの分析のために、移植前GABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を変更する手段を提供することである。 皮質GABA作動性介在ニューロンは、内側と尾側神経節隆起（MGE及びそれぞれCGE、）3,4と同様に視索前野5で生まれている。皮質介在ニューロン前駆細胞は、長距離接線の移行が続い受けるラジアル移行により、最終的な目標に到達する。彼らの目的地に到着すると、これらの皮質介在ニューロンが正しく、既存の神経細胞のネットワークに統合する必要があり、それぞれの固有の介在ニューロンのサブグループは、特定の方法で皮質回路に貢献していきます。 4つの主なサブグループは、分子マーカーによって識別することができます。MGE由来ソマトスタチン（SST）+及びパルブアルブミン（PV）+サブグループ、およびCGE由来血管作動性腸管ペプチド（VIP）+とリーリン+; SST -サブグループ6。異なる皮質介在ニューロンのサブグループは、MGE及びCGE 7,8における胚発生の間、異なる時間にわたって生まれている。これらおよび他の皮質GABA作動性介在ニューロンのマーカーはこれらのサブグループ9-11の多くの具体的なCre媒介ドライバラインを生成するために使用されてきた。 MGE前駆細胞の移植は、不均衡によって引き起こされる障害を治療するための潜在的な細胞ベースの治療法として浮上している24 - 12を励起/阻害で。これらの治療効果は、多くの周囲の体阻害PV +細胞はMGEから誘導される（分化し、宿主脳に統合、分散させる）、または潜在的にのでMGE前駆体のユニークな能力に一部起因し得る。 MGE細胞はまた、遺伝的に、インビトロで改変された細胞は、in vivoで研究することを可能にする、迅速かつ効率的に移植する前に、15レンチウイルスで形質導入することができる。このアプローチを開発するための理論的根拠は、GABA作動性皮質介在ニューロンの発達と成熟を研究する中で障害物を克服することであった。変異マウスは、そうでなければ、早期の時点で死亡していたとき、特に、MGE移植は、研究者が、in vivoで変異細胞の発達を研究することができた。また、移植前に目的の遺伝子を導入することによって、変異体の表現型に特異的な遺伝子の効果はeffはで評価することができるicient方法。 ここでは、移植前にレンチウイルスMGE細胞を形質導入するための詳細なプロトコルを提供する。さらに、この技術はCre依存発現レンチウイルスおよび入手のCreドライバマウス系統の組み合わせを使用して、皮質介在ニューロン前駆体の異種グループから特定のニューロンのサブグループにおいて、目的の遺伝子を発現するように適合させることができるかを示す。遺伝的にユニークな方法でin vivo試験のためのGABA作動性皮質介在ニューロン前駆体を変更するにはまた、このプロトコルは、技術者や研究者のためのプラットフォームを導入しています。他の現在のアプローチに対するこの技術の1つの利点は、移植MGE細胞が離れて注射部位から分散することである。また、焦点のウイルス注射とは異なり、MGE細胞が分散した後、それらの形態は、評価することが容易です。このアプローチは、特定の細胞型を導入する、野生型または変異型の細胞に、目的とする遺伝子を導入することの効果を研究するために使用することができレポーター形態を評価するための、または潜在的にin vivoでの疾患対立遺伝子の効果を研究する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents and equipment for MGE cell transplantation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G needle</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>Precision bore to deliver 5 &amp;micro;l (comes with plunger)</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond scientific company</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope with boomstand **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital just for mice stereotaxic instrument **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Diamond coated rotary beveler</td><td></td><td>made in house</td><td></td></tr><tr><td>Needle pipette puller</td><td>730</td><td>Kopf instruments</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td>Any drug store or pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Any pipette and tips that can reliaby measure 1 &amp;micro;l of volume</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** These are the particular models we use, but many other setups should work</td></tr><tr><td colspan="4">Optional Reagents (for making Lentiviruses)</td></tr><tr><td>25 mm, 0.45 &amp;micro;m filter</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&amp;reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine &lt;sup&gt;2000 &lt;/sup&gt;(1.5 ml size)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other commercially available supplies</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev plasmid encoding Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmid encoding VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies

胚の内側と尾側神経節隆起（MGE及びCGE）由来のGABA作動性皮質介在ニューロンは、機能的および形態学的に多様である。進出が別個の皮質ニューロンのサブグループの役割を理解する上でなされているが、GABA作動性細胞の異なるタイプの発生および成熟に寄与し得る働いする多くのメカニズムがまだある。また、変更されたGABA作動性シグナル伝達は、自閉症、統合失調症およびてんかんの表現型に寄与し得る。具体的なのCre-ドライバーラインはユニークな介在ニューロンのサブグループの機能を実行小包し始めている。マウスモデルにおける進歩にもかかわらず、効率的に、インビボでの分子アプローチとGABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を研究することはしばしば困難である。これらの細胞の細胞自律的なプログラミングを研究するために使用される一つの重要な技術は、宿主皮質にMGE細胞の移植である。これらの移植細胞は、差別化、広範囲に移動するND機能的に統合する。また、MGE細胞を効率的に分子アプローチの多数を可能にする、移植の直前にレンチウイルスで形質導入することができる。ここでは詳細に効率よく利用できるのCreドライバライン及びCre依存の発現ベクターを用いて、in vivoでの分析のために、移植前にMGE細胞を形質導入するためのプロトコル。それは大きなインビボ細胞型特異的解像度を可能にする、移植後に分散させるためにこれらの細胞の能力を正確に遺伝子操作を組み合わせるので、このアプローチは有利で ​​ある。

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Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABA作動性皮質介在ニューロンの前駆細胞は、移植後のホスト皮質に統合シナプスの開発と、分散させる。これらの細胞は、容易に遺伝的に改変されたGABA作動性前駆体のインビボでの研究のために、移植前に形質導入することができる。ここでは、既存のCreラインとCre依存レポーターを使用して、特定の介在ニューロンのサブグループをターゲットとするウイルス性標識技術を示している。

ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞<em&gt;インビボ</em&gt;研究

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

11.4K ビュー.  University of California San Francisco.  GABA作動性皮質介在ニューロンの前駆細胞は、移植後のホスト皮質に統合シナプスの開発と、分散させる。これらの細胞は、容易に遺伝的に改変されたGABA作動性前駆体のインビボでの研究のために、移植前に形質導入することができる。ここでは、既存のCreラインとCre依存レポーターを使用して、特定の介在ニューロンのサブグループをターゲッ?...

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Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

神経科学

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

発生生物学

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

遺伝学

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point measurements and can therefore only evaluate longitudinal changes of cell migration and survival to a limited extent. This paper provides a reliable, minimally invasive protocol to transplant and longitudinally track neural progenitor cells (NPCs) in the adult mouse brain. Before transplantation, cells are transduced with a lentiviral vector comprising a bioluminescent (firefly-luciferase) and fluorescent (green fluorescent protein [GFP]) reporter. The NPCs are transplanted into the right cortical hemisphere using stereotaxic injections in the sensorimotor cortex. Following transplantation, grafted cells were detected through the intact skull for up to five weeks (at days 0, 3, 14, 21, 35) with a resolution limit of 6,000 cells using in vivo bioluminescence imaging. Subsequently, the transplanted cells are identified in histological brain sections and further characterized with immunofluorescence. Thus, this protocol provides a valuable tool to transplant, track, quantify, and characterize cells in the mouse brain.

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

We describe the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells transduced with a dual reporter vector expressing luciferase-green fluorescent protein (GFP) in the mouse brain. After transplantation, the luciferase signal is repeatedly measured using in vivo bioluminescence and GFP-expressing grafted cells identified in brain sections using fluorescence microscopy.

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

カルシウムインジケーターを用いたラット三叉神経節のin vivo可視化

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

著者スポットライト:三叉神経損傷における神経因性疼痛の末梢メカニズムの探索 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞

要約

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と生体内生物発光追跡

生体内ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と生体内生物発光追跡

生体内ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング