この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会によってサポートされていました。微細加工は、マギル大学のマギルナノツールのMicroFab施設、カールトン大学の電子部門の支援を受けて実施しました。

血液は、オタワ大学（H11-13-06）の倫理委員会の承認を得て、健康な個体から収集されます。 1.マイクロチャネルの作製マイクロチャネルは、標準的なフォトリソグラフィ法18に基づいて製造されています。 <ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、マイクロチャネルの幾何学的形状を設計し、透明性のフォトマスクの設定を印刷します。これらは、製造工程中に光路を決定するので、これらのマスクは重要です。この場合には、マイクロチャネルの寸法は、厚さ120ミクロン、深さ60ミクロン、長さ7ミリメートルです。 </li><li>クリーンルームでは、スピンコートは、エポキシ系負所望のマイクロチャネルの深さ（60μm）を得るために30秒間2000rpmでシリコンウェハ上にフォトレジスト。 </li><li> 70秒間ウェハ650ミリジュール/ cm 2でUVランプの下でフォトマスクを公開します。唯一の透明な領域を露出させることを確認しUV光へのフォトマスク。透明領域の曝露は、フォトレジストの硬化をもたらす鎖の重合を可能にします。 - フォトレジストの過剰を削除する開発者に、シリコン片を浸し。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）の溶液を作成するために1：金型が製造されると、10の比率で、シリコン系エラストマーと硬化剤を混合します。脱気真空チャンバ内にPDMS溶液を入れてください。金型にそれを注ぎ、マイクロチャネルを作成するために90分間60℃に加熱します。その後90秒間酸素プラズマボンディングを用いてガラススライドに個々のチャネルを結合。 NOTE：PDMSの脱ガス処理は、混合プロセスによって生じる気泡を除去するために行われます。 </li><li>マイクロチャネルの寸法が成功テストのために許可されていることを確認。このプロトコルでは、マイクロチャネルは、120×60μmの長方形の断面を有します。対照的に、平均RBCは8μmで2ミクロンの厚さの直径を有します。ザreforeは、マイクロチャネルの幅は、適切な凝集を観察し、正確な速度プロファイルを決定するのに十分です。 </li></ol> 2.血液の準備<ol><li>倫理委員会の承認を得た後、健康なボランティアドナーから血液を採取します。採血管に存在するエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と血（血液4ml中7.2ミリグラムのEDTA）を扱います。 注：EDTAは、血液凝固を回避するために使用されます。 </li><li>血液成分を分離するために、1400×gで（3,000 rpm）で血液サンプルを10分間3回遠心。遠心分離の結果、三つの異なる層を観察します。 注：3層（管の底にある）RBC層、バフィーコート（RBC層の上に位置白血球及び血小板からなる）と、（他のすべての上に位置するプラズマ層であります成分）。 <ol><li>最初の遠心分離後、血液ピペットを用いて血漿を収集します。任意のCを回避バフィーコートでontact。 </li><li>収集し、10％に希釈した漂白剤で容器内にバフィーコートを処分。 </li><li>残りのRBC層と管のそれぞれにpH7.4のPBSの3ミリリットルを追加し、遠心分離機の適切なバランスを確保します。ゆっくり10分間1400×gで（3,000 rpm）で再びチューブと遠心分離機を混ぜます。 注：これらは細胞接着を変更する可能性があるのでPBS溶液は、任意のマグネシウムやカルシウムが含まれていないことを確認してください。 </li><li> 2回目の遠心分離後にチューブにPBSを処分し、存在する場合、残りのバフィーコートを除去します。繰り返して、きれいな赤血球を生成する第三の遠心分離のために2.2.3と2.2.4を繰り返します。 </li></ol></li><li>対応する（5％、10％及び15％のRBC懸濁物を得るために1 mlチューブにプラズマできれいな赤血球（0.95 0.9 0.85 ml）を必要量（0.05 0.1 0.15 ml）を混合します）ヘマトクリット。微量でヘマトクリットを確認してください。 </li></ol> 3.流体の準備<ol><li>蛍光トレーサー粒子溶液を60μl添加し（1％固体、D 粒子 = 0。86ミクロンは、λは= 542 nmの腹筋 1ミリリットルRBC-サスペンションチューブへ= 612 nmおよびλ 放射 ）。 注：蛍光トレーサー粒子（内部染めポリスチレン粒子）は、マイクロチャネル内の流れの速度を測定するために使用されます。レーザー光（λ= 542 nm）での対応する波長に曝露されたときにこれらの粒子は、蛍光を発します。 </li><li> pH7.4のPBS溶液を調製し、PBS溶液1mlで同じ蛍光トレーサー粒子溶液60μlを添加します。 </li></ol> 4.集約サイズ測定<ol><li>マイクロチャネル内の流体（RBC-懸濁液とPBS）を挿入するには、25μlの100μlに二枚のガラスの注射器を使用しています。この意志システムのコンプライアンスを減少させるのに役立ちます。エントリー穴をフィッティングチューブとコネクタを介して注射器にマイクロチャネルを接続します。流体容器と注射器との間に存在する圧力差を用いて、ガラスシリンジを埋めます。気泡がシステムに存在しないことを確認してください。別の方法としては、マイクロチャンネル内で両方の流体を駆動するために、圧力制御システムを使用しています。 </li><li>ハイスピー​​ドカメラとμPIVシステムに接続された倒立顕微鏡のステージ上にマイクロ流路を配置します。プログラム所望の流量（PBSのためのQ = 8μL/時の流量をengendering血液ため例えば、Q = 2μL/時）のシリンジポンプ。 注：唯一のシリンジポンプが使用されています。二つの異なる内径を有する、二つの異なるガラスシリンジを使用して、Y-マイクロチャネルの各ブランチに入る流量を変化させることが可能です。 </li><li>に示すように、異なるエントリ·ブランチから、異なる流量でそれぞれ二重Y-マイクロチャンネル内で両方の流体を挿入<stronG&gt;図1。異なるせん断速度をテストするために、ポンプの流量を変更します。これは、2つの分岐19（ 図2、図3）との間で同じ適切な比率（この場合は4）を維持します。流れは測定値を取得する前に定常状態に到達するのを待つ：視覚的に円滑な流れのための高速カメラの画像を検査します。 注：血液比は、層内の線形速度プロファイルを得るために重要です。 </li><li>ハイスピー​​ドカメラを使用して、赤血球を可視化します。流体の流れの画像を制御し、記録し、保存するために、カメラをコンピュータに接続します。二つの流体の流れが定常状態に到達すると、録音を開始します。 <ol><li>より良い処理結果を得るために複数の画像を取得します。凝集体の鮮明な画像に最適なカメラの露光時間を決定します。 注：この場合のカメラの露光時間は0.5ミリ秒でした。各フレーム間の時間間隔の選択は、カメラのフレームレート及びtでの流量に基づいています彼は、マイクロチャネル。この手順で処理された各フレーム間の時間は60ミリ秒でした。したがって、秒当たり18フレームを記録することが可能なカメラで十分です。 注：誤った測定結果につながる可能性がある、チューブ、シリンジに血液沈降を避けてください。 </li></ol></li><li>次のように画質を改善する画像処理技術（ここではMATLABプログラム）を用いて、（ 図4に示す）が画素強度に基づいて、各画像に凝集体を検出します。 <ol><li>画像は、フレーム毎に良好な画像品質を得るために、ヒストグラム等化法を用いてコントラスト向上。 </li><li>グレースケール画像は、二値画像に変換します。この目的のために、各ピクセルの変換を指示すること、0〜1の範囲の閾値を設定します。閾値よりも大きい値を持つ画素が白画素として検出され、一方、閾値以下の画像の任意の画素は、黒画素として検出されます。 </li><li>塗りつぶしより良い結果を得るために1つの集約内のギャップに対応する孔（存在し、必要に応じて）。 </li><li>隣接するセルが凝集体として関連しているように、二値画像における隣接白画素を決定することによって細胞を検出します。 </li><li>検出された別の集合体にラベルを付け、より良い視覚化のために、赤、緑、青（RGB）画像に二値画像に変換します。画像処理技術の有効性を確認し、 図5に示すように、すべてのセルは、考慮されることを確実にするために対応する処理画像のそれぞれにオリジナルフレームを組み合わせる。実行手順4.5.1、4.5.2、4.5.3キャプチャされたすべてのフレームのために、4.5.4および4.5.5。 </li><li>検出された画素の数に基づいて、フレーム内で検出された各集合体の面積を計算します。使用するレンズの倍率に基づいて、較正レチクルを使用して、変換係数を計算し、ミクロン2に結果を変換します。それぞれで検出された集合体サイズを平均化フレーム、その後はRBC-懸濁液の各記録の平均凝集体サイズを得るために、すべてのフレームの結果を平均します。 </li><li>各検出された集合体の中にRBCの代表推定数を決定するために1つのRBCの面積を計算します。 図6に示すように、これらの結果を用いて、（各集計内のセルの推定数によって表される）集計のサイズの関数として各集計内のRBCの割合の分布を計算します。 NOTE：RBC凝集体を測定するために、ImageJソフトウェアは、各フレームに同じタスクを実行する（代わりにMATLABの）使用することができます。 </li></ol></li></ol> 5.流体の速度とせん断速度測定流体の速度、ひいてはμPIVシステムを使用して、せん断速度を決定します。 <ol><li>データは、高速カメラを用いて取得された後、μPIVシステムに使用される二重パルスカメラに切り替えます。画像の交流のためのイメージングソフトウェアを使用して速度場の決意のフローと画像処理のquisition。 </li><li>レーザーをオンにする前に、レーザーのクラスに応じて、必要なすべての予防措置をとります。その後、システムは、カメラとレーザーの電源をオンにします。 </li><li>使用するレンズの倍率に基づいてカメラのキャリブレーション。この目的のために、顕微鏡下で10ミクロン精度のマイクロスケールを使用して、画像内の1画素のサイズを設定します。 </li><li>レーザーを起動して、両方の流体中の粒子を可視化します。流れの中で最速の粒子に着目して、マイクロチャネルの中央面を見つける（ すなわち、最も速い粒子は明るいはずです）。 </li><li>粒子の適切な移動を確実にするために、DT（2つの連続するフレーム間の時間間隔）を設定します。最速の粒子は、両画像間の約5〜10ピクセルを移動する必要があります。 </li><li>フローの記録を開始します。 5ミリ秒間隔で、画像の100ペアを取得するためのソフトウェアを設定します。すべてのDIFのために、手順5.4、5.5および5.6を実行しますferent RBC-懸濁液と異なる剪断速度のために。 注：方法論の詳細はピッツとフェネシュ20の研究で示されています。 </li><li>イメージングソフトウェアとの相互相関法を使用して取得された録音を処理します。 注：これは、（流体の流れと、ユーザが選択した時間間隔に基づいて）所定の大きさの小さなウィンドウに一対の画像を離散化で構成されて呼ばれる相関ウィンドウと各ウィンドウ内の粒子の変位を以下に示します。 <ol><li>取得された画像は、優れたデータ処理のために（バックグラウンド減算、「ベースクリッピング」21または22,23の重複画像を含む）の前処理を必要とする場合、最初に決定します。 </li><li>そして、相関窓の大きさや形状、ならびにの重複画像の割合を選択します。詳細な研究は、血液のための最適なパラメータと画像前処理技術を決定するために、ピッツら 24によって実行されました異なるチャネル構成に流れます。 100画像のペアと速度の二乗平均平方根（RMS）誤差から算出した平均速度場として結果を表現します。 </li></ol></li><li> 図7に示すように処理されたデータから、チャネル出口での速度プロファイルを抽出し、より良いプロファイルは、空間内の速度場を平均化します。 注：速度プロファイルを構成するバーは、チャネルの幅を基準に選択された相関ウィンドウサイズに対応しています。速度のRMS誤差はまた、実験的な速度推定の誤差を示す、 図7に示されています。 </li><li>すべての測定および処理が実行された後、レーザーをオフにし、。ソフトウェア、カメラ、ステージを移動し、コンピュータやレーザー：システムのすべてのコンポーネントをシャットダウンします。 </li><li>剪断速度を計算するには、最初に検出し、高速カメラの記録に基づいて、マイクロ流路内の血液の厚さを推定します。この目的のために、すべての平均特定の記録のフレームは、ビデオの背景画像を取得します。 （5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁とき10μL/ hrで流れるRBC懸濁物については、図8に示すように）血液層を区切り。対応する血液層の厚さのために速度値を取得し、血液層の厚さによって、速度値を除算することにより、剪断速度を計算します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

本発明の方法論を使用して、異なる流れ条件及びヘマトクリット下定性的および定量RBC凝集体を分析することが可能です。成功したテストと集計検出のためには、マイクロチャネルの入口に二つの流体の間の適切な速度比を決定するために重要です。この比は、速度プロファイル19準線形である最適な血液層の厚さを得ることは非常に重要です。 成功したテストのためのもう一つの重要な要因は、良好な画質です。この方法は、画像処理に基づいているので実際には、画像の背景（チャネル内の流体）と、検出される粒子間のコントラストを有することが非常に重要です。 図2及び図3に示すようにここで、粒子は、凝集体の検出に役立つ背景よりも暗いように見えます。画像処理技術のために考慮すべき最も重要なパラメータは、tとhreshold値。したがって、コントラストに基づいて、それは、図5に示すように、すべての凝集体が、考慮される最適な閾値を選択することが重要である得られた。この研究のために使用される本画像分割は、広く細胞の検出および計数のために使用されています25〜27。所望の画像の品質がなく、グローバルなしきい値が適切でない場合には、一つのそのような大津の方法28または適応閾値化方法として最適な閾値を決定するために別のアルゴリズムを使用することができる（画像を離散化し、 ）は、各離散化ウィンドウのローカルしきい値を得ることができます。 考慮すべきもう一つの要因は、ミクロンピクセルから適切な変換のためのスケールファクタです。 適切な換算係数を使用して、一方が推定numbeに基づいて（凝集体サイズ分布を決定するのに役立つ1 RBCの直径および厚さを決定することができ各集計中のRBCのR）。凝集体の向きに応じて、適切に1 RBC（正面または側面図）上の領域を計算します。セクション4（ステップ4.4.1）で述べたように、凝集体の動的特性は、各連続するフレームとの間に捕捉されることを確実にするために、適切なカメラの露光時間とフレームレートを決定することが重要です。この値は、測定値を取得する際に使用される流量に基づいています。いくつかの他の要因がμPIVシステムを使用して結果を取得する際に考慮される必要があり、ピッツとフェネシュ20の研究で明らかに説明されています。 方法論は、異なるヘマトクリット値で流れるいくつかのRBC-懸濁液で正常にテストされました。しかし、画像処理技術及び画像背景と骨材との間のコントラストの欠如の制限には、（20％から45％）より高いヘマトクリット用のRBC凝集物を検出することは困難です。実際として言及以前、画質は、この方法論のために重要です。 このプロトコルを使用して、RBC凝集体のサイズは、制御されたマイクロ流体デバイス内で測定することができ、したがって、それが微小で動的にRBC凝集に関する情報を取得し、生理学的剪断速度範囲のRBC凝集体のサイズを得ることが可能です。これは、血液レオロジーの数値と実験研究を補完し、臨床的および病理学的研究に集約サイズと動作を関連付けることも可能です。

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Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

赤血球（RBC）は、血液のレオロジー挙動を決定する上で重要な役割を果たしています。彼らは、ほぼ単独でin vitroおよびin vivoでの血液の特定の性質を担当しています。生理的条件下では、赤血球は、血液量の40％〜45％を占めます。微小循環において、赤血球は、より小さな血管径とプラズマスキミング効果1の血液量の20％までを占めます。微小循環における血漿低減のこの現象は、フォーレウス効果として知られています。低剪断速度では、赤血球は、したがって、血液の非ニュートン挙動に寄与し、一緒にブリッジと「連銭」または凝集体と呼ばれる一次元又は三次元構造を形成することができます。しかし、RBC凝集のメカニズムは完全に理解されていません。二つの理論は、RBCの凝集をモデル化するために存在する：細胞理論の橋渡しを起因高分子2の架橋及び力attracへ浸透勾配3に起因する分子の枯渇によって引き起こさ化理論。 典型的には、ヒトの血液のために、凝集体は、1〜10秒-1までの範囲の非常に低いせん断速度4で形成されます。この範囲を超えると、RBCが脱凝集し、血管内に別々に流れる傾向にあります。 凝集体形成の条件を理解することは、血液のレオロジー挙動を定義するという点で血液レオロジーの分野に非常に重要です。これらの凝集体は、多くの場合、macrocirculationレベル（&gt; 300μmの直径）5で見られています。このスケールでは、血液は、ニュートン流体と均一な混合物と見なされます。しかし、これらの凝集体はほとんど毛細管レベル（直径4-10μm）の中に見られないと、通常、糖尿病6や肥満などの病的状態の指標です。 RBC凝集を変えることができる他の病的状態は、炎症性または感染状態を含み、高血圧やアテローム性動脈硬化症、遺伝性疾患および慢性疾患7などの心血管疾患。したがって、赤血球凝集メカニズムを理解し、（これらの凝集体の大きさや流れの状態との間の関係を定義することによって）、これらのエンティティを分析して、血液のmicrorheological行動の理解につながるので、臨床応用にそれを関連付けることができます。 RBC凝集物は、ヘマトクリット値（血液中の赤血球の体積）、剪断速度、血管径、RBC膜の剛性および懸濁培地組成8-10のようないくつかの要因によって変更することができます。したがって、制御された条件は、効果的にRBC凝集体を分析するために必要とされます。いくつかの方法は、血液の動作に関連する情報を提供しています静的アグリゲーション測定（集計インデックス）を提供することにより、凝集体形成を解析することができます。これらの方法は、とりわけ、赤血球沈降速度を含みます方法11、光透過法12、光反射法13と低剪断粘度法14。 いくつかの研究は、RBC凝集を研究し、制御された流れ条件15-17における凝集の程度を決定することを試みました。しかし、これらの研究は、間接的に凝集の程度についての情報だけでなく、地元の粘度を提供する顕微鏡血液画像に基づいて測定された剪断システム内の占有スペースの比率を決定することにより、赤血球凝集体の大きさを調べます。 そこで、直接制御し、一定のせん断速度下で、動的に、RBCは、微小循環に集約定量化するための新しい手順を提示します。 RBC懸濁物は、したがって、血液層にせん断流を作り出すリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を、（ 図1に示されるように）二重Y字型マイクロチャネルに、同伴されます。この血液層定数シア以内R率を得ることができます。 RBC懸濁物は、異なるヘマトクリット値（H）レベル（5％、10％及び15％）で異なる剪断速度（2-11秒-1）下で試験されます。血流速度および剪断速度は、フローは、高速カメラを用いて可視化されている間、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。得られた結果は、赤血球を検出し、凝集体のサイズを決定するために、画像強度に基づいて、MATLABコードで処理されます。

<table><tbody><tr><td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Plasma system&amp;nbsp;</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-50 series</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescent particles solution (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringes (50 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>High speed camera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>A camera capable of recording 18 frames per second could be used.</td></tr><tr><td>Double pulsed camera&amp;nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 and PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

血液は、非ニュートン生体液として、血液レオロジーの分野における多くの研究の焦点を表します。血液成分は、血漿中に懸濁された赤血球、白血球及び血小板を含みます。によるRBCの存在量（血液量の40％〜45％）に、彼らの行動は、特に微小循環の血液のレオロジー挙動を決定します。非常に低いせん断速度で、RBCが組み立てに見られている、フォームの実体は、血液の非ニュートン挙動を引き起こす、凝集体と呼ばれます。これは、微小循環における血液レオロジーを把握するために、凝集体形成の条件を理解することが重要です。ここで説明するプロトコルは、画像処理に基づいて、一定のせん断速度下で定量的に微小循環におけるRBC凝集体を決定するための実験手順について詳しく説明します。この目的のために、RBC-懸濁液は120×60μmのポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル中で試験され、分析されます。 RBC-懸濁液は、耳鼻咽喉科であります血液層内の線速度プロファイルを得るので、一定の剪断速度の広い範囲を達成するために、第2の流体を使用して雨が降りました。 RBC凝集は、高速カメラを用いて可視化しながら剪断速度は、マイクロ粒子画像流速（μPIV）システムを使用して決定されます。 RBC凝集体の捕捉されたビデオは、画像強度に基づいて、集合のサイズを決定するために画像処理技術を用いて分析されます。

ヒトの赤血球が5％、10％、15％ヘマトクリットで懸濁し、10μL/ hrで流れるために二重Y-マイクロチャネル内の2つの流体の流れの例を図2に示されている。 図3は、時集合サイズの差を示していますチャネル内の流れは、10％のヘマトクリット5μL/時間に10μL/時から減少されます。ヘマトクリットおよびせん断速度を変化させたときに凝集体の大きさの定性的な概念を与える。 図5のカメラのフレームレート必要との定性的な概念の定性的な尺度を提供し、3連続したフレームのために、4つのヒトRBC凝集体の変位を、次の各フレーム内の分布を集計します。媒体集合体をそれぞれ緑と赤で表示され、大きな凝集体（より大きい30が赤血球を推定）（9から30までの範囲が赤血球を推定）しながら、 図5では、（8以下推定赤血球との）小さな凝集体は、青色で示されています。 図7に表示されていますそれぞれ。また、各RBC懸濁液については、図7に表示される速度のRMS誤差は、速度の速度測定の精度を示す値、従って剪断速度に比べて比較的小さいです。インタフェースの場所は、「E」として示され、同図に実線で示されています。 （速度プロファイルと血液層の厚さに基づいて）異なるRBC懸濁物に対応する剪断速度を表1に示す。RBC懸濁物のそれぞれについて決定された平均凝集体サイズを検出するための画像処理法に基づきますRBC凝集体の面積、FUNCTとして、 図9に示されています対応する剪断速度のイオン。各集合内の赤血球の割合の分布の例を図6に示されている。集合サイズは、凝集体中のRBCの推定数として表されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig1.jpg" /> 1.ダブルY-マイクロチャネルの構成とエントリ流体を図 。血液はPBSは、Q = 8μL/時間で第2の分岐に入りながら、Q = 2μL/時で最初の分岐に入る。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig2.jpg" /> 図2.異なるヘマトクリットで人間はRBC-サスペンション。図はでQ = 10マイクロリットル/時で流れるヒトRBC-懸濁液のフレームをキャプチャし表し、（A）5％（B）10％および（C）は、15％ヘマトクリット。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig3.jpg" /> 異なる流量で図3.ヒトRBC-サスペンション。図は、（A）Q = 10μL/時と、（B）Q = 5μL/時を流れる10％のヘマトクリットHで懸濁ヒトRBCのキャプチャされたフレームを表しています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig3highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig4.jpg" /> 集約検出に使用される画像処理プログラムを図4のフロー· ​​チャート。使用される基本的な方法を示す工程説明します。画像の品質は、cであることが強化され<html>二値画像にonverted。凝集体は、それらのそれぞれのサイズに基づいて検出し、標識されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig5.jpg" /> 図5は、RGBの色といくつかのヒトRBCの正味の運動は、3つの連続したフレームのために集計されます。図は、4（A）、T = 0ミリ秒、（B）T = 60ミリ秒で、3つの連続したフレームで検出された骨材との正味の動きを示しています（C）T = 120ミリ秒。大きな凝集体（&gt; 30が赤血球を推定）、培地の凝集物（9-30推定赤血球）および小さな凝集体（&lt;8は、赤血球を推定）、赤、緑、青のそれぞれに示されています。検出された凝集体のそれぞれは、黒丸が付いています。_blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig6.jpg" /> 異なる流量を10％のH RBC-サスペンション図6. RBC凝集体サイズ分布10％のHで懸濁血液サンプルのための集計サイズ分布、Q = 10、5μL/時で流れる。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig6highres.jpg" target="_blank">拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig7.jpg" /> 異なるヘマトクリット図7.速度プロファイルの比較は 、速度プロファイルは、5％のH（赤）、10％のH（青）、15％のH（緑）、シミュレーション19（実線）に懸濁させ、血漿中の赤血球のために示されていますQ = 10μL/時で120×60μmの二重Y-マイクロチャネル。インターフェイスの場所はのためのEで示されています実験。異なる速度プロファイルの対応するRMSエラーが表示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig8.jpg" /> 図異なるRBC-懸濁液および血液層の厚さの限界8.画像背景。図は、（A）5％で懸濁10μL/時で流れるRBC-懸濁液の血液層の厚さの区切りを示し、（B ）10％と、（C）は、15％のH. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig8highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig9.jpg" /> Figu9再。 対応するせん断速度の関数としての平均凝集体サイズ 。結果は5％（A）、10％（B）、15％のH（C）でQ = 10μL/時で流れる異なるRBC-懸濁液のために得られる。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52719/52719fig9highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> ヘマトクリット値 </td><td> 流量（μL/時） </td><td> せん断速度（秒-1） </td></tr><tr><td> 5％ </td><td> 10 </td><td> 11.02 </td></tr><tr><td> 5％ </td><td> 5 </td><td> 5.36 </td></tr><tr><td> 10％ </td><td> 10 </td><td> 8.17 </td></tr><tr><td> 10％ </td><td> 5 </td><td> 4.47 </td></tr><tr><td> 15％ </td><td> 10 </td><td> 7.41 </td></tr><tr><td> 15％ </td><td> 5 </td><td> 2.51 </td></tr></tbody></table> 異なる血流ケース表1剪断速度値は、剪断速度の値はQ = 10マイクロリットル/ hrで流れる、5％、10％および15％のHと異なるRBC-懸濁液用μPIVデータや画像処理結果を用いて得られますおよびQ = 5μL/時。

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Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.8K ビュー.  University of Ottawa. プロトコルは、画像処理技術に基づいて、詳細に制御され、一定の剪断速度の下で赤血球（RBC）の凝集体を定量化するための実験手順を記載しています。このプロトコルの目的は、制御されたマイクロ流体環境で対応するせん断速度に赤血球凝集体のサイズを関連付けることです。 

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

生物学

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

生物工学

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

イメージングフローサイトメトリーを用いた微生物オートアグリゲーションの定量解析

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

著者スポットライト:イメージングフローサイトメトリーを使用した微生物オートアグリゲーションの研究の進展

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

要約

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血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

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微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

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