この研究は、カナダ保健省ゲノミクス研究開発イニシアティブ（GRDI）とバイオテクノロジーのためのカナダの規制戦略（CRSB）によって資金を供給されました。著者らは、利害の競合を持っていません。

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	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. 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L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. 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Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

No conflict of interest or competing financial interests declared.

8-オキソdGuoがDNA酸化の有用なバイオマーカーとして報告されているが、その信頼性の定量化は、チャレンジを提起することができます。いくつか公開された方法が存在するが、それらの研究室での方法を展開する研究者を可能にするプロトコルの包括的、説明的な概要が必要とされています。ここでは、8オキソdGuoの検出および定量化のための効果的な方法を確立するために新しいユーザーを可能にするHPLCベースのプロトコルの詳細な概要を提示します。 8-オキソdGuoの定量のために記載されている三つの主要な方法。これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、本明細書に記載されるような9の他の場所に記載し、HPLC-EDの方法、クロマトグラフィー/質量分析（MS）法（ 例えば、液体の市販キット19を 、ベース含む。ELISA法は、干渉を受ける可能性が生物学的試料19中の特定の化合物と、一般に、結果がchromatogr用いて得られましたaphic技術は、ELISAに基づく方法20と比較して、8-オキソdGuoの定量化のために、より信頼性の高いと考えられています。 MSベースの方法でHPLC-ED法を比較すると、前者の利点は、比較的安価な装置（MSベースの方法のための装置よりもコストの大きさ、すなわち 、約オーダー）です。前者は、電気活性化合物の潜在的な干渉を受けやすいものではなく、同位体21を使用して明確な定量的測定を提供するようさらに、HPLC-MSは、HPLC-ED法より優れています。 懸念は、8-オキソdGuo定量22に使用されるゲノムDNAを抽出するための従来のフェノール抽出法の使用に関して提起されています。何人かの研究者は、標準的なフェノール抽出に関連した条件はベースラインレベル1,9を増やすしたがって、不要なdGuo酸化を導入することができることに注目しました。この問題は、セルとアニマに対処するために、LゲノムDNAを抽出し、修正されたDNAzolプロトコル22を用いて精製することができます。 DNAzolは、グアニジンチオシアネートを高濃度で含まれており、以前の研究では、9は DNAzolは、従来のフェノールとのNaIベースの抽出法に比べて使用されている下位基礎レベル8-オキソdGuoの形成を指摘しています。鉄キレート化合物DFOは、試料調製中にROS産生およびDNAの酸化を最小限にするために使用されました。上述したように、非ストレスA549細胞における8-オキソdGuoレベル（ 図7A）は、MSベースの方法13により測定されたものと非常に類似していました。これは、MSに基づく方法13について記載した注意事項の取り込みはHPLC-EDによって正確8-オキソdGuoの定量化を達成するために、試料調製及び分析の間に、望ましくないDNA酸化の最小化を可能にすることを示唆しています。 8-オキソdGuoレベルを減少することによってここに見られるように酸化促進処理後の剖検または収穫培養細胞のタイミングは、もう一つの重要な要因となる可能性があり最後の処理（ 図7B）後24時間対4時間で脾臓中。これは、DNA損傷を除去するために塩基除去修復の活性化に起因し得ます。 記載された方法の2明らかな制限があります：（1）DNAのではなく、大量の要件（サンプルあたり約80μgの3つの技術の複製を達成するために）、および共溶出化合物からの（2）潜在的な干渉。これは、他の（ 例えば 、遺伝子発現）のための組織の十分な量を残して、脾臓の非常に小さい（ すなわち 、約15mg）個（全組織重量の約15％）がDNAの80μgのを取得するのに十分であることが判明しました分析します。抽出したDNAの量は、人為的なDNA酸化23,24,25に影響を与えるもう一つの重要なパラメータです。そのため、私たちはここに示唆していることがかなり大きな（〜80ミリグラム/サンプル）での作業は人為的なDNA酸化25を最小化するために&gt; 30 MGを使用して、以前の勧告と一致しています。これは2-3の実行のために十分なものでなければならないため、より小さい組織（ 例えば 、海馬）の場合、1は、20〜30μgのDNAと起動するためのプロトコルを縮小できました。 DNAのより大きな量は、おそらく背景雑音上記ピークの分解能を容易にするであろうが、これは実験的に、潜在的に干渉する物質の存在は、ケースバイケースで対処することができ、そしてそれは常にからDNA試料を含むことが必須である確認されないままでインビトロまたは酸化的DNA損傷を誘導することが知られている陽性対照とのインビボでの治療において同時（ 図7参照）。 リン酸緩衝液中のリン酸塩は、アルカリホスファターゼの活性を低下させることが報告されているが、方法の最適化実験（ 図5）は、リン酸緩衝液を容易に使用できることを確認しました。リン酸緩衝液を移動相中に含まれているので、試料調製におけるその使用は、ゾルに検出器ノイズを低減します混合ベント。したがって、電圧、緩衝液組成、DNA抽出および消化を最適化し、陽性対照を含めました。さらに、これらの変数はさらに、個々の研究室によって最適化する方法を概説が提供されます。私たちの目標は、8オキソdGuoの検出および定量化のためのアッセイの開発を目的とした専門家の研究室のために有用であり得る方法を生成することでした。 しかし、私たちは分析手順の検証のためのヒト用医薬品（ICH）の登録のための技術要件の調和に関する国際会議（ すなわち 、ICH Q2の（が推奨する検証手順の下で概説した方法の正式な検証が必要であることに注意してくださいR1）26）。簡単に言えば、定量的な検証の要素は、アッセイの検討すべきである：スパイク·イン8-オキソdGuo異なる量のサンプルを含むことによって達成することができる1）精度（; EXT両端の2）の範囲と直線性（線形応答終了した被分析物濃度; 3）精度（再現性と再現性）; 4）検出限界は、（一般に、点はれる信号対雑音比が大きいか又は2~3等しく、これは、マトリックスに依存してもよいです）。応答は、いくつかの所定のレベルのような2×コントロールの標準偏差を交わる5）定量限界（濃度は、マトリックスに依存）であってもよいです。 6）選択性/特異性（ニートのソリューションと比較し複雑なサンプル中の分析物を検出する能力）。 7）再現性（異なる事業者と異なる研究室で同じ結果を取得する機能）。および8）堅牢性とシステム適合。 ICHが推奨する、検証の目的は、それが「その意図する目的に適し」であり、多くの研究室は、おそらく、異なる目的を持っていることを実証することであるように、このアッセイの将来のユーザは、必要と認められる範囲で、これを検証する必要があります。 8-オキソdGuoの正確な定量は、毒物学と分子医学の罪で望ましいですCEは、機構的及び実験的に健康への悪影響にリンクされているか、酸化ストレス、より具体的には、DNAの酸化の理解を高めることができます。

その定常状態レベルの酸化的DNA損傷の頻度の増加に寄与し、多くの病的状態とxenotoxic代謝中に増加させることができる反応性酸素種（ROS）。いくつかの可能な核酸塩基の酸化物の中でも、酸化的DNA損傷を容易に &#39;2の酸化形態の一つである安定したマーカー8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）を用いて測定することができます-deoxyguanosine（dGuo）1。 8-オキソdGuoは最も豊富なDNA損傷2であり、したがって、複数のDNAの酸化生成物3の存在にもかかわらず、DNA酸化のバイオマーカーとして、より詳細に検討されています。ヒトでは、この損傷は8-オキソグアニングリコシラーゼ1（hOGG1）4によって塩基除去修復を経て修復することができます。未修復のままにすると、8-オキソdGuoが塩基対置換変異の形成（ すなわち 、Gは転換をTに）に貢献することができる4。重要なことは、8-オキソdGuoは、確立されたマーカーのFOです開始と発癌2の促進に関連するr個のDNA損傷。したがって、8-オキソdGuoの正確な定量は、酸化的DNA損傷5の有用なバイオマーカーであると望ましいです。 さらに広まっ2デオキシグアノシンの酸化的損傷を受けた形態のための正しい名前に関する文献における混乱と、日常的に酸化的DNA損傷6のバイオマーカーとして測定した化合物（複数可）の正しい名前があります。 8-オキソdGuo（ 図1に示す）の6,8-ジケトおよび6エノール、8-ケト互変異性型は、文献5,7で説明した2つの最も顕著な互変異性体です。 6,8-ジケトフォーム7.4の生理的pHで最も顕著な形態であり、そして最も顕著なDNAの酸化生成物7です。したがって、8-オキソdGuoはなく8-ヒドロキシdGuoこの酸化生成物6のための最も適切な名前です。むしろnucleobより、2 - デオキシグアノシン（dGuo）ことに注意することも重要ですアーゼのグアニン（グア）またはリボグアノシン（郭）が、それぞれ、最も方法6により検出されます。 DNAサンプルの消化i）においてばらつき、試料調製中に発生する可能性がある8-オキソdGuoにdGuoのii）の不定酸化、 およびiii）必要性：8-オキソdGuoの正確な検出および定量化が原因に困難です分析HPLC-ED法8の効果的な検証のため。 III）を部分的にのみを含めることによって対処している間にこのプロトコルでは、封入金属キレート剤とキレート剤処理されたソリューションと特殊なDNA単離試薬によって、我々は完全なDNA消化のための有利な条件を提供することにより、）私を達成することを目的とし、II）ポジティブコントロールは、したがって、本方法は、生物学的試料中の8-オキソdGuoを検出することができることを提供します。さらなる検証はこの論文の範囲を超えています。しかし、このプロトコルは将来のを助けると確信していますユーザーは、彼らが正式にその目的に応じて、プロトコルを検証する必要がどの程度を決定します。メソッドの仮の検証に必要な手順のリストがさらに提供されます。 8-オキソdGuo検出のための方法の開発と展開の間に、公表された方法を検討し、併合されました。したがって、この方法は、8-オキソdGuoの検出および定量のための方法がうまく採用されている場合にも、検査の迅速かつ簡単な手段を提供しながら、多くの場合、重要な実験の詳細を欠いている、いくつかの公開されたソースから情報を収集する必要がなくなります。この適応方法は、正常培養細胞およびマウス組織からDNAサンプルを分析するために使用しました。このビデオの記事は、HPLC-EDによる8-オキソdGuoを確実に検出および定量化のための効果的な方法を確立する他のグループを支援します。

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo standard</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Inappropriately referred to as &quot;8-hydroxy-2&#039;-deoxy Guanosine&quot;; see &lt;strong&gt;Fig. 1&lt;/strong&gt; and text for details.</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>From &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Chelates heavy metals</td></tr><tr><td>Desferoxamine mesylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>DNA from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Sodium salt</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypeII, from bovine pancreas</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; with NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K media</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Foetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Guard column</td><td>Chromatographic Specialties</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Phosphodiesterase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td></tr><tr><td>Teflon homogenizer</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td><td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td><td>Chromatographic Specialties</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

酸化ストレスは、DNAなどの生体高分子の酸化につながる、多くの生理学的および病理学的プロセス、ならびに生体異物代謝に関連しています。そのため、DNAの酸化の効率的な検出は、医学と毒物学などの研究分野、各種のために重要です。酸化的損傷を受けたDNAの一般的なバイオマーカーは、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuoあるしばしば誤っと称される8-ヒドロキシ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-OH-dGuoまたは8 - オキソ - dGの））。電気化学検出（HPLC-ED）と、高圧液体クロマトグラフィーにより8-オキソdGuo測定するためのいくつかのプロトコルが記載されています。しかし、これらは主に酸化促進剤で処理された精製されたDNAに適用しました。また、原因の研究室間の方法論の違いに、主に分析機器の違いによる、HPLC-EDによる8-オキソdGuoの検出のための公表された方法の採用は、各研究室によって慎重な最適化を必要とします。 Aこのような最適化処理を説明する包括的なプロトコルは、不足しています。ここでは、詳細なプロトコールは、培養細胞または動物組織からのDNAにおいて、HPLC-EDによって8-オキソdGuoの検出のために記載されています。これは、DNA試料の調製を容易かつ迅速に試料調製の間に発生することが望ましくないDNAの酸化を最小にするように最適化することができる方法を示します。このプロトコルは、酸化剤KBrO 3で処理した培養ヒト歯槽腺癌細胞（ すなわち 、A549細胞）における、および多環式芳香族炭化水素ジベンゾ（DEF、P）クリセンに曝露されたマウスの脾臓から8-オキソdGuoを検出する方法を示しています（DBC、旧ジベンゾとして知られている（L）ピレン、DalP）。全体的に、この作品は、HPLC-EDの方法論は容易に生物学的サンプル中の8-オキソdGuoの検出のために最適化することができる方法を示しています。

dGuoは8-オキソdGuoが約6.4分（ 図2AおよびB）の保持時間を有していたのに対し、4.7分の保持時間を有することが観察されました。 図2Cに見られるように、2つの分析物のピーク高さの約1000倍の差が存在します。 8-オキソdGuoとdGuoためボルタモグラムは8-オキソdGuoのための最適な作動電位が+ 0.5Vであることが決定された0.2から1.1 Vの範囲で作動電位で基準を実行することによって得られ、0.9ましたdGuoのためのV（ 図3）。これらの電位は、文献14,15に記載されている他のガラス状炭素電極と一致しています。検出および8-オキソdGuoとdGuo電気化学的検出のダイナミックレンジの限界は、それぞれ8,9、フェムトモルとナノモル範囲であることが報告されています。 dGuoと8-オキソdGuoのための標準曲線は、適切な濃度範囲にわたって線形検出を確実にするために、毎日実行し、適切な実行する必要があります楽器のンス（ 図4）。標準曲線は、1つの標準曲線から生成された方程式からのサンプル中の分析物の濃度を計算することを可能にする既知の被検体濃度（ 補足図2）の関数としてピーク面積をプロットすることによって構築されます。 完全なDNA消化は8-オキソdGua周波数の正確な測定のために必要とされる、いくつかのゲノムDNAの消化方法は8,15,16が提案されています。必要に応じて、DNA抽出および消化の有効性は、アガロースゲル電気泳動（ 図5A）を使用して確認することができ、HPLC-ED（ 図5B）。消化されたDNA断片を有するサンプルがゲルをオフに実行して、このように未検出であった。図5（a）の明らかなDNAスメアとレーン（ 例えば 、レーン2、4、6、9、11、および13）は、未消化のDNAの存在を示します。 図5Bの高原は、さらにincubatiことを示しています1.5時間を超えて、消化酵素によるDNAの上dGuoより多くの量を生じない1.5時間後にほぼ完全な消化を示唆し、検出しました。また、アガロースゲル電気泳動及びHPLC-EDの両方がここで用いられるリン酸塩ベースのDNAの消化緩衝液の有用性を試験しました。このバッファは十分にHPLC移動相に一致して、異なるソリューション（データは示していない）の混合に起因する望ましくない検出器ノイズを生じさせません。したがって、リン酸ナトリウム緩衝液に文献で ​​提案されているバッファからスイッチ（ すなわち 、トリス塩酸8）は （ 図5（a）の右側対左）、このプロトコルのために推奨されます。 DNA消化の最適化のための基礎となる仮定は、酵素阻害およびサンプル不均一性が無視でき、消化時間であったことであったことに注意してください上記のように、唯一の制限因子でした。不完全なDNA消化をDETEであるには余りにも小さい断片をもたらしている可能性アガロースゲル遺跡にCTED。このような系統誤差が等しく、すべてのサンプルに影響を与えるにもかかわらず、さらなる実験は（ 例えば 、放射性標識プロオキシダント10で培養した細胞の治療は）完全にそのような可能性を排除するために実施することができます。 標準的な解決策とは異なり、消化されたDNAは、かどうかは、単離された細胞またはマウス組織から、いくつかの追加のピーク（ 図6Aおよび6B）を生成しました。これらは、8-オキソdGuoとdGuoのピークから離れたが、議論に概説検証演習の一環として実験をスパイクは、追加のピークは（ すなわち 、原因マトリックス効果へのサンプル不純物、例えば）の定量化を妨害するかどうかを調べるために必要とされます。 8-オキソdGuoピークは、標準での保持時間の一致によって確認しました。しかも、酸化促進剤治療を受けた細胞または動物からのサンプル（ 図7 8オキソdGuoピークの増加）。プロオキシダントKBrO 8-オキソdGuoの形成17につながるグアニンから一電子引き抜きで3参加しています。これは、プロオキシダントストレスの非存在下において、10 7 dGuoあたり8-オキソdGuoの2.4分子がA549細胞（ 図7A）で検出されたことは注目に値します。これは、代替、HPLC-ED法9の電位の欠点に対処するために設計された質量分析に基づくアプローチを用いて観察されたA549細胞において検出8-オキソdGuo / 10 7 dGuoの4.5分子に匹敵します。 DBC処理（ すなわち 、毎日20.0 mgのDBCは/ kg体重1日に3日間）は、マウスの脾臓DNA中の8-オキソdGuoのレベルを増加させました。 ROSは、 インビボ 8 中の多環芳香族炭化水素類の代謝中に生成されることが知られているので、これは、また、予想される結果です。ストレスを受けていない動物の脾臓中の8-オキソdGuoの相対レベルは、優れたagreemenである8.3から9.4 8-オキソdGuo / 10 6 dGuo（ 図7B）でしたHPLC-ED 18で標準的な条件下でのマウスの脾臓細胞で測定4 8-オキソdGの分子/ 10 6 dGuoの公表値とtが。ベースラインより上8-オキソdGuoのレベルが非常に小さいことを6,7示します。 DNAはここで観察されるよりも低いレベルに酸化されている場合はこのようにして、8-オキソdGuoのレベルは将来のプロトコルのユーザーが心に留めておくべきであるベースライン、区別できない場合があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig1.jpg" /> 図1. 8オキソdGuoの構造とその互変異性体8-OH-dGuoは8オキソdGuoよりもむしろ8-OH-dGuoはpH7.4の主な互変異性体であることに注意してください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig2.jpg" /> dGuo（A）および8-オキソdGuo（B）。HPLC-EDについては、図2保持時間<html>クロマトグラムは、いずれかのdGuoの10.0μlの注入から得られた（1.0ナノモル合計）または8-オキソdGuo（千fmolの合計）と0.9 V（A）または0.5 V（B）で検出しました。 dGuoの保持ピークは約4.7分（A）であり、8-オキソdGuoのに約6.4分（B）としたこと。 2-3分の幅広いピークは、おそらく、注射の乱れに起因すると8 -オキソdGuoの濃度によって、（同様の強度で、すなわち 、常に存在）に影響されないされている。（C）スーパーインポーズクロマトグラムを二つの別々の（A）に記載の注射からUV（260ナノメートル）によって検出（B）。規格が同一の実行条件を使用して、同じ日に実行した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52697/52697fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> ES / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg &quot;/&gt; 図3.最適化の検出器電圧。dGuoの（A）ボルタモグラム0.7から1.1 V.（B）8-オキソdGuoのボルタモグラムの範囲でHPLC-ED分析によって検出された（最終濃度1ナノモル）（最終濃度500 fmolの） 3つの独立した実験の0.3〜0.7 V.手段の範囲でHPLC-ED分析によって検出（N = 3）±標準偏差示します。いくつかのケースではエラーバーは、プロット記号よりも小さいです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig4.jpg" /> dGuo（A）および8-オキソdGuo（B）図4.標準曲線。dGuoまたは8-オキソdGuoのいずれかの10マイクロリットルを0.9 V（A）または0.6 Vで注入し、HPLC-EDで測定した（B ）。三つの独立した実験の平均（N = 3）に示す標準偏差は±。いくつかのケースではエラーバーはSMでありますプロットシンボル以外Allerの。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig5.jpg" /> DNA消化の5最適化を図。トリス-HCl 8に記載のように（A）サケ精巣DNAの80マイクログラムを消化し ​​、グリシン-酢酸緩衝液（左）またはリン酸ナトリウム緩衝液（右）。アガロースゲル電気泳動（1.0％）は、45分間、150 Vで運転しました。レーン1および8：DNAラダー;レーン2,4、及び6：未消化DNA。レーン3,5、および7：消化DNA;レーン9、11、及び13：未消化DNA（リン酸緩衝液）レーン10、12、及び14：DNA（リン酸緩衝液）を消化し ​​た（B）サケ精巣DNA（80μgの）は50で、各ステップ毎に0.5〜2.5時間、DNアーゼI、PDE I、及びAPと共にインキュベートすることにより本明細書に消化し ​​ました。塩化マグネシウムおよびDFOを含むmMのリン酸緩衝液。消化されたDNAの7.3μgのを含む各サンプルの50マイクロリットルを、HPLC（ すなわち 、0.9 V、および1ml /分で分析したFLOw）はdGuoを検出します。図は、3つの独立した実験の平均を示している（N = 3）平均の標準誤差を±。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52697/52697fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6A" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig6A.jpg" /> <img alt="図6B" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig6B.jpg" /> 培養細胞（A）中の8-オキソdGuo検出または動物組織（B）は図6クロマトグラム（A）消化DNA A549細胞から、KBrO 3で処理したまたは未処理の（B）消化DNA DBCの脾臓から処置されたマウス。ピークが原因でガードカラムを除去することを左にシフトし（これは装置内の圧力上昇に、それらの位置を基準に確認しました）。標準とサンプルは、同一の実行条件を使用して、同じ日に実行されました1ml /分の流量及び0.5それぞれdGuoと8-オキソdGuo、0.9 Vでの、10mlの注射体積、。クリックしてください<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52697/52697fig6Ahighres.jpg" target="_blank">ここで</a> 、パネルAの拡大版のため、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52697/52697fig6Bhighres.jpg" target="_blank">ここでは</a>パネルBのために。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig7.jpg" /> 生体試料中の図8オキソdGuoの7定量を。ピークは（KBrO 3で処理し、A549細胞からDNAにおける8-オキソdGuoレベルを生成する（詳細については、 補足図2を参照）標準曲線に統合し、比較しましたA）、DBC処置マウス（B）の脾臓からのDNA又は8-オキソdGuoレベル。星印（*）は、統計的有意性を示す（P &lt;0.05分散の一方向分析（ANOVA）（A）、スチューデントのt検定（B））。 3（A）または5（B）の平均値±標準誤差の独立した実験の平均を示します。サンプルは、3日間の治療後4または24時間に採取しました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>移動相</td><td> 50.0 mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.2、6％MeOHおよび2.0 mMのKClを含みます</td></tr><tr><td>移動相の流速</td><td> 1.0mL /分</td></tr><tr><td>列タイプ</td><td>結合した球状シリカとYMC-BASIC </td></tr><tr><td>カラム長さ</td><td> 15センチメートル</td></tr><tr><td>カラム内径</td><td> 3.5ミリメートル</td></tr><tr><td>カラム温度</td><td> 35°C </td></tr><tr><td>検出器温度</td><td> 29°C </td></tr><tr><td> 8-オキソdGuo用電圧設定</td><td> +0.5 V </td></tr><tr><td> dGuoのための電圧設定</td><td> 0.9 V </td></tr><tr><td>注入量</td><td> 10.0ミリリットル</td></tr></tbody></table> HPLC-EDによる検出および8-オキソdGuoの定量化のための表1の機器パラメータ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>ナノモル</td><td> 100 nmの標準、μL </td><td> HPLC移動相、μL </td><td>希釈、折り</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 300 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 240 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 30 </td><td> 270 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.25 </td><td> 15 </td><td> 285 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 0.1 </td><td> 6 </td><td> 294 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> 表2. &lt;dGuoの標準曲線の / strong&gt;の準備。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>フェムトモル</td><td> 250 nmの標準、μL </td><td> HPLC移動相、μL </td><td>希釈、折り</td></tr><tr><td> 2,500 </td><td> 300 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>千</td><td> 120 </td><td> 180 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 120 </td><td> 180 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> 表8-オキソdGuoの標準曲線の調製。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig8.jpg" /> 燮<html> 電気化学の plementary図1 の比較（EC）とdGuoのUVベースの検出。標準曲線は、電気化学的検出（EC）またはUV検出（260 nm）のことでdGuo検出のために作成されました。ピーク面積は、両方の方法で約4.7分でdGuoピークのために統合されました。 N = 3は、±標準偏差を示していることを意味します。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig9.jpg" /> その標準曲線から補足図dGuoの2定量。dGuoの濃度を決定するための標準曲線の使用例が示されている。（A）のピーク面積は、標準的なソフトウェアを用いて積分することによって決定することができる。（B）この情報は、使用されています試料中の未知の検体濃度を計算するために直線の方程式を使用するために、標準曲線を構築します。52697 / 52697fig9large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

このプロトコルの目的は、培養細胞または動物組織からのDNAにおけるHPLC-EDによるDNA酸化のマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）の検出です。

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシンのHPLC測定、

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

26.2K ビュー.  Health Canada. このプロトコルの目的は、培養細胞または動物組織からのDNAにおけるHPLC-EDによるDNA酸化のマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）の検出です。 

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

化学

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared spectroscopy is used to predict nondestructively total sugar, total organic acid, and total anthocyanin content in each blueberry. The technique is expected to enable the selection of only delicious blueberries from all harvested ones. The near-infrared absorption spectra of blueberries are measured with the diffuse reflectance mode at the positions not on the calyx. The ingredient contents of a blueberry determined by high-performance liquid chromatography are used to construct models to predict the ingredient contents from observed spectra. Partial least squares regression is used for the construction of the models. It is necessary to properly select the pretreatments for the observed spectra and the wavelength regions of the spectra used for analyses. Validations are necessary for the constructed models to confirm that the ingredient contents are predicted with practical accuracies. Here we present a protocol to construct and validate the models for nondestructive prediction of ingredient contents in blueberries by near-infrared spectroscopy.

We present here a protocol to construct and validate models for nondestructive prediction of total sugar, total organic acid, and total anthocyanin content in individual blueberries by near-infrared spectroscopy.

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and validated for the quantification of extracellular purine nucleotides and nucleosides produced by purified chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells under different culture conditions. The chromatographic separation of adenosine 5&#39;-monophosphate (AMP), adenosine (ADO) and inosine (INO) is performed at RT on a silica-based, reversed-phase column that is used for polar compound retention. The method includes a binary mobile phase, which consists of 7 mM ammonium acetate and acetonitrile with a flow rate of 1.00 ml/min. The eluates are monitored using a Photodiode Array UV detector set at 260 nm. A standard calibration curve is generated to calculate the equation for the analytical quantification of each purine compound. System control, data acquisition and analysis are then performed. Applying this protocol, AMP, INO and ADO elute at 7, 11 and 11.9 min, respectively, and the total run time for each sample is 20 min. This protocol may be applied to different cell types and cell lines (both suspension and adherent), using culture media as matrix. The advantages are easy and fast sample preparation and the requirement of a small amount of supernatant for analysis. Furthermore, the use of a serum-free medium allows skipping the protein precipitation step with acetonitrile that impacts the final concentration of purine compounds. One of the limitations of the method is the requirement of the equilibration column run before each single sample run, making the total run time of the experiment longer and preventing high throughput screening applications.

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, the focus is on metallic substrates immersed in acidic solutions containing organic corrosion inhibitors, as these systems can be particularly sensitive to oxidation following removal from solution. To minimize the likelihood of such degradation, samples are removed from solution within a glove box purged with inert gas, either N2 or Ar. The glove box is directly attached to the load-lock of the ultra-high vacuum X-ray photoelectron spectroscopy instrument, avoiding any exposure to the ambient laboratory atmosphere, and thus reducing the possibility of post immersion substrate oxidation. On this basis, one can be more certain that the X-ray photoelectron spectroscopy features observed are likely to be representative of the in situ submerged scenario, e.g. the oxidation state of the metal is not modified.

A protocol to avoid the oxidation of metallic substrates during sample transfer from an inhibited acidic solution to an X-ray photoelectron spectrometer is presented.

XPSで腐食防止剤/金属界面の化学組成を決定する：最小化後のイマージョン酸化

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

MCF-7細胞におけるDNA酸化的損傷の程度の決定

Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly impacts gene expression and serves as a pivotal factor in stimulating neurodegenerative disorders, cancer, and aging. Therefore, precise quantification of 8-oxoG has clinical significance in the investigation of DNA damage detection methodologies. However, at present, the existing approaches for 8-oxoG detection pose challenges in terms of convenience, expediency, affordability, and heightened sensitivity. We employed the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, a highly efficient and swift colorimetric method, to detect variations in 8-oxo-dG content in MCF-7 cell samples stimulated with different concentrations of hydrogen peroxide (H2O2). We determined the concentration of H2O2 that induced oxidative damage in MCF-7 cells by detecting its IC50 value in MCF-7 cells. Subsequently, we treated MCF-7 cells with 0, 0.25, and 0.75 mM H2O2 for 12 h and extracted 8-oxo-dG from the cells. Finally, the samples were subjected to ELISA. Following a series of steps, including plate spreading, washing, incubation, color development, termination of the reaction, and data collection, we successfully detected changes in the 8-oxo-dG content in MCF-7 cells induced by H2O2. Through such endeavors, we aim to establish a method to evaluate the degree of DNA oxidative damage within cell samples and, in doing so, advance the development of more expedient and convenient approaches for DNA damage detection. This endeavor is poised to make a meaningful contribution to the exploration of associative analyses between DNA oxidative damage and various domains, including clinical research on diseases and the detection of toxic substances.

著者スポットライト:ELISAを用いたMCF-7細胞における8-oxo-dGの定量的評価

This protocol describes an efficient method for quantitatively detecting DNA oxidative damage in MCF-7 cells by ELISA technology.

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly ...

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシンのHPLC測定、

要約

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ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成

XPSで腐食防止剤/金属界面の化学組成を決定する：最小化後のイマージョン酸化

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価