This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.

注：イリノイ大学シカゴ校の動物実験委員会によって承認された全体の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施した。 1。ソリューションおよび培養培地の準備<ol><li> 6ヶ月までのために-20℃で、すべてのソリューションにしてください。 3ヶ月まで4℃で培養培地にしてく​​ださい。 </li><li> DMEM中で100mlにITSX（インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント）1ペン連鎖球菌溶液および1ミリリットルを混合することにより、培養培地100mlのを準備します。 </li><li> 100のCaCl 2、および50mM EDTAを2.5ミリリットルの2.5ミリリットル、250ミリリットルのDMEMを混合して酵素溶液を調製します。 </li><li> DMEMを225ミリリットル、FBSを25ミリリットル、アルブミン625 mg及び625 mgのトリプシン阻害剤を混合して不活性化溶液を調製する。 </li><li> 154のNaCl、5.6のKCl、5.0mMのHEPES、3.6 mMの炭酸水素ナトリウム、5.6 mMグルコースのロックのソリューションを準備します。 NaOHで7.3にpHを調整する。 </li><li>50 mg / mlののポリ-D-リジン（PDL）溶液を調製する。被覆カバースリップに1mg / mlの最終濃度を使用する。 </li><li> 140mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、10mMのHEPES-NaOHを、および10 mMグルコースの細胞外溶液を調製する。 〜310ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。 </li><li> 50のNaCl、100mMのTEACL、5mMのKCl、2mMの塩化カルシウム、1mMのMgCl 2、および10mMのHEPESのピペット溶液を調製します。 〜290ナノモル/ kgで浸透圧をNaOHで7.3にpHを調整する。 </li></ol> 2副腎の分離<ol><li>大小の解剖ハサミとピンセットの2組のペアをオートクレーブ。全体のプロセスの間に手袋を着用し、氷のバケツに解剖トレイを置きます。 </li><li>日0-3で取られたマウスを使用してください。断頭続いて加圧CO 2タンクで動物を安楽死させる。 </li><li>チェルビから背骨以下の子犬の背中を削減するハサミの小さいセットを活用<html>尾側領域にcalは。皮膚の下に表面的に切断され、体腔内に刺していないようにしてください。 </li><li>離れて背骨から次に、剥離皮膚筋系は脊柱の明確な見解を持って露出するように。ここから、頸髄でtransectionalカットを行い、その後、背骨の両側に沿って2つの平行カットを行う。 </li><li>動物の本体を保持する鉗子の一組では、脊柱をつかみ、腎臓が露出するまで、背骨をバック剥離する鉗子の他のペアを使用しています。 </li><li>このとき、腎臓の上に副腎を可視化。その後、慎重にロックの溶液を充填したコニカルチューブに各動物から2腺を配置します。 注：たまに腺が鉗子に固執します。この場合は、静かに鉗子からロックの溶液に腺の除去を助けるために鉗子の別のペアを使用する。腺は、最大2時間この状態に保つことができる。 </li></ol>E &quot;&gt; 3。組織消化<ol><li>一方、気泡使用前に15分間、5％CO 2 + 95％のO 2との酵素溶液。平衡化したソリューションは、ピンクがかった/オレンジ色に鮮やかなピンク色の電源が入るか確認します。 </li><li> 20〜25単位/ mlの最終濃度で新鮮に泡立て酵素液にパパインを追加します。パパイン酵素溶液中、37℃で40〜60分間、各動物から腺の各ペアをインキュベートする。 </li><li>各チューブに不活性化溶液の75％を加え、さらに10分間37℃でインキュベートする。このインキュベーションは、パパインの酵素活性を不活性化する。 </li><li>不活性化溶液で10分間インキュベーションした後、穏やかに新たに標識されたチューブに腺を転送して腺を培養培地で3回洗浄する。 </li></ol> 4。細胞解離とめっき<ol><li>洗浄後、培養培地を200μlに2腺を配置し、 静かに腺を滴定し、ダウン200μlのピペットを用いてピペットチップを通して組織の大部分が溶液中にもはや存在するまで。 NOTE：滴定すると、200μlのピペットの先端から下向きの力でチューブの底腺を維持し、穏やかにゆっくりと組織に係合する。高速または突然のピペッティング決して遅く、連続ストロークを使用するように注意してください。 </li><li> 450μlの最大の培地の全量を、追加の250μlの培養培地を追加します。 </li><li>プレートを60×15mmの培養皿に入れ、7つ12ミリメートルPDLプレコーティングしたカバースリップを、それぞれ上にこの細胞を含む溶液の60μlの。 </li><li>一度メッキ、細胞生存率のための環境を確保するために30分間、5％CO 2の定常流/供給しながら37℃に設定され、維持さインキュベーターに皿を置く。インキュベーションの後、静かに培養皿に予め温め培地の5ミリリットルを追加し、24時間インキュベーターに戻し、皿を返す細胞アタッシュケースの前にD録音。 注：典型的には、細胞は、最大4日間、電気生理学的記録のために使用することができる。 </li></ol> 5。細胞の同定およびギガオームシール形成<ol><li>細胞外液中に12mmのカバーガラスを配置します。全体副腎が細胞調製のために使用されるので、ベージュ/茶色がかったカラーリングと皮質細胞（細胞をクロム親和よりも小さく、調光器）と、培養中の近くの円形のフォーム（ 図1）と非常に明るいクロム親和細胞（通常はを混ぜる。 </li><li>プログラム可能なP-97プラーを使用して、4つの段階でパッチピペットを引き出します。 「ブローアウェイ」をするためにこのワックスをピペットチップの内部から先端をガラスの容量を低減するのに役立ち、その後火ポリッシュれる、溶けたロウにピペットチップを浸し。 NOTE：パッチピペット溶液で満たされたときに、パッチピペットは、典型的には約2MΩの抵抗を有する。 </li><li>数m内の細胞に近いパッチピペットアプローチicrons。セルに接続された構成を実現するには、セルに近いパッチピペットのアプローチの間にわずかな細胞変形を探します。 GΩシールが達成されるまで、穏やかな吸引を適用します。 </li></ol> 6セル接続型静電容量録音<ol><li> GΩシールが明らかにされると、EPC-7プラスパッチクランプアンプと二相のアナログロックインアンプ（機器の添付の表を参照）を使用することにより、セルに接続された録音を行う。 50 mVの（実効値）の振幅とロックインアンプから20kHzの周波数で正弦波を適用します。 </li><li> 1ミリ秒の時定数と24デシベルで、ロックインアンプの出力フィルタを設定してください。ロックインアンプなどの穏やかな吸引パルスによって生成される過渡的な静電容量の変化のみパッチコンダクタンス（再）トレースになし投影とパッチ容量（イム）トレースに表示されている（ 図2）の位相を設定します。 注：再、システムのキャリブレーションの詳細をご覧下さいference 19。 </li><li> 「下」の手順（ 図3）によって、一般的な静電容量の変化を識別します。 注：固体記録は、単一の小胞を内在化を示している多くの下向きの手順で「階段」タイプの似ている、と見ることになります。動作電流は典型的には、ほとんどの細胞から記録することができるので、パッチ適用プロセスは、機械的刺激として働く。 </li><li>そのファイル内の/月/年、自身の個別の番号（XX）として、各セルに接続された記録：個別の日を含むフォルダなど、ファイルに名前を付けます。 </li></ol>

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	<li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca++-triggered+exocytosis.">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li><li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion.">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li><li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore.">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules,+measured+in+the+cell-attached+configuration.">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li><li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel.">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li><li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+amperometry:+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release.">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li><li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells.">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li><li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na++influx+through+the+fusion+pore.">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li><li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells.">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis.">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li><li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2++dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis.">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li><li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal.">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li><li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses.">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li><li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations.">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li><li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells.">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li><li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+inhibition+of+endocytosis:+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G(z).">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li><li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles.">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

セルに接続された静電容量測定に成功し、高品質での録音を得るためには、いくつかの重要なステップが必要です：副腎から調製1）生存し、健康な細胞;カバースリップの2）、PDLコーティング; 3）ギガオームシール形成; 4）システムのノイズレベル;および5）位相補正。 動物を手術のために、一つは、潜在的な修正は、最も適した器用に外科的アプローチを調整し、解剖時の損傷を防止することである。電気生理学的記録のために利用される細胞は、副腎髄質からのみ来るように加えて、検索および副腎の除去に十分な練習が不可欠です。酵素消化のためには、5％のCO 2 + 95％O 2で溶液をバブリングして酵素溶液を平衡化することが重要である。シリンダに接続チューブは漏れで十分とタイトであることを確信すること。また、必ずその目的の私n個の溶液を適切に全体の15分バブリング時間の間に置かれる。これは、適切に空気流を向けるようにチューブの端部で平滑化された20 G針先端を配置することで達成することができる。また、このステップの追加の時間があれば、空気の流れがチューブ内の溶液をオーバーフローするほど強力ではありませんように傷つけることはありません。細胞の滴定は練習が必要になるもう一つの重要なコンポーネントです。過剰滴定した場合に細胞の大部分が損傷する可能性があります。滴定が十分でない場合には逆に、組織から解離した非常に少数の単離された細胞が存在することになる。効果的に滴定するには、滴定などの腺が優しく200μlのピペットチップを通過することを確認しながら、上下7-8xアップピペット200μlのピペットチップを利用して。 PDLコーティングのために、人は常にカバースリップの十分なコーティングを確実にするために、3時間までのカバーガラス上で、PDLのインキュベーション時間を延長することができます。クロマフィン細胞が付着するのPDLコーティングは非常に重要ですへと細胞播種後にカバーガラス上で成長する。 PDLコーティングが十分でない場合、細胞のほとんどは、ギガオームのシール形成が困難になり、カバースリップ、から離脱される。 パッチ技術は、専用のプロセスであるように細胞に付着した記録は、常に、変更、改良することができる。ジェントルと微妙な吸引がパッチピペットと細胞が接触している場合ギガオームのシール形成を促進する上で重要である。あまりにも多くの吸引は、パッチチップ - 細胞接触を破壊し、極端な状況では、細胞は、パッチピペット内に吸引することができる。これは非常に簡単に全細胞構成に変化させることによって、または非常に大きなものに戻す非常に最小限の抵抗によって、オシロスコープ上で観察される。実際には、高品質ギガオームのシール形成を得るために最も重要である。 高いシール抵抗がセル添付録音におけるノイズレベルを最小限に抑えるために重要であるが、以下の2つのステップでもある単一のエンドサイトーシスイベントを解決するために、ノイズレベルを低減することが重要：（1）パッチピペット溶液では、TEACLは、電位依存性K +チャンネルを遮断するために利用される。 （2）ピペットチップは、粘着性のワックスでコーティングされ、ピペットチップ内部のワックスは耐熱研磨によって除去することができる。 プロトコルステップ6.2に詳述された位相調整が記録のための初期段階を設定することが重要ですが、このステップは理想的ではないかもしれない。したがって、個別のイベントの核分裂細孔分析の間に位相補正を行うことが重要である。 -65 mV程度の静止膜電位で、ホールセル記録は、典型的なマウス髄質細胞として、マウス髄質細胞の膜コンダクタンス〜を計算5pFの入力容量と500MΩの入力抵抗を有することを示す0.4 PS / fFと。これは1 FFの容量サイズのエンドサイトーシスのイベントは〜0.4 psのの膜コンダクタンスの純損失につながることを意味します。この値は、ATに比べて無視できるセルに接続された記録の中に、エンドサイトーシス核分裂気孔の閉鎖に関連したypical 50-100 psの膜コンダクタンスが変化。そこで、私たちの位相補正は、私たちはそのような前後の核分裂気孔の閉鎖が同じレベルであることを、膜コンダクタンスのベースラインを調整することができていることを確信しています。このプロセスは、私たちのデータ分析に&lt;1％の誤差をもたらすことができる。 要約すると、ここに記載されるプロトコルは、細胞付着した静電容量の記録は、モデル系としてマウス髄質細胞を用いて、単一小胞エンドサイトーシスをモニターするために利用することができる方法を示しています。この技術は1つが、エンドサイトーシスの間に小胞分裂のための調節機構を分析することができます。

シナプス伝達は、神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって媒介され、これらの小胞は、長期的にはニューロンの通信を維持する神経末端内のローカルエンドサイトーシスのリサイクルを受けなければならない。脳内のシナプス伝達の重要な役割を考えると、シナプス小胞サイクルを構成している分子機構を理解することは、全体としてセルラ通信でより良い理解に向けて不可欠な基盤である。細胞モデル系の中では、副腎髄質細胞は、シナプス小胞のリサイクルの根底にある分子機構に最も決定的な洞察のいくつかを提供してきました。エキソサイトーシス、神経伝達物質放出の最終段階は、非常に学び、副腎クロマフィン細胞1,2を使用することによって検討されている。実際には、分泌顆粒の形成、ターゲティング、ドッキングおよび融合を調整する分子の選手のほとんどが原因のdivの適用に同定されているクロマフィン細胞1におけるERSEテクニック。さらに、エキソサイトーシスに関与するタンパク質合成機構の単一小胞の解決を可能にする機会を提供することにより、クロム親和性細胞は、小胞融合3の問題に対処するための強力なモデルのままです。 細胞結合型の静電容量の測定は、第3エキソサイトーシスの間に単一小胞の融合を解決に利用した。直径60nmのセル接続構成4-7のパッチクランプ技術を用いて細胞膜アドミタンス測定によって検出されることが実証されている〜と小さい小胞のエキソサイトーシス。アドミタンスは、回路またはデバイスは、電流が流れることを可能にする方法を簡単の尺度として定義される。それは、インピーダンスの逆数である。このように、アドミタンス測定値は、膜キャパシタンスの理解を提供する。これは、原形質膜への小胞の膜を組み込むことによって達成される。この取り込みは、表面の変化を明らかにエリア8。各融合する小胞は、膜キャパシタンス9,10段階的増加を引き起こす。また、このアドミタンス測定は、膜コンダクタンスとエキソサイトーシス事象3時の融合孔コンダクタンスを提供しています。この技術は、エキソサイトーシスの間に単一小胞の動態を同定することをユニークなツールを提供してきたように、私たちの研究室は最近、単一の小胞11,12のエンドサイトーシスを検出するために、この概念を適用しております。 私たちの具体的な関心は、多くの細胞の基本的なハウスキーピング部品13として、および神経端子14,15におけるシナプス小胞エンドサイトーシスのための主要な経路と考えられてきたクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、である。 CMEは、生物学的に重要であることが知られているが、その動態は、単数エンドサイトーシスイベントを監視する技術的な制限のためによく理解されていないままである。マフィン細胞と神経細胞1との間のエキソサイトーシスの機構の類似性を考えると、PLはクロマフィン細胞での分裂メカニズムはおそらくニューロンにシナプス小胞エンドサイトーシスに適用することができることがausible。細胞結合型の静電容量の測定は、個別のエンドサイトーシスイベントを監視し、ほとんどの方法は、解決できない核分裂反応速度を分析するために利用されてきた。私達のセルに接続された記録では、20kHzの正弦波は、保持電位上に重畳され、出力電流は、二相ロックインアンプから他のチャネルでのチャネル及び膜キャパシタンスに膜コンダクタンスに分離される16 18。膜コンダクタンスと静電容量の変化から、人はおそらく小胞ピンチオフする前に細胞膜に内在化小胞をつなぐ管状膜ネックに対応核分裂細孔の動態を計算することができます。総称して、この技術は私たちにCMEの中に小胞分裂の調節メカニズムを検討する機会を与えてくれます。

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Keep out of UV</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Carolina Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulin-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>Only thaw on ICE!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus patch amplifier</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 data acquisition board</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor data acquisition software</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Outer diameter: 1.5 mm&lt;br /&gt;
Inner diameter: 1.10 mm&lt;br/&gt;
Length: 10 cm</td></tr></tbody></table>

methods for cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

細胞生存率およびギガオームのシールの質は、細胞結合型静電容量記録の品質を決定する上で重要である。したがって、前の電気生理学的記録に効果的かつ効率的な細胞培養を調達することが重要であり、典型的な生細胞は、 図1に示されている。練習時間が高品質でギガオームのシールを達成するのに役立つであろう。プロトコルステップ5.3で説明したようにパッチピペットが細胞に近づいたときに一つは、明らかに、細胞の変形を見ることができれば、高品質のシールを得るための良いチャンスがある。 図3は、関連する複数の下向きステップで膜キャパシタンスの典型的な記録を実証単一小胞エンドサイトーシス。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig1highres.jpg" /> 実行可能なマウスの副腎髄質細胞の図1の例細胞培養24時間後。3の生クロマフィン細胞に矢印ポイント。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52024/52024fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig2highres.jpg" /> セルに接続された記録の中で、図2の位相調整。初期位相設定では、穏やかなを吸引過渡の両方の容量（イム）の変化とコンダクタンス（Re）が痕跡を引き起こし、再トレースで投影が23°の位相で相殺されているシフトします。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52024/52024fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig3highres.jpg" /> 図3典型的なC単一小胞エンドサイトーシスに関連する複数の下向きのステップで録音のエル·添付容量。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52024/52024fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  University of Illinois at Chicago. After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

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Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex.  The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting. This protocol illustrates the method used to dissect the adrenals and then isolate the medullary region by stripping away the adrenal cortex. The digestion of the medulla into single chromaffin cells is then demonstrated.

マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

Adrenal medullary chromaffin cell culture systems are extremely useful for the study of excitation-secretion coupling in an in vitro setting.  This ...

生物学

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

神経科学

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

免疫・感染学

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity and the amount of neurotransmitter released from vesicles in single exocytosis events. It has been suggested that the reduction in neurotransmitters expelled is due to alterations in membrane biophysical properties when cells shrink in response to osmotic stress and with assumptions made that secretory vesicles in the cell cytoplasm are not affected by extracellular osmotic stress. Amperometry recording of exocytosis monitors what is released from cells the moment a vesicle fuses with the plasma membrane, but does not provide information on the vesicle content before the vesicle fusion is triggered. Therefore, by combining amperometry recording with other complementary analytical methods that are capable of characterizing the secretory vesicles before exocytosis at cells is triggered offers a broader overview for examining how secretory vesicles and the exocytosis process are affected by osmotic shock. We here describe how complementing amperometry recording with intracellular electrochemical cytometry and transmission electron microscopy (TEM) imaging can be used to characterize alterations in secretory vesicles size and neurotransmitter content at chromaffin cells in relation to exocytosis activity before and after exposure to osmotic stress. By linking the quantitative information gained from experiments using all three analytical methods, conclusions were previously made that secretory vesicles respond to extracellular osmotic stress by shrinking in size and reducing the vesicle quantal size to maintain a constant vesicle neurotransmitter concentration. Hence, this gives some clarification regarding why vesicles, in response to osmotic stress, reduce the amount neurotransmitters released during exocytosis release. The amperometric recordings here indicate this is a reversible process and that vesicle after osmotic shock are refilled with neurotransmitters when placed cells are reverted into an isotonic environment.

Osmotic stress affects exocytosis and the amount of neurotransmitter released during this process. We demonstrate how combining electrochemical methods together with transmission electron microscopy can be used to study the effect of extracellular osmotic pressure on exocytosis activity, vesicle quantal size, and the amount of neurotransmitter released during exocytosis.

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal microscopy was used in combination with patch-clamp recording to detect three fusion modes in primary culture bovine adrenal chromaffin cells. The three fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving shrinkage of the fusion-generated &#937;-shape profile until it merges completely at the plasma membrane.
To detect these fusion modes, the plasma membrane was labeled by overexpressing mNeonGreen attached with the PH domain of phospholipase C &#948; (PH-mNG), which binds to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) at the cytosol-facing leaflet of the plasma membrane; vesicles were loaded with the fluorescent false neurotransmitter FFN511 to detect vesicular content release; and Atto 655 was included in the bath solution to detect fusion pore closure. These three fluorescent probes were imaged simultaneously at ~20-90 ms per frame in live chromaffin cells to detect fusion pore opening, content release, fusion pore closure, and fusing vesicle size changes. The analysis method is described to distinguish three fusion modes from these fluorescence measurements. The method described here can, in principle, apply to many secretory cells beyond chromaffin cells.

This protocol describes a confocal imaging technique to detect three fusion modes in bovine adrenal chromaffin cells. These fusion modes include 1) close-fusion (also called kiss-and-run), involving fusion pore opening and closure, 2) stay-fusion, involving fusion pore opening and maintaining the opened pore, and 3) shrink-fusion, involving fused vesicle shrinkage.

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

要約

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マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

パッチクランプキャパシタンス測定とCa^{2 +イメージング}

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

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パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

パッチクランプキャパシタンス測定とCa^{2 +イメージング}