This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).

1.脂質の準備<ol><li>透明なガラス管に所望量の脂質を分注し。 E.を使用してください大腸菌極性脂質抽出物が、ほとんどの脂質組成物を用いることができる。脂質は粉末形態である場合は、20 mg / mlの濃度のクロロホルムで再懸濁。すべての溶媒が蒸発するまでN 2ガ ​​ス下、RTで脂質を乾燥させる。 </li><li>ペンタン中の脂質を再懸濁し、クロロホルムの残り痕跡を除去するために再びガスN 2の安定した流れを、それを乾燥させてください。乾燥した全ての溶媒が蒸発するまで。乾燥しながら脂質をチューブの底に三分の一をカバーする均一な膜に分布してではなく、一番下に密な塊を形成されるように、静かにチューブを回転させる。 </li><li>脂質を溶解する界面活性剤（300mMの塩化カリウム、50mMのクエン酸、25mMのK 2 HPO 4、pH4.5で、35mMのCHAPS）を含有する再構成バッファを追加する。タンパク質がCHAPSにはあまり寛容である場合は、このステップのために他の中性洗剤を使用してください。 </li><li> Resuspen水浴超音波処理を使用して明瞭に脂質をdは。短い（30秒-1分）一時停止（30秒-1分）短いパルスの最大電力で水超音波処理槽の中心にチューブを浸し。溶液は透明になるはず。 注：達成明確化の最終的な程度は、使用される特定の脂質組成に依存します。この段階で、いくつかのバッチ間の変動があっても、名目上同一の脂質の中でも可能である。残留ヘイズは遠心分離により除去することができる懸濁液中の大きな粒子による光の散乱によるものである。 </li><li> 20〜60分間、室温で再懸濁脂質をインキュベートする。 </li></ol> 2.プロテオリポソー​​ムの形成注：いくつかの戦略は、リポソーム内に界面活性剤で可溶化タンパク質を挿入するために使用することができる。 CLC-EC1のために透析がうまく機能し、そのために選択6,9,10の方法です。 <ol><li> μgのOで表され、所望のタンパク質対脂質（P / L）比（に精製タンパク質を追加します。<html> Fタンパク質/ mg脂質）。 P / L比の選択は、実験の目的に依存する。 <ol><li>目標は、関心対象のタンパク質の活性を評価することである場合には、各リポソームは、タンパク質の複数のコピーが含まれるように、信号を最大化するために高いP / L&#39;sで再構成する。各小胞は、平均1タンパク質に含まれるように、活性および/またはタンパク質の単一の輸送速度を定量化するために、低いP / L&#39;sのポアソン希釈領域で再構成する。各政権をどのような場合に使用するのより深い分析のための手順7と議論を参照してください。 </li></ol></li><li>様々なレジメンのための最適なP / L値を決定するには、タンパク質濃度8,11-13の関数として活性の完全な滴定を行う。しかし、活性単位の分子量（MWは、kDaので表す）する任意のタンパク質について、以下のP / Lの値が初期guesstimatesとして使用することができる知られている。 pgの &quot;/&gt; <img alt="式2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li>予め湿らせた透析チューブまたはカセットにタンパク質と脂質混合物をロードします。 500-1,000x脂質再構成バッファのボリュームを含むビーカーに透析装置を配置（ すなわち 、脂質の再懸濁の1ミリリットルのため1 Lバッファ）穏やかに撹拌しながら。 <ol><li> &gt; 3時間間隔で変更バッファ3〜4回。すべてのソリューションの変更では、蒸留水でカセット/チューブ、ビーカーを洗浄し、新鮮な再構成緩衝液でビーカーを埋める。溶液交換のための1-2のO / N間隔を含めます。ソリューションの変更の正確な数と期間は、使用される正確な脂質や洗剤に依存します。 </li></ol></li><li>最後のステップが完了した後、-80℃で液体N 2又は凍結で、透析容器からリポソームを除去するチューブでそれらをアリコートし、フラッシュ、それらを凍結する。 </li></ol> 3.録音セットアップ &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;注： - （下記参照）電極、アナログとpH計記録のセットアップ（ 図2A）は、二つのチャンバー（平底シリンダー、〜3,4容）、Clから構成されていまたはデジタル電気出力、デジタイザ、および適切な取得ソフトウェアを備えたコンピュータ。 <ol><li> pH計の電極、コンピュータに接続されているデジタイザにpH計の出力-はClを接続します。 1チャンバー内の参照電極と他の（ 図2B）で再コーディングワイヤーを配置します。 注：ΔV カルが正である（ステップ6.4および7.2参照）がワイヤの極性が正しい。 </li><li>記録チャンバー（ 図1B）で撹拌棒で撹拌プレート上室を置きます。撹拌棒が電極に接触していないことを確認してください。 </li><li>寒天橋（ 図2B）（100 mMのKClおよび2％アガロース）を使用してチャンバーを接続します。 100のKClに寒天ブリッジを保管してください。 </LI&gt; </ol>のCl 4.準備-電極<ol><li>古いものと-possibly-非機能pH電極を取る。完全に銀線を明らかにするためにガラスコーティングを破る。 </li><li>慎重に手術用メスの刃を使用して銀ワイヤからコーティングを除去。 H 2 OおよびEtOH大量のを使用して、ワイヤを清掃してください。 </li><li>ワイヤまでのFeCl 3（または漂白剤）の飽和溶液の代わりに塩化銀の均一な暗い被膜で覆われている。 </li></ol>単ラメラ小胞の5準備<ol><li>実験前の夜は、のために（攪拌しないでください）穏やかに振盪しながら外部バッファ（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5）中の15ミリリットルでセファデックスG-50ビーズの1グラムを膨潤使用前に室温で少なくとも3時間。各実験は、膨潤したビーズの〜3ミリリットルが必要です。せいぜい数日、4℃で膨張したビーズにしてください。 </li><li>リポソームは、室温で解凍している間、各列〜3メートルに注ぐ膨潤したG-50ビーズリットル。 RTで重力流によってそれらが乾燥してみましょう。これは通常、1〜2分かかります。 </li><li> 0.4メートルテフロンカットオフを使用したミニ押出機を通してテオを11回押し出して単ラメラ小胞を準備します。 </li><li>プラスチック製の丸底チューブ内の列を配置します。過剰な溶液を除去するためのカラムをスピン。臨床遠心機で1400×gで20〜30秒間遠心する。 </li><li>フロースルーを捨て、13×100mmのガラス管内の場所の列と列に押し出された小胞の100μlを添加する。臨床遠心機で500×gで1分間コラムスピン。 </li><li>ステップ6.5で記録チャンバーに追加され、フロースルーの〜200μlのを収集します。 </li></ol> 6.流出測定<ol><li>記録チャンバーに置き参照2mlの100mMのKClを（接地）チャンバと外部バッファ1.8mlの（1のKCl、150mMのK 2 SO 4、25mMのクエン酸、pH4.5中）。内部の間のわずかな浸透圧の不均衡と外部のソリューションは影響しません</li><li>取得プログラムを起動します。これは数分かかることがあり、ベースラインが平衡化しましょう​​。 </li><li>信号が安定したベースラインを（リポソームは準備ができていると列を乾燥）に達すると、（ 図3A）の記録を開始。 </li><li>システム（ 図2A）を校正するために10 mMのKCl溶液の15μlのを追加します。 </li><li>リポソームを追加します。プロテオリポソーム（ 図3A）から-小さなジャンプは、外部のClの除去が不完全に見えるかもしれません。ベースラインが安定するまで待ちます。 </li><li>流出（ 図3A）を開始するためにバリノマイシン（EtOH中で1mg / mlで1μl）を追加します。 </li><li>流出がそれプラトー（ 図3A）までの時間経過を実行してみましょう。 </li><li>すべてのリポソーム（ 図3A）を溶解するために、外部緩衝液中で調製1.5 Mβオクチルグルコシド（β-OG）の40μlを添加する。録音を終了します。 </li></ol> 7.データAnalysis <ol><li> ASCIIまたはテキスト形式でのトレースファイルをエクスポートし、選択した解析プログラムにインポート。 </li><li>以下の点（ 図3A）の電圧を測定します。 記録の開始時（V 0）。 較正パルス（V 校正 ）を添加した後、 リポソーム（V リポ ）を添加した後、 流出（V フィン ）の終わりに、 洗剤（V totは ）を添加した後、 ベースラインV 0 = 0となるよう電圧。 </li><li>の実験値を決定するために、ネルンスト - プランク方程式を使用して、 <img alt="式3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" />測定することにより、 <img alt="式4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> 巻カルは、実験開始時の室容積はでμL、1800での校正パルスのボリューム表現されている場合1; L、[Clで] CAL /中 Clである-校正パルスのとMMとΔVCALで外部バッファの濃度は、校正パルス後に測定mV単位のジャンプです。 注：αのこの経験的な決定は、3の目的があります。それは、システムが適切に応答していることを保証し、実験間の機器の応答の一貫性の尺度を提供していますだけでなく、間違いが解製作に行われなかったことを確認する。 </li><li>次のように各ステップの後のCl濃度を計算します。 <img alt="式5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="式6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="式7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> 要因400分の3は、2000μlの最終容量に15μlの校正パルスの希釈から来ている。 </li><li>計算学会各ステップで[CL &#39;の変化、ΔCL リポ/フィン/ TOTを食べました。 </li><li>とはCl（t）がV（t）を変換する <img alt="式8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> 直接の重要なポイントで &#39;CL値を決定し、内部統制などの計算値と比較します。 </li><li>トレースを正規のCl 相対 リポ = 0とCl REL TOT = 1となるよう <img alt="式9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li>次式に流出時間経過をフィット： <img alt="式10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> 実験的にはClを測定することによって決定される漏れ- - Lは、Clの割合である場合、同じ条件及びτで製造したタンパク質を含まないリポソームからの流出は、プロセスの時定数である。 </li><li> V、初期速度を計算します。 ここΔCL フィンはミリモルで発現され、Vはμlのチャンバの容積である。 </li><li>輸送速度/コンダクタンスを計算します <img alt="式12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> pがP / Lであり、MWは、活性複合体の分子量は、kDaの中で発現され</li></ol>

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G., del M&#225;rmol, ., J, R., MacKinnon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK,+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K++Ion+Channel.">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li><li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+slow+CLC+Cl-/H++antiporter+from+a+cyanobacterium.">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

精製された陰イオン選択的チャネルまたはリポソーム中に再構成トランスポーターによって媒介輸送-私たちは、詳細はClを測定するためのプロトコルを記載している。交換CLC-EC1 -使用例は、原核生物のH + / CLだった。検討中のイオンに適したものでAgCl電極ただし、方法論は、容易にリガンド12,13,15、電圧11,12、またはAgを交換することによって、異なるアニオン選択15,16をスポーツによってゲートチャンネルを研究するために適合させることができる。のCl以外のイオンのための選択性電極- 、などのH +としては、I -及びF - 、市販されている。 重要なステップとの仮定のいくつかの議論が続く。 ポアソン希釈仮定の限界ユニタリ率（式7-9）の導出は唯一のポアソン希釈政権、ほとんどのリポソームの続きに有効ですアインつのみ活性タンパク質所与の小胞に複数コピーを有する確率が低く、小胞の集団の巨視的流出時定数が十分に単一のタンパク質を含むリポソームのことによって近似されるようになっている。実際、Cl -の比較-低い（黒、0.2μgの/ MG）でのCLC-EC1で再構成したリポソームにより媒介流出の時間経過と高P / L（グレー、5μgの/ MG）（ 図3C）であることを示している後者の場合は、流出速度は、総リポソームの小さい画分が0のタンパク質が含まれていることを示す、より速く、F 0が減少になる。 Cl -の合計量-両方ベシクル試料中に含まれる2つの試料中の小胞の全内部容積は同様であったこと、および再構成タンパク質の量の大きさに影響を与えないことを示し、それぞれ〜0.7〜0.55マイクロモル、同等であった小胞。 7を方程式に高いP / Lの流出時間経過をフィッティングすると、τの値を生成する<html> （5μgの/ MG）= 8.8秒であり、f 0（5μgの/ MG）= 0.06、小胞の唯一の〜6％は、〜31％時のP / L見つかったとは対照的にアクティブなCLC-EC1ダイマーが含まれていないことを示す= 0.2μgの/ mgで。秒-1、低P / Lと公表されたデータ8,14の時に得られたものよりもほぼ6倍低い-これにより、高P / Lにおける単一の離職率の推定値は、γ〜450 Clである。そのため、高P / L&#39;sで再構成したリポソームからの流出時間のコースの分析は、再構成タンパク質の単一の輸送速度を過小評価します。したがって、正確に正確に再構成されたタンパク質の量を決定することが極めて重要である新規タンパク質の単一の輸送速度を決定し、ポアソン希釈領域で、低いP / L&#39;sで動作する。これは、理想的に動作するように最適なレジームを識別するために、完全なタンパク質の滴定分析を決定することによって達成される。 活性複合体の質量の決定10トン&quot;&gt;分析は、上述の活性複合体の化学量論が知られており、再構成タンパク質が完全にアクティブであることを前提としているが、新たな調製物について、これらの量は、 先験的に知られていない可能性があり、この場合には、これらのパラメータを直接決定することが可能である脂質比に異なるタンパク質でF 0年代を測定することにより、 <img alt="式13" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq13.jpg" /> pは、タンパク質濃度であり、 <img alt="式14" fo:content-width=".65in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq14.jpg" /> 、ρは、脂質の質量あたりのリポソームの数であり、N Aはアボガドロ数は、M Pは、機能チャネル複合体の質量であり、φは、活性タンパク質の画分である。脂質比にさまざまなタンパク質で0年代のF実験的に決定をフィッティングすることにより、POSですP 0を決定するsibleので、M、P、φ。 リポソームの有限の割合は、定款に難治性である単一の輸送速度の導出は高いPで/ L&#39;sのすべてのリポソームは少なくとも一つの活性輸送タンパク質を含むことになることを想定しています。しかし、場合によってはこれはそうでないことが見出されている：高いPで/リポソームのLのかなりの部分は、いくつかのタンパク質11-13,17の再構成に対して難治性のままである。この現象の起源は不明であるが、それは、大きなタンパク質は、このように利用可能なリポソームの数を減らす小さな半径を有する小胞から除外されることが考えられる。 この場合、式10は、に変更される必要がある。 <img alt="式15" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq15.jpg" /> θはproteiへのリポソームの耐火物の割合ですn個の取り込み。異なる手順は、リポソーム再構成と形成の間脂質とタンパク質のための別の回収を持つことになりますので、重要なことは、ρ、φはまた再構成法の影響を受けている。両方のために収率100％と仮定すると、γの誤​​推定をもたらす。したがって、単一のターンオーバー/コンダクタンスの正確な定量を得るためには、実験的に再構成8,11の間に失われ、脂質とタンパク質の割合を決定することが重要である。 再構成されたタンパク質のオリエンテーション分析の実行中に行われる前提条件の一つは、すべて再構成されたタンパク質が機能的に同等であるということである。しかし、多くのチャネルやトランスポーターは、整流として知られる現象を輸送方向を推奨している。この機能的非対称性は離職率の推定誤差につながるかもしれない。さらに、再構成されたタンパク質の配向は、 先験的 </eM&gt;ランダム、前方または後方に動作するときに測定された単一の離職率は、タンパク質の金利の加重平均になるように。いくつかの方法がリポソーム外溶液からまたは可溶性アクセス可能な領域に導入し、単一のシステイン残基の反応性の偏りを測定することによって切断可能なタグの割合を測定することによって、再構成されたタンパク質の配向を決定するために使用することができ。最後に、それだけで、または+ Kを使用して適切な値に貫通電圧を設定することにより、左右に機能的に両面阻害剤を用いて、2つの集団のいずれかをサイレンシングするか、選択的に活性化化合物の添加によって一方向のみのタンパク質を活性化することによって、この問題を回避することが可能であるリガンドまたは電位依存性であるチャネルやトランスポーターのための勾配、。 タイトなリポソームの形成に関する考察ユースOの有効化重要な要因の一つここで説明流出アッセイfのタイトリポソームの形成である。この目的のために考慮されるべき3つの重要な変数は、タンパク質、界面活性剤除去戦略及びリポソームの脂質組成物の選択を可溶化するために使用される界面活性剤の選択である。ここに提示されたプロトコルでは、CLC-EC1は、デシルマルトピラノシド（DM）、したがって、容易に除去される高い臨界ミセル濃度（CMC）値を有する界面活性剤で可溶化される。しかし、合成および天然に存在する界面活性剤の様々なその後の小胞の気密性に全く影響をタイトリポソーム中に再構成したタンパク質を精製するために使用されている。これらの洗剤はミリモル濃度と高いCMCは、広範囲を有し、かつ（例えばドデシルマルトピラノシド（DDM）又はdioctylpropaneビスマルトピラノシド（DMNG）など）、マイクロモル程度の低い（例えば、DMまたはジギトニンなど）。これは、リポソームを形成するために使用される脂質はCHAPSを用いて可溶化されることが注意することが重要である、または他の中性洗剤、したがって、タンパク質および脂質の混合物から得られるハイブリッドミセルは、親洗剤とは異なる物理化学的特性を有するかもしれない。これは、より顕著なリークにつながるリポソームを不安定化する可能性がある場合には残留洗剤を除去ことが可能である。この問題を回避するためには、そのようなバイオビーズ12,13、スピンカラム15またはゲルろ過18などの代替界面活性剤除去戦略を、調査することをお勧めします。最後に、小胞の脂質組成物は、特定の混合物は、特定の条件の異なるイオン漏出かもしれないように、重要なパラメータである。例えば、リポソームはE.から形成される大腸菌極性脂質抽出物はCLにタイト-酸性pHであるが、pHが3から形成された19またはリポソームが増加するにつれて次第に漏出になる：1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジル-エタノールの1：1混合物を（POPE）および1-パルミトイル2-オレオイルホスファチジルグリセロール（POPG）E.から形成されるものよりも、H +に非常に低い透過性を表示する大腸菌極性脂質抽出物20。それは、小胞の脂質組成はまた、再構成タンパク質13,21,22の活性に影響を与える可能性があることが注意することが重要である。したがって、正確に各条件で調製されたタンパク質を含まない小胞の特性を決定し、これは再構成されたタンパク質の特性にどのように影響するかを評価することが重要である。 非CLC型チャネルおよびトランスポーターへの一般流出アッセイ、ここで説明したように、直接のCl単一分子特性を決定するために利用することができ-選択性チャネルまたは輸送体を、例えばCa 2+の性質を特徴付けるために使用されているのCl -活性化-チャネルTMEM16A 12 。私たちは現在、トランスポーターの性質を調査するために流出アッセイを適合させる方法を議論したりchannClではありませんELS -選択的および/ ​​または〜10 3イオン秒-1 CLC-EC1の大きく異なる単一の輸送速度を持っている。 最も単純なケースは、研究対象のタンパク質がアニオン選択性であることである。この場合、唯一の必要な調整は、Ag交換することです。 - -選択FlucsとCLCを16,23,24またはI - Fのために行ったように、適切な選択性の市販のものとAgCl電極をそのようなCFTR 15などの透過性のチャンネル。一方、再構成されたタンパク質は、陽イオンに対して選択的である場合、バリノマイシン以外のイオノフォアは流出を開始するために使用されなければならない。検証済みのClの希少性を考える-便利な代替は、カルボニルシアニド4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）として、H +イオノフォアであるイオノフォア。この場合、バッファを増加させることによって小胞内のpHは、例えば、一定に維持されることを保証することが重要である内部溶液の容量はる。代替戦略は、対イオンとしてプロトンを用い、pH計25またはレシオメトリックpH感受性プローブ26を用いてH +輸送を監視することによって再構成されたチャネルまたは輸送体を介してカチオン流出に従うことである。しかし、これらの測定値を間接的に性質が困難な再構成タンパク質の輸送特性の定量化をレンダリングする。最後に、陽イオンの数の選択性電極が存在し、市販されている。共輸送体-第三のシナリオは、研究対象のタンパク質が、例えば不十分な選択性チャネル13または陽/ CL、陰イオンと陽イオンの両方に対して透過性であるということです。彼らは塩分を失うように、この場合には、再構成されたリポソームは、（5.4から5.5ステップ）溶液交換プロセス中のKCl勾配を維持していない。したがって、この場合、すべての運動情報が失われる。しかし、リポソームの画分は、少なくとも一つの活性のprotを含むコンテンツ（ステップ6.8） -アイン、f 0は 、まだClで捕捉された残余の界面活性剤を添加して測定することにより求めることができる。これは、タンパク質の滴定を実施し、式10を用いて、タンパク質の分子量の決定を可能にする。 考慮すべき別の態様は、再構成タンパク質の単一の輸送速度は、CLC-EC1とは異なる大きさのオーダーであることが可能である。ほとんどのチャンネルが10 6〜10 7秒-1、3-4,000倍速くCLCよりもイオンを伝導しながら、例えば、ほとんどの輸送体は、1-10秒の離職率-1、CLC-EC1よりも2〜3桁低いを持っている-ec1。遅いトランスポーターのClのレート-タンパク質を含まないリポソームから漏れ、タンパク質の輸送速度が低下するなどの流出過程が増加中での相対的な重みとして、制限になることができます。我々の経験では、漏れ率は準備の間で多少異なり、の順で通常少数のイオン秒-1。ゆっくりトランスポーターを扱う場合そのため、正確に小胞の各バッチに対応漏れを測定するために、それぞれの再構成に並んでタンパク質を含まないリポソーム側を準備することをお勧めします。流出アッセイは、正常に代謝回転速度の周り1-10イオン秒-1、そのようなシアノバクテリアCLC 27などの低速輸送体の単一の速度を決定するために使用されてきた。再構成されたタンパク質は、例えば、イオンチャネルのために、高い導電性を有する場合に逆の状況が発生する。この場合、排出速度、混合時間（〜1-2秒）の律速になって記録電極の固有の応答時間として解決されるにはあまりにも高速である。この場合には、運動情報が失われているが、活性複合体の質量は依然として24を決定することができる。このような平面脂質二重層の記録またはパッチクランプリポソームなどの他のアプローチは、これらのテとして精製イオンチャネルを研究するのがより適切であることは注目に値することである直接高時間分解能で単一分子の情報を提供chniques。

最後の二つの過剰発現および膜輸送タンパク質を精製する能力が劇的に増加している数十年：イオンチャネル、プライマリとセカンダリのトランスポーターは、現在日常的に異種発現系、ならびに天然の供給源から精製される。これらのタンパク質の安定性を、発現をモニタリング改善し、抽出を容易にし、強化するための新しいアプローチが常に1-5開発されている。これらの技術革新は、順番に、その機能の構造的な拠点の我々の理解を高め、膜タンパク質上の原子レベルの構造情報の爆発をトリガーに尽力している。対照的に、我々の能力は、いくつかの場合において、高分解能の構造情報をこのように定量的構造に基づいた予測をテストする我々の能力を制限する、定性機能的データが付随するように、同じ割合で増加しなかった精製されたタンパク質の機能的特性をプローブする。したがって、developmen定量的および一般化機能アッセイのtは膜タンパク質機能のメカニズムの基盤の解明に向けた重要なステップである。 チャネルおよびトランスポーター-ここでは、定量的に精製され、再構成されたCl -の主要な機能的特性を決定するために用いることができる流出アッセイを記載する。アッセイの基礎となる原理は、輸送システムの様々な、ならびに非イオン輸送タンパク質に一般化することができる。チャネル/大型のClの存在下でのトランス- -リポソームは、精製されたClで再構成する勾配（ 図1A、B）。のCl -の流出は、我々の場合K +イオノフォアバリノマイシンに、対イオン流束を可能にするために、イオノフォアを添加することによって開始のClによって確立された電圧をシャントれている-勾配及びKの平衡電位に初期の膜電位を設定する+ 6,7。トンなしそれは膜電位の発生により阻止されるように流出が発生し、 -彼は有意な正味のClをイオノフォアん。 -流出、およびf 0、活性タンパク質を含有しないリポソームの割合τ、Cl -の時定数：データは、定量的に2測定可能なパラメータ（ 図1C）によって記載されている。 τおよびf 0から一体のCl -輸送速度、活性タンパク質の画分と活性複合体の分子量は8導出することができる。既知の構造および機能の交換-技術はCLC-EC1、よく特徴付けCLC型H + / Clで再構成されたプロテオリポソームを用いて、ここに示されている。このアッセイは、容易に又は活性電圧および/またはリガンドの存在に依存して異なるイオン選択性チャネルまたは輸送体に一般化される。さらに、このアッセイは、小分子は、直接再構成タンパク質に影響を与えるかどうかを決定するために用いることができるこれらの化合物の効果を定量する方法、および膜組成物又は脂質修飾試薬は、再構成されたチャネルおよび輸送体の機能に影響を与える。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="995">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:337px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:337px;">&#160;Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td>610200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IEC Centra CL2 Benchtop</td>
			<td style="width:337px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>These can be found on Ebay.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Non-functional pH probe</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; DI-710 Data Logger</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WinDAQ acquisition software</td>
			<td style="width:337px;">DATAQ instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml</td>
			<td style="width:337px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td>29922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:337px;">Kimble Chase</td>
			<td>73500-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extruder Set With Holder/Heating Block</td>
			<td style="width:337px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:337px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proteoliposome-based efflux assay to determine single-molecule properties of cl- channels and transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

交換器、リポソーム中に再構成-精製されたCLC-EC1、原核生物CLC型H + / CLにより媒介輸送-私たちは、詳細かつ堅牢なのClを測定するためのプロトコルについて説明します。実験の概略図を図3に示されている精製されたCLC-EC1及び高い内部のClを含有する再構成されたプロテオリポソームは、 -低のClを含有する浴溶液に浸漬されている- 。これらの条件の下で正味のCl -流出リポソーム（ 図3A）における正電荷の蓄積を防止する。流出（ 図3B） -バリノマイシンを添加すると、K +は、このように電位を分路およびCLを開始する膜を横切って移動することができます。フラックスの経時変化のClを使用して監視されている-選択性電極およびClの総量-小胞に含まれているが、直接洗剤を使用して可溶化することによって測定される。これらから、バルク実験は、そのような回転率、活性複合体の化学量論および活性タンパク質の画分として単再構成されたタンパク質の特性を決定することが可能である。流出の時間経過に合わせて、式7-9を使用して、我々はτ（0.2μgの/ MG）= 41秒であり、f 0（0.2μgの/ MG）= 0.31は、〜1ことを示すことがわかりCLC-EC1の単一の輸送速度を推定リポソームの/ 3は0活性タンパク質が含まれています。秒-1、公表値8,14とよく一致して-これらの値から、我々は単一の輸送速度はγ〜2500 Clであることを計算する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig1.jpg" /> 図1：のCl -流出アッセイ（A - B）のClの模式図- -effluxタンパク質を含まないリポソーム（A）のためのアッセイまたはCLC-EC1再構成された小胞（B）。 （C）イオノフォアが開始したClを模擬タイムコース-プロテオ（黒）またはタンパク質を含まないリポソーム（灰色破線）から流出。流出は、イオノフォア（*）の添加によって開始し、（^）リポソームを溶解する界面活性剤の添加により停止させる。赤は破線のClの時定数、τを決定する指数フィットです- CLC-EC1とf 0の少なくとも1のアクティブコピーを含むリポソームからの流出は、0活性タンパク質を含有するリポソームの割合です。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig1large.jpg" target="_blank">見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig2.jpg" /> 図2：録画設定する（A）記録を設定。。 （B）室のクローズアップ。 &lt;HREF = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52369/52369fig3.jpg" /> 図3：サンプル·トレースおよび分析を0.2μg/ mgのP / LにWT CLC-EC1で再構成プロテオから流出実験の（A）は、典型的なV（t）のトレース。。矢印は、KClの校正パルス、リポソーム、バリノマイシン及びβ-OGの添加時間を示す。破線は、様々な段階でのΔV値を示している。 （B）V（t）のトレースは、式5を用いて、Cl水溶液（トン）に変換されて、正規化を用いて式（6）および排出の時間経過は、（赤色の破線）式7に当てはめられる。 0.2μgの/ mgのP / L（黒）または5μgの/ mgのP / L（グレー）でWT CLC-EC1で再構成プロテオリポソームから（C）正規化された流出時間のコース。破線Sは7を方程式に流出時間のコースの最高のフィットです。

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A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

9.7K ビュー.  Weill Cornell Medical College. Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

生物学

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

核輸送の1分子イメージング

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

1分子FRETによるDNAループを研究

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する