Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

酵母細胞の1成長<ol><li> mRNAの減衰率測定のために利用される適切な酵母株を選択する。 RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害するために、rpb1-1突然変異1を保有する酵母株を使用しています。すでに1を持って研究室から、この酵母株を取得し、または特定の遺伝的背景が9必要な場合は、標準的な技術を用いて実験室でそれを生成する。 </li><li>無菌技術を使用して、標準的な手順10を用いて酵母培地を準備。何も選択が必要とされない場合には、そのようなYPDなどのリッチメディアを準備します。酵母細胞をプラスミドで形質転換され、選択が必要な場合あるいは、選択培地を調製する。メディアオートクレーブ。 </li><li>この酵母株を許容温度である28℃、で酵母細胞を成長させる。 2段階でこれを実行します。 <ol><li>最初のO / Nのために、飽和まで増殖培地5ml中の酵母細胞を成長させる。</li><li>二日目の終わりに第二のO / Nを設定します。第二のO / Nのために、第1のOから/ N（酵母細胞がする必要がある場合に応じて、100μlの1 mlの2ミリリットル以上までの範囲の増殖培地100〜150ミリリットル中に酵母細胞を異なる量の接種）次の日に収穫。文化の一つが正しいOD 600で、次の日であることを保証するために、この手順を行います。 </li></ol></li></ol> 2.収穫酵母細胞<ol><li>酵母細胞を採取するために準備します。このステップのタイミングは非常に重要です。必要なすべてのチューブにラベルを付け、一箇所ですべての必要な機器や材料を集める。 39℃に水浴を予熱し、28℃、60℃、成長培地二つの15ミリリットル試験管を予熱する。 NOTE：15ミリリットルの増殖培地の容積は、細胞が収穫される時点の数に応じて変化させることができる。 </li><li>彼らは0.7 OD 0.4の600に達したときに、酵母細胞を収穫。 TRANSFER 4個の細胞 - 6無菌の50ミリリットルは、キャップボトルをねじ込みます。 RTで5分間の高速遠心機において7500×gで遠心する。 </li><li>上清を捨て、28℃で平衡化した15ミリリットルの増殖培地中のペレットを再懸濁します。 1滅菌250mlのフラスコに酵母細胞をプールし、28℃の成長温度で約5分間インキュベートして平衡化。 </li><li>酵母細胞は、成長温度で平衡化した後、直ちに39℃（非許容温度）の温度を上昇させるために60℃で平衡化した成長培地15mlのを追加し、直ちに39℃の水浴でフラスコを置き。培養培地は、その転写がオフになっていることを確認するために残りの細胞を収穫する段階を通じて39℃の水浴中で残っていることを確認します。 </li><li> 39℃の水浴中にフラスコを置いた後、異なる時点で細胞を採取する。最初の時点では、39＆＃でフラスコを置いた直後に細胞を回収する176; C。 3ミリリットルアリコートを収穫し、2、1.5ミリリットルのマイクロチューブに3ミリリットルを配布。ミニ遠心機で10秒間細胞をペレットや急減速でpicofuge、上清を注ぐ。 </li><li>直ちにドライアイス/エタノール浴中で、または液体窒素中でペレットを凍結する。細胞を、ゼロ時点としてで収穫された最初の時点を指定する。 </li><li>実験的に関心のあるmRNAのに応じて、パイロット実験により細胞がその後に収穫された時点を決定する。通常は、以下の時点で収穫酵母細胞：0、3、6、9、12、18、25及び35分（ 図2B）。 mRNAの半減期は、上述した時点を用いて決定することができない場合は、これらの時点を調整する。例えば、予想される半減期の短いmRNAのために、短い時間のポイントを使用し、（ すなわち、0、1、2、3、4、6、9、12、18分）、および予想される長い半減期を有するmRNAのために、延長時間点。 </li><li>細胞の後ヘクタールであるRNA抽出が行われるまでrvestedは、-80℃の冷凍庫に保存する。 </li></ol>酵母細胞から3.抽出RNA <ol><li>プロトコルのRNA抽出部は、RNaseによるRNAの分解を防ぐために、RNaseを含まない技術を使用する。 RNAの抽出に使用するRNaseを含まないソリューション、ガラス製品、プラスチックウェアを準備します。 </li><li>標準的なプロトコルに従って酵母細胞からRNAを抽出します。一般的に、ホットフェノール法12を使用します。代替的に、酵母細胞からRNAを抽出するために使用することができるキットを使用。 </li><li>通常はナノドロップを用いたRNAの260と280 2μlので吸光度を測定することにより、RNAの量および純度を決定します。濃度に基づいてA 260からのRNAの濃度を測定、DEPC処理水を使用してを1μg/μlにRNAを希釈。 NOTE：A 280分の260の比をtについての情報を提供RNAの彼は純度。 A 260 / A 280比は2.0±0.1である場合にRNAサンプルは純粋である。 </li></ol> 4.ノーザンブロット分析注：mRNAレベルを定量化し、転写産物のサイズに関する情報を取得するために、ノーザンブロットを使用してください。また、同じmRNAの複数のアイソフォームを生成するmRNAを検出するためのノーザンブロットを使用しています。 <ol><li> 1.0％アガロース - ホルムアルデヒドゲルを準備します。標準プロトコル12に従って電気泳動によりアガロースホルムアルデヒドゲル上のサンプルRNAの等量を実行します。 RNAサンプルと一緒にRNAラダーを実行し、ノーザンブロット上で検出されたRNAのサイズを決定するためにそれを使用。膜へのアガロースホルムアルデヒドゲル上で分離したRNAを転写する前に、ゲルからのRNAラダーとレーンを切断し、臭化エチジウムを用いて可視化する。 注：また、全体のゲルはRNAの転写前、臭化エチジウムで染色することができる。 </li><li> A押え上げRNA試料をRNaseを含まない技術を用いてメンブレンにトランスファーRNA、ゲル上の適切な距離まで移動する。メンブレン12-13へのRNAを転送するために利用可能ないくつかのプロトコルのいずれかを使用してください。メンブレンにRNAを転写するために、ゲルとほぼ同じ大きさの膜を切断する。標準プロトコル12に従ってRNAを転送します。 </li><li> UVを製造業者の説明書に従ってUVクロスリンカーを用いて膜にRNAをクロスリンクする。代替的に、1時間80℃でオーブン設定で膜を焼く。それは特定のプローブにハイブリダイズされるまで無期限にビニール袋に入れて-20℃で膜に保管してください。 注：乾燥膜は、濾紙の間にRTで保存することができる。 </li></ol> 5.ハイブリダイズするプローブメンブレンに興味のRNAに相補的な注：膜上mRNAを検出する1つの方法は、32 P標識DNAプローブをハイブリダイズすることである。注意：Resea32 Pでの作業rchersは汚染を防ぐために保護手順を使用する必要がある。放射性物質の使用に関する制度的なガイドラインに従ってください。 <ol><li> 25標識したDNAプローブを調製- DNA 50ngの標準的なプロトコル12に従って膜にハイブリダイズされる。 PCRまたはプラスミドの消化によりDNAフラグメントを生成する。取り込まれなかったヌクレオチドは、12を除去した後に放射性標識したDNAプローブの1μLをカウントすることにより、DNAプローブの比活性を決定します。 </li><li> 42℃で予熱プレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液。膜12を100 1cm 2当たりプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液の〜10ミリリットルを使用してください。 </li><li>関心12のmRNAを検出するためのハイブリダイゼーションオーブン内膜O / Nへのハイブリダイゼーション緩衝液1ml当たり放射性標識DNAプローブの5×10 6 cpmの1 -ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの間に、ハイブリダイゼーションオーブン回転がその方向にあることを確認してください膜全体が適切なハイブリダイゼーションを確実にするために、ハイブリダイゼーション溶液に曝露させる。 </li><li> 2×SSPE 50mlを15分間で12倍SSPE / 2％SDS、50 mlの65℃で1時間と室温で15分間、膜を2回洗浄する。それが完全に乾くまたは蛍光ス​​クリーンを汚染しないことを確実にするためにラップで膜を包みます。 </li><li>ガイガーカウンターを用いて、膜上の放射能の強さを推定する。 注：この推定値は、膜が適切な時間蛍光体スクリーンに曝露されることを保証する。放射能の低い量を有する膜のためのより長い露光時間を使用してください。 </li><li>ノーザンブロットのために、等量のRNAが各スポットにロードされていることを確認するためにローディングコントロールを使用しています。これを行うには、膜を除去し、検査されているプロセスによって影響されないRNAでそれを再プローブ。 XS剥離液（0.1％SDS / 0.01を200mlの沸騰を含むガラストレイ内に配置することによって膜ストリップ2分間SC）。剥離液を注ぎ、手順5回12を繰り返します。 注：ローディングコントロールとして使用されるRNAの例は、SCR1 SCR1は安定しており、豊富なRNAポリメラーゼIII転写物ですSCR1 RNAの存在量は、RNAポリメラーゼII阻害の短い期間の間に大きく変化してはならない。。 </li></ol> 6.膜に結合されたRNAを定量化 NOTE：蛍光スクリーンに膜をさらす、膜上の放射能の量を定量するために。適切な露光時間の後、ホスホイメージャを使用して蛍光面をスキャンします。 <ol><li>ホスホイメージャのメーカーが提供する指示を使用して蛍光面をスキャンします。 </li><li>各時点でmRNAを定量化する。をImageQuantソフトウェアまたは関連するソフトウェアを使用してmRNAレベルを定量化する。ローディングコントロールに各時点でmRNAを正規化する。 SCR1、ロードとして使用された場合コントロールは、SCR1に半減期のノーザンを正常化。 </li><li> mRNAの半減期は、時刻0（初期時点）でのmRNAの存在量によって、各時点で残っているmRNAの量を割ることによって計算される。片対数プロット（ 図2C）に対時間残り％のmRNAをグラフ化。次の式でのmRNAの半減期を計算します。 T 1/2 = -0.693 / K（負0.693） </li><li> kは、ベストフィット線の傾きであり、t 1/2は、mRNAの半減期である。 </li></ol>

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	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. 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The authors declare that they have no competing financial interest.

mRNA合成の阻害は、新しい合成の非存在下でのmRNAの代謝回転を監視するには、しばしばmRNA崩壊速度を測定するために使用される方法である。 S.でセレビシエは、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害することによってmRNA崩壊率の測定は、最も頻繁に使用される方法の一つである。この方法は、具体的にはRNAポリメラーゼIIを阻害する。この技術を用いたmRNA減衰率を決定するための最も重要な手順は次のとおりです。1）酵母細胞を収穫する前に、その転写は39℃での文化を維持することによって遮断されていることを確認。 2）プロトコルのRNA抽出およびRNAゲル電気泳動工程の間、RNaseを含まない技術が使用されることを保証する。 3）予想通り、RNAの等量がロードされたことを、実験治療が機能していることを確実にするために正規化のためにコントロールRNAを使用します。 4）再現性のANを確実にするために少なくとも3回mRNA崩壊速度測定を繰り返す半減期の測定値のd精度。 rpb1-1酵母株は、通常、転写を阻害するために37°Cに転送される。しかし、我々は、転写の37℃の阻害温度シフト後2~3分が発生することを見出した。 39℃の時の転写阻害は11、4即時であるが、mRNA崩壊速度を決定するためのこの技術の使用は、いくつかの制限がある。主な制約は、特別な酵母株が必要とされることである。前述のように、この酵母株は、いずれか他の研究室から得ることができ、または特定の酵母遺伝的背景が必要な場合は、実験室で生成された。酵母株が得られると、この手法は単純で簡単である。第二の制限は、この方法は、転写を阻害するための熱ショックに酵母細胞を暴露を伴うことである。熱応力は、特定のmRNAの崩壊速度を含む細胞プロセスに影響を与えることができる。 、それらのmRNAの減衰率THAたとえば、ストレス応答に関与するタンパク質のtエンコードが影響を受ける可能性がある。最後に、RNAポリメラーゼIIにおける変異を有する酵母株の使用率が異なって正常な転写産物から振る舞う代替転写物の産生をもたらすことができる。 導入部で述べたように、他の技術がS.におけるmRNA崩壊速度を測定するために利用される出芽酵母 。これは、このようなthiolutinと1-10フェナントロリンなどの化学物質を使用した転写の阻害を含む。それらは、任意の酵母株を使用して行うことができ、mRNA崩壊速度はまた、ゲノム全体または個々の内因性の転写物について決定することができるという点で、これらの技術は、有利である。また、mRNAの減衰率の測定は、様々な生理学的条件下で行うことができる。これらの薬剤の有用性は、それらがまた、細胞プロセスに影響を与え、示差的mRNAの崩壊速度に影響を与えることができるという事実によって制限される。さらに、thiolutinは、容易に入手可能とするときは利用できません高価である。 この技術をマスターした後つは個々のmRNAまたはゲノムワイドのmRNA崩壊速度を決定することができるであろう。また、mRNA崩壊速度は異なる条件を差動mRNA崩壊速度に影響を与えるかどうかを調べるために、異なる生理学的条件下で測定することができる。

特定のmRNAの転写および減衰は、遺伝子発現の重要な決定因子である。特定のmRNAの合成及び減衰率​​は、その特定のmRNAの定常状態レベルを決定する。 mRNAの定常状態レベルは、mRNAの豊かさを支配し、タンパク質合成のために提供されてどのくらいの各mRNAの決定する。 mRNAの半減期の測定は、mRNAの減衰率を決定するために広く使用されている。 mRNAは、mRNAおよび環境条件によってコードされるタンパク質の機能の特徴に関連して異なる速度で特定のmRNAの崩壊。 mRNA崩壊速度を決定するために利用された技術に応じて、減衰率の測定は、グローバルに、または個々の転写物について決定することができる。酵母S.でセレビシエ 、最も一般的にグローバルなmRNA崩壊速度を測定するために使用される技法は、RNAポリメラーゼII及び化学transcの温度感受性対立遺伝子を保有する酵母菌株を利用含まそのようなthiolutin 1,10-フェナントロリン1-5としてriptional阻害。これらの方法は、個々のmRNA崩壊率4を測定するために利用することができる。他の方法もまた、mRNA崩壊速度を測定するために利用することができる。これらの方法は、定常状態の標識のみを選択条件において発現される調節されたプロモーターから発現されるmRNA分子の利用へのアプローチを含む。これらの技術は、それぞれ特定の利点と制限があります。ここに記載の技術は、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を利用する。この方法では、Sを使用してcerevisiaeのモデルとして、特定の転写阻害技法6を用いて、他のシステムに変更され、利用されことができるが。 RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を用いたmRNAの半減期の測定は、広範囲のmRNA崩壊4-5の両方のゲノム全体および個々の測定のために使用される。この技術は、specifの使用を必要とするRNAポリメラーゼII、rpb1-1 1の温度感受性対立遺伝子を保有するでIC酵母株。この技術の原理は、非許容温度に温度感受性酵母株の曝露は、mRNA合成を阻害することである。転写が阻害された後に続いて、既存のmRNAの崩壊は、様々な時点で監視される。既存のmRNAの消失は、転写がオフにされた後の異なる時点での酵母細胞からRNAを抽出することによって監視される。酵母細胞が収穫される時点は、パイロット実験により所定の、および研究されて転写物およびシステムに依存している。より長い時点長く生き転写物のために使用されている間より速い時点は、短命の転写物のために使用される。その後、mRNAの崩壊は、ノーザンブロット分析、定量的PCRまたはRNAseqいずれかによって監視される。 TEを使用して、mRNAの半減期の測定RNAポリメラーゼIIのmperature敏感な対立遺伝子は、その利点を持っています。第一に、この技術は、簡単で単純である。酵母株は、実験室で取得又は生成されると、第二の、mRNAの半減期の測定は、異なる成長条件で測定することができる。 mRNA分解の環境影響の決定を可能にする。第三に、mRNA崩壊速度は、ゲノム全体を監視することができる。他の転写抑制技術の使用は、利点および限界を有する。例えば、誘導性プロモーターの使用は、調節されたプロモーターの制御下にあるmRNAを生成するためにサブクローニングを必要とする。 Thiolutinは容易に入手できないと利用可能な場合に高価である。また、アクションのthiolutinのモードは完全には理解されず、mRNA崩壊7の阻害を含む他の細胞プロセスに影響を与えることが報告されている。また、1,10-フェナントロリンは、より容易に利用可能である。さらに、転写を阻害するために使用される技術の全ては、PERTでき細胞機能をURBと異なる方法で異なるmRNAに影響を与えることができる。研究者は、最も信頼性の高い結果を得るために彼らの実験条件で使用する最も適切な方法を決定する必要がある。彼らのアプリケーションに最も適している方法を決定するために、研究者が研究されている転写産物によりコードされるタンパク質の転写物および機能を特定する必要があります。最も信頼性の高いmRNA崩壊速度測定は、複数の技術を使用して決定し、同一の減衰速度を示しているものである。単一の技術は常に最善ではない、と最も適切な手法は、特定の状況に依存します。 S.で多数の研究セレビシエは、様々な条件や遺伝的背景においてmRNA崩壊速度を測定した。 mRNA崩壊速度がで測定されている条件が検討され、特定の実験に依存しています。異なる細胞環境におけるmRNA崩壊速度を測定する条件があるか否かを判断する優先的に特定のmRNAの崩壊率に影響を調べた。 mRNAの減衰率も使用されている酵母株に依存して変化し得る。例えば、mRNA崩壊速度は、非機能的ナンセンス変異依存mRNA分解（NMD）経路と、野生型酵母細胞、酵母細胞で測定することができる。このmRNA分解経路は、これまでに検討されている全ての真核生物に見られ、それは早期翻訳8を終了し、mRNAの分解を誘発する。 NMDは当初早期終結コドンまたはナンセンスコドンとmRNAを分解する経路として同定されたが、今も自然なmRNAを含む非ナンセンスの発現を調節する経路として認識されている。経路の標的であるmRNAは急速に機能的なNMD経路を酵母細胞内で分解し、非機能的なNMD経路を酵母細胞中で安定化されている。したがって、この経路の直接の標的であるmRNAの半減期は、野生型酵母のセルが短い非機能的なNMD経路を有する酵母細胞と比較してのl​​s。

<table><tbody><tr><td>High Speed Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus membrane</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&amp;deg; for 1 hour</td></tr><tr><td>NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td><td></td><td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNAの定常状態レベルは、環境条件に応じて変化する。 mRNAの定常状態の蓄積レベルの調節は、タンパク質の正確な量は、細胞の特定の増殖条件のために合成されることを保証する。 mRNA崩壊速度を測定するための一つのアプローチは、転写を阻害し、続いて、既に存在するmRNAの消失を監視している。 mRNA分解の速度を定量することができ、正確な半減期は、いくつかの技術を利用して決定することができる。 S.でセレビシエは 、mRNAの半減期を測定するためのプロトコルが開発され、RNAポリメラーゼII、rpb1-1の温度感受性対立遺伝子を保有する菌株を用いて、mRNAの転写を阻害することが含まれている。 mRNAの測定のための他の技術の半減期は、調節可能なプロモーターの制御下にあるmRNAを利用することにより、あるいはそのようなthiolutin又は1,10-フェナントロリンなどの転写阻害剤で転写を阻害する、または含むガラクトース誘導性プロモーター及びTETオフシステムとして。ここでは、Sの測定を説明RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用した出芽酵母のmRNA減衰率。この技術は、個々のmRNAまたはゲノムワイドのmRNA崩壊速度を測定するために使用することができる。

<html> RNAおよびノー​​ザンブロット法を抽出しながら、正確なmRNA減衰率を測定するために、このプロトコルの能力は、転写の阻害、適切な時点での酵母細胞の収穫、およびRNaseフリーの技術の利用に依存します。それぞれ、不安定で安定していることが知られている2つのコントロールのmRNAのためにプロービング、実験が働いていることを確信しています。例えば、これは、CYH2 mRNA前駆体およびmRNAの両方を検出するプローブでプロービングすることによって達成することができる。 図2Bは、転写阻害後の異なる時点での野生型及びNMD変異酵母株におけるCYH2 mRNA前駆体の消失を示した。 CYH2 mRNA前駆体は、機能NMD経路（UPF1）非機能的なNMD経路（UPF1）と酵母細胞と比較してより高速な酵母細胞中で分解される。 40fig1highres.jpg &quot;/&gt; 1.メソッドのフローチャート図 。 mRNA崩壊速度フローチャートの測定<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52240/52240fig2highres.jpg" /> 図2のmRNA CYH2の半減期が-preプレmRNAおよびmRNA（A）CYH2 mRNA前駆体およびmRNAのCYH2。CYH2 mRNA前駆体の略図が非効率的にスプライスされ、それがNMDによって分解され、細胞質に輸送され経路。それは時期尚早終止コドン（PTC）を含むイントロンがないため、CYH2 mRNAはNMD経路により分解されない。（B）野生型（UPF1）とNMDの変異株（UPF1）から抽出したRNAの半減期ノーザンブロット。 TRAの後の時点nscription阻害はノーザンブロット上に記載されています。ブロットを放射性標識したCYH2 DNA。（C）は、野生型で時間に対して残り％CYH2プレmRNAのグラフ（UPF1）とNMDの変異株（UPF1）でプローブした。このグラフは、CYH2 mRNA前駆体は、NMD変異酵母株（UPF1）よりも野生型（UPF1）より速い速度で分解されることを示している。

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.5K ビュー.  Baylor University. 特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。 

ビデオ: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

遺伝学

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

生化学

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be bound by many different RBPs that will regulate its production, stability, activity, and degradation. As such, much has been done to understand the dynamics that exist between these two types of molecules. A particularly important breakthrough came with the emergence of &#8216;cross-linking and immunoprecipitation&#8217; (CLIP). This technique allowed stringent investigation into which RNAs are bound by a particular RBP. In short, the protein of interest is UV cross-linked to its RNA substrates in vivo, purified under highly stringent conditions, and then the RNAs covalently cross-linked to the protein are converted into cDNA libraries and sequenced. Since its conception, many derivative techniques have been developed in order to make CLIP amenable to particular fields of study. However, cross-linking using ultraviolet light is notoriously inefficient. This results in extended exposure times that make the temporal study of RBP-RNA interactions impossible. To overcome this issue, we recently designed and built much-improved UV irradiation and cell harvesting devices. Using these new tools, we developed a protocol for time-resolved analyses of RBP-RNA interactions in living cells at high temporal resolution: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (&#967;CRAC). We recently used this technique to study the role of yeast RBPs in nutrient stress adaptation. This manuscript provides a detailed overview of the &#967;CRAC method and presents recent results obtained with the Nrd1 RBP.

Kinetic cross-linking and analysis of cDNA is a method that allows investigation of the dynamics of protein-RNA interactions in living cells at high temporal resolution. Here the protocol is described in detail, including the growth of yeast cells, UV cross-linking, harvesting, protein purification, and next generation sequencing library preparation steps.

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するために<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

生物学

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

mRNAの崩壊料金の測定で

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S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

インビボ酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するために

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

mRNAの崩壊料金の測定で

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ひと線維芽細胞の増殖静止ゲノムワイドな転写減衰率を決定します。

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するために

タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

インビボ酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で