This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

注：動物実験における倫理のためのゲッティンゲン大学委員会によって承認された動物の取り扱いおよび実験を行った。 楽器やピペットの作製の作製<ol><li>エレクトロポレーションのセットアップは、大きな作動距離を持つ実体顕微鏡で構成され、使用される色素のための蛍光照明とフィルターのセットが装備されていることを確認してください。 </li><li>エレクトロポレーションのために専用の単一細胞エレクトロまたはオシロスコープに取り付ける一般的な方形パルス発生器のいずれかを使用します。ピペットホルダーと風呂電極にエレクトロ出力を接続します。マイクロピペットホルダとバス電極と負端子にパルス発生器の正端子を接続する。ピペットホルダーとバス電極の両方が塩化銀の薄層で被覆された銀のワイヤが含まれていることを確認してください。 </li><li>正確な位置決めを可能にするマイクロマニピュレータにピペットホルダーをマウントします。 </li&gt; <li>内部のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーからエレクトロポレーション、マイクロピペットを製作。 </li><li>水平マイクロピペットプラーを使用して、Bestman らによって記載されるように、パッチクランプ実験用ピペットの製造のための修正されたプロトコルを適用する。13。 </li><li>長いシャンク単一細胞エレクトロポレーション用15-20メガオームの高いピペット抵抗をもたらす小さな先端開口を生成するためのパラメータを適応させる。ピペット抵抗は、セル群の標識のために、 例えば 、3-4メガオーム低いはず。 </li><li>直接的に専用の単一細胞エレクトロピペット抵抗測定、規定された電圧パルスの印加後にオシロスコープで電流の流れを測定した後、オームの法則でそれを計算する。 </li></ol>エレクトロポレーションソリューションの調製<ol><li>カエルリンガー（98のNaCl、2mMのKClの中で、フルオロフォア結合デキストランを溶解させ、1mMのCaCl 2、2mMの上記MgCl 2は 、5 mMグルコース、5 mMのピルビン酸ナトリウム、pHを7.8に調整し、10mMのHEPESは、オスモル濃度は3 mMの濃度で）230ミリオスモル/ Lであった。低い色素濃度が使用される場合、細胞はそのように明るく標識されなくてもよい。大容量の原液を調製し、少量のアリコートに分割する。ストレージ（ヶ月間安定）のためにそれらを凍結する。 注：デキストランさまざまなサイズで提供され、発光/励起スペクトルの様々な（ 例えば 、アレクサ488デキストラン10KD、アレクサ546デキストラン10KD、アレクサ568デキストラン10KD、アレクサ594デキストラン10KD、TMR-デキストラン3kD。）。 </li><li>デキストラン溶液（1-5μl）を少量の細長いピペットチップでマイクロピペットを埋め戻す。注意深くピペットチップから残留気泡を除去するためにマイクロピペットを指ではじく。 </li><li>ピペットホルダーにマイクロピペットをマウントします。ピペット内部の銀線を染料溶液に接触していることを確認してください。 </li></ol>幼虫Xの3選定ツメガエル&lt;/ em&gt;の<ol><li> Xのアルビノ幼虫を使用してください実験のためツメガエル 。野生型動物は、共焦点/多光子イメージング中に自己蛍光発光を示すので、記載された実験には適していない顔料で満たされたメラニン保有細胞を有する。 </li><li> Nieuwkoopとフェーバー14の後premetamorphoticオタマジャクシを上演。実験用のステージ45-53のオタマジャクシを選択します。 </li></ol>フォア結合デキストラン4.エレクトロ<ol><li>ペトリ皿、組織の小片を置き、0.02％トリカイン（エチル3-アミノベンゾエートメタン、pHを7に調整）を含有する少量の水でそれをカバー。 </li><li> 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。いくつかの分後に動物が動いやめる。オタマジャクシに触れることによって、適切な麻酔を確認してください。彼らは、非応答でなければなりません。 </li><li>慎重に組織に覆わペトリ皿に麻酔からオタマジャクシを移す。 </li><li>必ず風呂あるelectrを作るODEは、エレクトロポレーション回路を閉じる。電極がウェットティッシュに接触していることを確認してください。オタマジャクシへの直接接触が必要ではない。 </li><li>マイクロマニピュレーターを用いて嗅覚器官に近い位置マイクロピペットチップ。 </li><li>ピペットチップで嗅覚器官をカバーする皮膚を貫通し、慎重に主嗅上皮や鋤鼻上皮の中心に位置する感覚ニューロン層に先端を進める。 </li><li>感覚ニューロンに色素を転写する正四角形の電圧パルスをトリガする。単一の電圧パルスを印加する（ 例えば 、25 V、パルス長25ミリ秒）または複数のパルス列（ 例えば 、50 V、パルス長300秒、200 Hzで400ミリ列持続時間）。 注：目的のラベリングの延長のための最適な電圧パルスのパラメータを決定します。標識細胞の数を低下させるために、電圧パルスの振幅、持続時間、および繰り返し回数を減らす。 pが高電圧パルスの振幅、持続時間及び数を適用するより広範な標識のためulses。 </li><li>実体顕微鏡の蛍光灯照明を使用してトリガパルスによる成功した染料押出およびエレクトロポレーションを視覚化する。染料は、成功したエレクトロポレーション後、細胞体と樹状突起に素早く広がります。 </li><li>繰り返しますオタマジャクシの第二嗅覚器官のために4.5から4.9を繰り返します。 </li><li>回復のために新鮮な水で満たされたビーカーにオタマジャクシを移す。約後に5分オタマジャクシが麻酔から覚めると、通常の水泳運動を開始します。 </li><li> 24時間後にエレクトロ色素が感覚ニューロンに広がり、最終的には軸索輸送を経由して嗅球に到達した。 </li></ol>細胞および軸索プロセスのin vivo可視化5.取付の動物<ol><li> 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。 </li><li>注意深く例えば撮像チャンバ内にオタマジャクシを移す、小さなシリコンゴムは、オタマジャクシサイズの凹部をペトリ皿を覆った。&lt;/ LI&gt; <li>パラフィルムのストライプに小さな長方形に切る。切り抜き窓を介して露出し前方終脳を残して、パラフィルムでオタマジャクシをカバーしています。オタマジャクシを傷つけることなく、皿の上に針でパラフィルムを固定します。 </li><li>オタマジャクシは0.02％トリカインを含む十分な水の中に沈めていることを確認します。 </li><li>直立多光子顕微鏡や共焦点顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。 </li><li>嗅球の像の3次元積層を獲得。イメージング処理が可能な限り短く、10〜15分を超えていないことを確認してください。 </li><li>別のタンクに通常の水にオタマジャクシを返すと光への曝露を防止する。 5分後、オタマジャクシが麻酔から目覚める。 </li><li>繰り返します、 例えば 、指定された時間間隔の後に5.1から5.7を繰り返します。毎日。 </li></ol>細胞および軸索プロセスの ex vivo可視化のための6のマウント動物<ol><li>代わり部5にプロトコルの標識された感覚ニューロンを可視化するために摘出した脳の準備を使用しています。 </li><li>麻酔や脊髄への移行時に、脳の離断によってオタマジャクシを殺す。嗅覚器官、嗅神経と前方終脳を含む組織のブロックを切り出す。 </li><li>カエルリンガー溶液に組織ブロックを転送し、脳の腹側を露出させ細かいハサミで結合組織を取り除く。 </li><li>イメージング室に組織ブロックを転送し、ナイロン糸で弦楽器プラチナ枠で固定します。 </li><li>共焦点/多光子顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。 </li><li>嗅球の像の3次元積層を獲得。 </li></ol> 7.画像処理およびデータ評価<ol><li>クーペ、P. らによって記載されるように最適化し、画質と神経構造の視覚化を改善するために、フィルタリングの非局所的な手段を適用する。15。 NOTE：ライブ試料のより深い組織層におけるイメージング実験からのデータは、多くの場合、ノイズが多い。 </li><li>概要については、画像スタックの最大強度投影を作成します。 </li><li>タイムラプスイメージングのための実験は、感覚ニューロンの単一の明確に識別軸索のためのデータセットをスクリーニングする。 </li><li>パンらによって記載されるように神経突起のソフトウェア支援のトレースを介して細胞の形態を再構築。16。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで説明する実験手順は、幼虫Xの嗅覚器官の感覚ニューロンを標識化することができますフルオロフォア結合デキストランのエレクトロポレーションおよび生きている動物における感覚軸索成長のその後の可視化によってツメガエル 。 インビボでのエレクトロポレーションのパラメータを変えることにより、標識された感覚ニューロンの数を制御することが可能である。それは、感覚上皮のニューロンの大規模なグループ、非常に少数または単一の細胞を標識することが可能となる。 希望する神経細胞のラベリングの延長を保証するためには、マイクロピペット特性および電気穿孔パルス約特に慎重であることが重要です。高いピペット抵抗、電圧パルスの振幅、持続時間及び繰り返し回数の減少は、より広範な標識をもたらすことができるピペット抵抗と高電圧パルスの振幅、持続時間、およびパルスの数を減少させる一方で、標識された細胞の量を減らすことができる。目エレクトロポレーションのための蛍光デキストランの電子の使用は、適用した設定が適切であれば即時の視覚的なフィードバックを提供しています。プロトコルで提供された値を超えたパルスの振幅、持続時間、および数のパラメータを使用すると、潜在的に細胞の損傷、あるいは細胞死17につながる可能性があることに注意してください。マイクロピペットの目詰まりや破損のヒントにも成功したエレクトロポレーションを妨げることができます。 Xの嗅覚器官のin vivoエレクトロポレーションでは postmetamorphoticカエルの皮膚は厳しいですし、簡単にマイクロピペットで浸透することはできませんので、 ツメガエルは幼虫期に限られている。神経突起のin vivo可視化は、より深い脳領域または血管によって励起/発光光の散乱によって妨げられることができる。この問題は、より大きな脳への高い幼虫期に特に顕著になり、細かい軸索のプロセスの明確な識別をより困難にノイズの多い信号につながることができます。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;ラベリング中に細胞を損傷、動物を解剖することなく、無傷の嗅覚系における感覚ニューロンを可視化するために提示プロトコル許可、組織切片を準備するか、全細胞パッチ中の標識のような、代替的な方法のために必要に応じて組織を固定-clamp実験18。 in vivoでのタイムラプスイメージングで数または単一の感覚ニューロンの標識を組み合わせる場合には、長い時間間隔にわたって単一の成熟した感覚ニューロンの糸球体の接続を可視化することが可能である。このように、それは数週間にわたって未熟感覚ニューロンの軸索投射パターンの開発を監視することも可能である。それは生きている動物内の単一の軸索の成長パターンを監視することができますので、この後者のオプションは、特に興味深い。これは軸索ガイダンスや経路探索を制御する細胞および分子メカニズムを調査する可能性を開く。嗅覚受容体の発現を含むいくつかの要因は、様々なAXOn個のガイダンス分子と感覚ニューロンの匂い物質誘発性/自発的活動は、感覚ニューロン軸索4,5のターゲット発見を調節することが示されている。 プロトコルの適用は、嗅覚感覚ニューロンに限定されず、 例えば、他の細胞型を研究するために適用することができる。、発達中の脳または嗅球の僧帽細胞の神経性ゾーン/前駆幹細胞。さらに実証技術は、標識されたニューロンおよび/ ​​または接続された回路7,19についての機能情報を取得するために、カルシウム感受性デキストランまたは注入された膜透過性カルシウム色素と組み合わせて使用することができる。デキストランに結合されたフルオロフォアの広範囲の利用可能性は、異なる色を持つ複数の個々の細胞または集団の標識化を可能にする。また、蛍光タンパク質のための例示的な符号化のためのDNA溶液を、プラスミドエレクトロポレーションに適しており、さらにversatiliを高めることができるTYとテクニック6の有用性。プロトコルは、さらにデキストランおよびDNAまたは荷電モルホリノの組み合わせエレクトロポレーション、遺伝子発現13,17を操作することができるように拡張することができる。 記載されている方法は確かに複雑であり、脊椎動物の嗅覚系における軸索ガイダンスを調節し、まだ十分に理解されていないプロセスを調査するための新しいツールを表しています。

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table><tbody><tr><td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Stereomicroscope with fluorescent illumination</td></tr><tr><td>Axon Axoporator 800A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Single cell electroporator</td></tr><tr><td>ELP-01D</td><td>npi electronic</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>MMJ</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user Wetzlar</td><td></td><td>Manual micromanipulator</td></tr><tr><td>P-1000</td><td>Sutter</td><td></td><td>Horizontal micropipette puller</td></tr><tr><td>G150F-4</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td></tr><tr><td>Alexa 488-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22911</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22912</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594-dextran 10 kD</td><td>Life Technologies</td><td>D22913</td><td></td></tr><tr><td>TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby)</td><td>Life Technologies</td><td>D7162</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Anesthetic; use gloves</td></tr><tr><td>A1-MP</td><td>Nikon</td><td></td><td>Multiphoton microscope</td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Confocal microscope</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Alternative software for neuronal tracing</td></tr></tbody></table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

記載されたプロトコルが正常にエレクトロポレーションし、麻酔されたXの嗅覚系の感覚ニューロンの軸索プロセスのin vivoでの可視化に適用することができツメガエル 、共焦点レーザー走査または多光子顕微鏡法（ 図1）を使用。 エレクトロポレーションは、フルオロフォア結合デキストランを入力すると、急速に嗅覚器官の細胞の内側に広がることを可能にする。これは、電圧パルスのトリガ後に成功したラベリングを検証するために蛍光照明を適用すると便利です。 、エレクトロポレーションパラメータに応じて、例えば 、ピペット抵抗は、細胞（ 図2A、B）または嗅覚器官の単一細胞（ 図2C）の基が標識されている。標識された感覚ニューロンの軸索は、嗅神経（ 図2D）で可視化することができ、軸索のプロセスが成功したエレクトロポレーション後、嗅球においても、通常24時間を観察することができる（ 図3）。感覚ニューロンのグループのエレクトロポレーションは、嗅球（ 図3A）に粗配線パターンを可視化することができる。単一細胞エレクトロポレーションは、嗅球（ 図3C-E）における糸球体の構造の個々の軸索投射パターンが、軸索の分岐部と接続性を調査するために適用することができる。 Xの透明アルビノオタマジャクシ麻酔をかけたオタマジャクシの無傷の脳における標識感覚ニューロンの生体内共焦点または多光子イメージングにおけるツメガエル許可 。同じ標識感覚ニューロン（ 図4）のin vivoでの可視化を繰り返すことにより、軸索の成長パターンの開発は、数日/数週間にわたって追跡することができる。感覚ニューロンの成熟度に応じて、エレクトロポレーションの時点で嗅球における軸索パターンが大幅に変化することができる。成熟したニューロンは既に房を備えて精巧な軸索の枝を持っている糸球体に接続されているEDエリア。成熟したニューロンの軸索成長パターンはむしろ安定であるが、糸球体房の軸索の枝や改良の伸びが（ 図4A-E）観測可能である。感覚ニューロンは、 例えば 、長期間にわたって生体内で観察することができる。3週間（ 図4F-I）よりも長い。一方、未熟ニューロンの軸索は、タフテッドarborizationsを有していない、初期成長の過程にまだ​​ある、まだそれらの最終的な糸球体ターゲットに接続していない。実験プロトコルは、成熟中にこれらのニューロンの開発を追跡することができます例えば 、軸索の伸長、分岐及びタフテッドarborizations（ 図4J-L）の設立。その他の例についてもHassenklöverとマンジニ12を参照してください。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; 麻酔をかけたXの嗅覚器官の実験プロトコルの図1.概要。（A）の主嗅上皮における感覚ニューロン（MOE）または鋤鼻器官（VNO） ツメガエルの幼生は、蛍光デキストラン溶液を充填したガラスピペットを用いてエレクトロポレーションを介して標識される。標識されたニューロンの軸索は、嗅神経（ON）を介して、続いて、最終的に嗅球（OB）に到達することができる。（B）オタマジャクシに麻酔され、標識されたニューロンを繰り返し、特定の時間間隔で、共焦点又は多光子顕微鏡を用いて調べた。 （C）標識された細胞の軸索成長パターンのインクリメンタル開発は、数日から数週間の時間スパンにわたって追跡することができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> 図2.エレック嗅覚器官における感覚ニューロンのポレーション（A）エレクトロ低抵抗ピペットとは、嗅覚器官内の複数の細胞の標識をもたらす。この代表的な例では、複数の嗅覚受容ニューロン（ORN類、満たされた矢じり）と2つの円柱形の支持細胞（SCS、アスタリスク）が染色された。破線は、嗅上皮（OE）の境界を画定する。（B）、エレクトロポレーションパラメータを絞り込み、 例えば 、ピペットの抵抗を増大させる、標識細胞の数を制限する。この例では、単一の感覚ニューロン（黒塗り矢印）と一つの隣接支持細胞（アスタリスク）は、エレクトロポレーションの後に染色した。嗅上皮（オープン矢じり）を残し、単一の軸索に注意してください。（C）に成功した単一細胞エレクトロポレーションは、個々の感覚ニューロン（塗りつぶされた矢印）および嗅上皮で、接続された軸索（オープン矢じり）の排他的ラベリングにつながる。 <sチョン&gt;（D）単一ラベルの軸索（オープン矢頭）が嗅球に嗅覚神経（ON）を通じて続くことができる。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> 図3.摘出した嗅球における嗅覚軸索投射を可視化。（A）の嗅球における感覚ニューロンの軸索投射の粗いトポロジーは、低抵抗電気穿孔ピペットを用いて可視化することができる。 One嗅球半球とそれに関連する嗅神経（ON）が示されている。 MOE（赤）とVNO（オレンジ）を外側から内側、横方向（緑）、中間体（黄色）：異なる蛍光体に結合された4つのデキストランは、嗅覚器官の4離れた位置で電気穿孔した。これは副嗅球（AOB）と主嗅球（MOB）の3つの主要な投影フィールドを可視化することができます。 <strオング&gt;（B）は嗅球の構造に重ね合わせ、単一の嗅細胞の軸索異なる成長パターン。描写は、異なる幼虫の標本に由来し、複数の単一細胞染色の三次元再構成を組み合わせられる。嗅球内に突出すると球状糸球体（塗りつぶされた矢印）にタフトarborizations /シナプスを形成する単一の嗅覚軸索の（CE）の例。 Xのことに注意してください嗅覚軸索は（塗りつぶされた矢印は、またHassenklöverとマンジニ12を参照）一つ、二つまたは複数の糸球体に接続する前に定期的に（オープン矢じり）を二股ツメガエル 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> シングル嗅覚ニューロンの軸索のin vivoでのタイムラプスイメージング。（AE） では 、図4成功した単一細胞のエレクトロポレーションの後、標識軸索を繰り返し嗅球（OB）で可視化することができる。この例では、1週間調査した個々の軸索を示しています。 （開いた矢印）の全体的な形態は大きく変化せず、二つの主要な分岐点を識別することができる。他の二つの糸球体の房が（アスタリスク）安定した状態を保つのに対し、時間経過にわたって、1糸球体房は、連続の減少（塗りつぶされた矢印）を受けることに注意してください。（FI）この特定の軸索を調べたように、この代表的な例は、長期的な観測の生存率を示す3週間以上のために。その成長パターンの明らかな変化は検出できなかった。（JL）成長過程における未熟感覚軸索の一例が示されている。それはまだ糸球体に接続されていないがあり、特徴的な糸球体房が欠落しています。軸索の枝を長くしている5日後に、軸索は複数回と罰金arborizationsである二股確立された。

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.9K ビュー.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

神経科学

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an excellent model to investigate this process since 50 types of olfactory receptor neurons (ORNs) from the antennae and maxillary palps project their axons to 50 identifiable glomeruli in the antennal lobe and form synaptic connections with dendrites from 50 types of second-order projection neurons (PNs). Previous studies mainly focused on identifying important molecules that regulate the precise targeting in the olfactory circuit using fixed tissues. Here, an antennae-brain explant system that recapitulates key developmental milestones of olfactory circuit assembly in culture is described. Through dissecting the external cuticle and cleaning opaque fat bodies covering the developing pupal brain, high quality images of single neurons from live brains can be collected using two-photon microscopy. This allows time-lapse imaging of single ORN axon targeting from live tissue. This approach will help reveal important cell biological contexts and functions of previously identified important genes and identify mechanisms underpinning the dynamic process of circuit assembly.

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

This protocol describes the dissection procedure, culture condition, and live imaging of an antennae-brain explant system for the study of the olfactory circuit assembly.

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

発生生物学

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する

要約

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培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

小脳軸索のレーザーNanosurgery

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する

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培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

小脳軸索のレーザーNanosurgery

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

視床皮質軸索分岐とシナプスの可視化脊髄共培養系における形成

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化