Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

sRANKL MC DNAの1。流体力学的送達<ol><li>マウス尾静脈を介して流体力学的送達<ol><li>尾静脈注射の前に、マウスを秤量する。リンゲル液中の希釈sRANKL又は緑色蛍光タンパク質（GFP）MC（37℃で予備加温）マウスの体重の約10％の総体積。 </li><li>血管を拡張し、横方向の静脈LVS（）が表示されるようにするために、注射の前に10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。 </li><li>とすぐのLVが拡張したと表示されているように、制止にマウスを移動し、動きを拘束するバレルに十分プラグを挿入します。このような呼吸などの正常な活動のためのマウスを監視します。必要に応じて、拘束具のプラグを調整します。 </li><li>拭いてアルコールで尾の先端から注入領域3月4日を消毒。マウス尾静脈注射用の27〜30 Gの針を使用してください。片手でしっかりと尾を持ち、針を挿入尾静脈へ。注射器に圧力を適用し、5〜7秒以内に注入を完了します。 </li><li>尾静脈から針を外し、出血を止めるために注射部位にコットンボールに圧力をかける。呼吸数は、通常の速度に低下した後、バックビバリウムにマウスを移動して、15〜30分間マウスを監視します。 </li></ol></li><li>マウス血清TRACP5bはポスト遺伝子導入の全身マウスsRANKLの発現および定量の確認<ol><li>血管を拡張と論理ボリュームが見えるようにするために5〜10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。 </li><li>尾の先端からサイト1項のマウスの尾の刃で小さな切開を行います。 </li><li>血清分離チューブ内の血液の約100μLを収集します。 </li><li> 30分間室温で血清分離管をインキュベートする。 </li><li> 5分間万×gで遠心分離サンプルと血清を収集します。 STORさらなる分析のために-80℃でのE血清。 </li><li>市販のキットを用いて血清サンプルにsRANKL ELISAおよびマウス血清TRACP5bはアッセイを行う。 </li></ol></li></ol> 2マウス BMMSからin vitro破骨細胞世代で <ol><li> BMMSの単離​​と培養<ol><li>脛骨および大腿骨の骨の単離：CO 2をドナーマウスを安楽死させると、70％エタノールで足を消毒。無傷で大腿骨と脛骨の骨を除去するために、踵骨の骨に恥骨から解剖。 </li><li>骨を損傷することなく、慎重に皮膚や筋肉を取り外します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有するペトリ皿に処理し、大腿骨と脛骨を置く。 </li><li>骨髄の除去：1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するα-MEMを装填し、大腿骨と脛骨の骨の一方の側に先端をカットし、25 G針を1ミリリットル注射器を用いて50ミリリットルチューブに骨髄を洗い流す（破骨細胞培養培地/ OCM）。 </li><lI&gt;プロセス骨髄：70ミクロンのナイロンセルストレーナーを通過させることにより、新しい50ミリリットルチューブに骨髄懸濁物を混合し、転送します。 300×gで遠心細胞及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％FBS（破骨細胞培養培地/ OCM（+））を含有するα-MEM中に再懸濁する。 </li></ol></li><li>マクロファージの文化<ol><li>血球計または自動セルカウンターを用いて細胞を数える。 </li><li>プレート6ウェルプレート、ウェルあたり1×10 6個の細胞または96ウェルプレートに入れ、ガラス製カバースリップ（5mm）を又は象牙質切片に3×10 5個の細胞を、37℃でインキュベートする。 </li><li>吸引物のすべてのメディアは、非接着細胞を含有し、48時間、25 ng / mlのマウスM-CSFを含有する新鮮なOCM（+）37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>吸引物は、すべてのメディアと新鮮なOCM（+）メディアは、破骨細胞形成を開始する25 ng / mlのマウスのM-CSF、および30 ng / mLのマウスsRANKLを含む、37℃で細胞を培養する。必要に応じて、3日おきにメディアを補充する。 </li><li>細胞を育てる約6〜8日間、骨を再吸収することのできる巨大な多核細胞を形成する。とすぐに多核細胞が出現するように、市販のキットを用いて染色し、TRAP（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を行い、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行う。ファロイジン染色および画像先に説明したように19、走査電子顕微鏡（SEM）によってスライスを象牙質に付着細胞を使用してカバースリップ上でF-アクチンを可視化リング。 </li></ol></li></ol>ヒトPBMCから3。 インビトロ破骨細胞の生成<ol><li>ヒトPBMCを単離<ol><li> 50ミリリットルチューブに予め温めヒスト-1077の10ミリリットルを追加します。 </li><li>空の白血球フィルターは50mlのチューブ（PBSで血液を1:1の比）中に滅菌PBSで血液バンクから得た。血がヒストと混合しないことを確認しながら、非常にゆっくりとヒストソリューションより希釈した血液をレイヤー。 </li><li> 18℃で20分間1000×gで遠心分離サンプルフォロー遠心ING、慎重に白血球および新しい50mlチューブへの転送を含む白色バフィーコート層を単離する。 </li><li>細胞を回収し、5分間650×gで再度遠心PBSで細胞を希釈する。 </li><li>メディアや細胞カウンターを用いて細胞を数える - （）OCMで上清と再懸濁細胞を除去する。 </li></ol></li><li>メッキおよび培養したPBMC <ol><li> OCMにおける細胞（+）培地およびプレート8×10 6細胞/ ml当たり6ウェルプレートまたは1×10 6細胞/ ml当たりに96ウェルプレートにウェル再懸濁する。免疫蛍光イメージングのため、ならびに骨吸収アッセイに適した骨切片上のカバーガラス（5mm）をプレート上の細胞を、必要に応じて以前に20に記載のように。 </li><li> 2〜3日毎に又は必要に応じてヒトM-CSFで細胞を補充変化培養培地。その後、OCMにおける25 ng / mlのヒトM-CSF（+）と一緒に、人間のsRANKLの30 ng / mlのを追加して5日目の分化のステップに進んでosteoclastogenesを開始するメディアです。 </li><li>巨大多核細胞を形成するために約14〜21日間、細胞を増殖させる。できるだけ早く多核細胞が出現ように、これらの細胞は次いで、TRAPのために標識することができ、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行うことができる。 F-アクチンリングはファロイジン染色を用いてカバーガラス上で可視化することができる。細胞形態は、SEMにより象牙質切片に付着した細胞において試験することができる。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

筋骨格条件は、罹患率と障害の原因をリードしているし、150以上の疾患や症候群で構成されます。今日は約90万人のアメリカ人に影響を与える。関節の炎症や骨の破壊性関節炎や骨粗しょう症などの筋骨格症状の主な機能です。骨粗しょう症は、多くの場合、骨の骨折につながる骨の整合性を弱める条件である。関節炎は腫れ、圧痛およびスティッフ制限通常の移動となり、障害につながることができ、関節の炎症を特徴とする慢性、衰弱させる病気です。筋骨格疾患の病因が大幅に互いに異なるが、骨破壊は、包括的な一般的な機能です。筋骨格状態における骨破壊は、主に、骨吸収と骨形成21,22との間の不均衡によって引き起こされる。一つの治療アプローチは、骨を破壊するこれらの細胞の能力を阻止しようとすることです<s&gt; 23まで。ここで説明する技術および手順は、in vivoおよびin vitroの両方の破骨細胞の研究を可能にする。 ここで説明するin vivoモデルも導入遺伝子キャリア24として機能し、細菌の鎖から解放された小さなエピソームDNAベクター（〜4キロバイト）、アールミニサークルを使用しています。ミニサークルは数ヶ月まで安定した表情で、通常の細菌プラスミド、その後10〜1,000倍高い導入遺伝子を発現する。ミニサークルの小さい分子サイズは、より効率的なトランスフェクション率とかなりの発現が正常細菌プラスミド24と比較するために貢献しています。したがって、ミニサークルは、現在広く前臨床遺伝子導入研究25,26で適用される。流体力学的送達は、マウスの全身へのプラスミドDNAを提供するために毛細血管内の流体力学的圧力に基づいて十分に開発された手法である。マウスにおける尾静脈注射を介して肝細胞への流体力学的遺伝子送達は、十分に確立さtとOプラスミドDNA 6で導入遺伝子を発現する。これらの研究において、 インビボのマウスモデルにおいてマウスsRANKLを過剰発現は、sRANKL MCおよび尾静脈注射を介して流体力学的送達により達成される。マウスsRANKL ELISAは、マウスにおいてRANKLの血清レベルを検出するために使用することができる。マウス血清TRACP5bは、骨吸収マーカー27の有意な上昇はsRANKL遺伝子導入マウスで観察される。特に、この技術は、sRANKLの過剰発現に限定されるものではない。それはまた、他の分泌タンパク質28を過剰発現するように適用することができる。この手順の主な技術的な難しさは、尾静脈から流体力学的送達である。別に、通常の尾静脈注射から、流体力学的送達は5-7秒以内にマウスに生理的溶液を大量にミニサークルの配信を必要とします。このため、安定したハンドリングと注入技術は、この手順で成功するために不可欠です。 sRANKLトランスジェニックマウスを作製することは、生体内 osteocのための別のアプローチであるlastogenesis。しかしながら、sRANKL高レベルの胚致死4をもたらすことができるトランスジェニックマウスを作製することは、高価で時間がかかる。 OVXげっ歯類モデルにおいて、炎症、例えばTNF、IL-1およびIL-6などのサイトカインおよび非炎症性サイトカインsRANKLの両方がインビボ破骨細胞形成および骨喪失に寄与する。 sRANKL遺伝子導入モデルでは、非炎症性サイトカインsRANKLの過剰発現をもたらす。したがって、ここで説明sRANKLの遺伝子導入モデルでは、研究者に炎症がない状態で骨リモデリングにおけるRANKL-RANK軸の寄与を調べるための強力なツールを提供しています。 共培養骨髄細胞と骨芽細胞が関与in vitroで破骨細胞培養法は、前後半に1990年の29,30におけるRANKLの発見に、1980年代後半に設立されました。組換えM-CSFおよびRANKLが破骨細胞の分化を誘導し、効率的in vitroでの AND方法は、以前に他の研究3,31に記載されている。 M-CSFは、初期の破骨細胞前駆体32におけるRANK発現を刺激し、破骨細胞前駆体および成熟破骨細胞33のための生存因子として作用することが知られている。 RANKLは、破骨細胞の分化および活性化3に不可欠である。ここでは、 インビトロで破骨細胞形成する方法が記載されている。破骨細胞への正常な培養および前駆細胞の分化は、無菌の細胞の単離と適切なめっき技術だけでなく、タイミング細胞採取の慎重な理解が必要になります。破骨細胞分化は、破骨細胞前駆細胞の融合34を必要とし、破骨細胞前駆細胞の不十分な数が破骨細胞への前駆細胞の融合および分化を促進しないので、セルの計算されたメッキが重要である。同様に、破骨細胞前駆細胞の過剰な数は、形成および最終的な細胞死を凝集をもたらす。非の除去細胞を播種した後、接着細胞を2時間、最適な細胞数を維持するのに役立ちます。破骨細胞は、約48時間35の寿命と最終分化短命細胞であるように最後に、細胞採取の時間が非常に重要です。このように、細胞は多核細胞の最初の観測後48時間以内に採取しなければならない。次いで、これらの細胞は、TRAPを特徴とすることができ、免疫組織化学および骨吸収活性によってF-アクチン染色は、走査電子顕微鏡（SEM）によって検出することができる。これらの実験的アプローチは、それらの表現型と機能的に破骨細胞の明確な定義を可能にする。 インビボおよびここで説明するインビトロ技術における世界的な骨粗しょう症や関節リウマチの患者数百万人のための有効な治療戦略につながる、現在前臨床試験において、破骨細胞阻害剤の開発が容易になります。

筋骨格系疾患は、米国および国や地域の保健システムの1のために存在深刻な結果に何百万人もの人々に影響を与えます。これらの疾患は、骨の損失および広範な治療および回復の長い期間を必要とする関節機能によって特徴付けられる。一般に、数および/ ​​または骨粗鬆症および関節炎では、骨を吸収する破骨細胞特化し、細胞の活性の相対的増加が観察される2。生理学的条件下で破骨細胞の数および活性は、骨芽細胞により産生される核因子κ-Bリガンド（RANKL）の受容体活性化によって調節される。オステオプロテゲリン（OPG）、RANKLのためのデコイ受容体はまた、骨芽3によって生成される全身sRANKLの過剰発現、又はOPGの欠失を含むインビボ動物モデルは、骨粗しょう症の研究に非常に有用である。;しかしながら、これらの方法は、トランスジェニックマウス、4,5の発生を必要とする。ここでは、新たな代替筋骨格関連疾患の研究のためのsRANKLを過剰発現させる方法が記載されている。具体的には、ミニサークル（MC）DNA技術および流体力学的送達方法は、インビボで sRANKLの遺伝子導入を達成し、全身6マウスsRANKLを過剰発現するために使用した。 この方法はまた、低カルシウム食8により卵巣切除7および食事介入後の破骨細胞のホルモンの変調のような骨粗鬆症の他のin vivoモデルに対して相補的である。これらのモデルは、しかし、彼らは外科手術を必要とし、大幅なコスト9で、数ヶ月かかることがあり筋骨格関連障害のさまざまな側面を研究することは非常に便利です。卵巣摘出（OVX）げっ歯類モデルは卵巣の除去は、それによって人間の閉経後骨粗しょう症10を模倣するエストロゲン欠乏につながる実験動物モデルである。人間の閉経後骨粗しょう症、条件エストロゲン欠乏症encyは骨折のリスクの増加につながり、骨粗しょう症は、米国だけで約8万人の女性に影響を与えます。 OVXモデルは、閉経後の骨粗しょう症のために有用であるが、それは一般的に骨粗しょう症の研究に限定された利点を提供しています。エストロゲンは、したがって、その非存在下で破骨細胞活性の増加が観察される10〜12、破骨細胞を誘導し、骨芽細胞のアポトーシスを阻害することによって、骨損失を抑制する。骨吸収に有利RANKL-OPG比の不均衡13も観察される。しかしながら、 インビボでのエストロゲン欠乏はまた、を伴う成長因子β（TGFのβ）のレベルを減少させ、インターロイキン-7（IL-7）、TNF、IL-1およびIL-6 14,15が増加した。これらのサイトカインは、RANKL経路の骨リモデリングの調節機能が独立した知っていたとして、それは単に、RANKL-RANK軸に任意の破骨細胞活性化を帰属させることは不可能である。このホワイトペーパーで説明されたモデルは、VIVに留学する研究者を可能にしますO前炎症性サイトカインのない破骨細胞形成および骨量の減少におけるRANKL-RANK軸は、OVX齧歯類モデルと比較。 また、in vitroでの破骨細胞形成技術は、筋骨格疾患の潜在的な治療的処置のために、破骨細胞の活性化を研究するために不可欠なツールです。以前の研究は、マウスのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）でマウス骨髄由来マクロファージ（BMMS）を培養し、マウスsRANKLが破骨細胞分化3,16,17につながることが示されている。ここで、マウスの骨髄から、ならびにインビトロ18ヒト末梢血単核細胞（PBMC）からの多核破骨細胞様細胞を生成するためのプロトコルが記載されている。成熟した終末分化して完全に機能する破骨細胞を定義するために必要な、細胞ベースのアッセイも簡単に説明している。これらのインビトロ技術は、生体内のアプローチで小説を補完し、一緒にPとして機能owerful調査ツールは、破骨細胞の分化および活性化を研究する。これらのシステムを使用して、科学者は、 インビボおよびインビトロで破骨細胞を生成し、それらの増殖および活性化に必要な刺激および信号を定義するだけでなく、薬理学的および生物学的阻害剤の有効性を試験することができる。

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&amp;nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

ここで、破骨細胞形成に対するサイトカインの効果を研究するための方法として、in vitroで破骨細胞への前駆細胞を分化するためのインビボおよび細胞培養プロトコルにおける破骨細胞の分化のための新規な遺伝子導入技術が記載されている。 図1では、マウスにおけるGFPおよびマウスsRANKL MCの成功した遺伝子導入の代表的な結果を示す。 図2において、マウス骨髄または明視野顕微鏡による破骨細胞への前駆細胞のヒトPBMC細胞分化経時培養物の代表的な画像が示されている。 図3、マウス骨髄由来の破骨細胞を特徴付けるための3つの独立した方法からの代表的な画像が示されている。マウスsRANKLの存在は、TRAPの発現（ 図3AおよびB）およびF-アクチンリング（ 図3CおよびD）の形成を活性化する。電気をスキャンするトロン顕微鏡（SEM）は、マウスsRANKL骨（ 図3EおよびF）を再吸収することが可能な巨大細胞の形成を誘導することが明らかになった。 図4に、ヒトPBMC由来の破骨細胞の同じ特徴付け方法が示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig1highres.jpg" width="500" /> 図1 sRANKL インビボ遺伝子転移が増加し、破骨細胞形成をもたらす。A、B）マウス肝臓外植片及びGFP又はsRANKL5μgのを注射した12週齢のC57BL / 6雄マウスのC、D）の全身像の前方ビューMCのDNA。矢印はGFP遺伝子導入マウスにおけるin vivoでの GFP発現を示している。 RANKL遺伝子導入マウスは全くバックグラウンド蛍光として機能する。マエストロ2イメージャ、1日後の遺伝子導入（赤と緑のDで撮影した画像enote背景とそれぞれGFP）、E）プラスミドの1、5で分析血清中のsRANKL MC-DNA構築物とF）sRANKLレベルのマップと11日は、GFPを投稿したり、sRANKL遺伝子導入。G）マウス血清TRACP5bはレベルが11日間に分析GFPまたはsRANKLの遺伝子導入後。スケールバーは、A、Bが5mm、及びC、D.が10mmを示す<img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig2highres.jpg" width="500" /> マウスおよびヒトの細胞培養系の両方における図2 のインビトロ破骨細胞形成。分化を示した25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ng / mlのマウスsRANKLの存在下で骨髄培養から単離されたマウス細胞の明視野顕微鏡法日目のタイムコースA）、2（b））5、およびC）8。単離されたヒト細胞の明視野顕微鏡末梢血および25 ng / mlのヒトM-CSFおよび日Dで分化の時間経過を示す30 ng / mlの人間sRANKL）、4、E）14、およびF）21の存在下で培養から。スケールバーは20μmで示している。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。生成とマウスの破骨細胞の特性骨髄から単離され、Aの存在下で6日間）培養マウス細胞の。TRAP染色（ピンク）25 ng / mlのマウスは、M-CSFまたはB）25 ng / mlのマウスM -CSFおよび30 ngの/ mlのマウスsRANKL。ファロイジン（緑色）および骨髄から単離し、Cの存在下において8日間）25 ng / mlのマウスM-CSF又はD）25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ngのを培養マウス細胞のDAPI（青）染色ファの形成を示す/ mlのマウスsRANKL多核細胞内と接リング。骨髄およびEの存在下において8日間培養した）25 ng / mlのマウスM-CSFまたはF）の形成を示した25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ng / mlのマウスsRANKLから単離されたマウス細胞のSEM顕微鏡写真矢印で示すように骨に吸収領域。スケールバーは、ADで40ミクロ​​ンを示し、E、Fの30ミクロン<img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig4highres.jpg" width="500" /> Aの存在下で15日間培養したPBMCから単離されたヒト細胞）の図4。発生と人間の破骨細胞の特性評価。TRAP染色（ピンク）25 ng / mlのヒトM-CSFまたはB）25 ng / mlのヒトM- CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL。ファロイジン（緑）およびDAPI（青）Cの存在下で19日間培養したPBMCから単離されたヒト細胞の染色） </強い&gt; 25 ng / mlのヒトM-CSFまたはD）多核細胞におけるF-アクチンリングの形成を示した25 ng / mlのヒトM-CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL。 Eの存在下で18日間のPBMC培養から単離されたヒト細胞）のSEM顕微鏡写真は、25 ng / mlのヒトM-CSFまたはF）25 ng / mlのヒトM-CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL吸収体の形成を示す矢印で示すように骨上の領域。スケールバーは、E、FのC、D、15ミクロン、20ミクロン、A、Bが10μmを示す

Watch this Scientific Journal Video about A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders at JoVE.com

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

小説<em&gt; in vivoで</em&gt;遺伝子導入技術と<em&gt; in vitroで</em筋骨格障害における骨損失の検討のための&gt;細胞ベースのアッセイ

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K ビュー.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

ビデオ: A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

発生生物学

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

骨転移モデル

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

医学

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

シーケンシャル<em&gt;インビボ</em&gt;骨折修復中に、骨形成幹細胞/前駆細胞のイメージング

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

合わせた<em&gt;インビボ</em&gt;光とμCTイメージングマウスにおける整形外科インプラント感染で感染症、炎症、および骨解剖学を監視する

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

生物工学

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

免疫・感染学

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

<meta charset="utf8"></head><body>外植片モデルを用いた骨形成のマルチモーダル解析

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous modalities that are currently available for analysis. Here, we propose a workflow for a comprehensive evaluation of new bone formation using a relevant large animal osseous ex vivo explant. A bone defect (diameter = 3.75 mm; depth = 5.0 mm) is created in an explanted sheep femoral head and injected with a macroporous bone substitute loaded with a pro-osteogenic growth factor (bone morphogenetic protein 2 - BMP2). Subsequently, the explant is maintained in culture for a 28-day period, allowing cellular colonization and subsequent bone formation. To evaluate the quality and structure of newly mineralized tissue, the following successive methods are set up: (i) Characterization and high-resolution 3D images of the entire explant using micro-CT, followed by deep learning image analyses to enhance the discrimination of mineralized tissues; (ii) Nano-indentation to determine the mechanical properties of the newly formed tissue; (iii) Histological examinations, such as Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner's trichrome, and Movat's pentachrome to provide a qualitative assessment of mineralized tissue, particularly with regard to the visualization of the osteoid barrier and the presence of bone cells; (iv) Back-scattering scanning electron microscopy (SEM) mapping with internal reference to quantify the degree of mineralization and provide detailed insights into surface morphology, mineral composition, and bone-biomaterial interface; (v) Raman spectroscopy to characterize the molecular composition of the mineralized matrix and to provide insights into the persistence of BMP2 within the cement through the detection of peptide bonds. This multimodal analysis will provide an effective assessment of newly formed bone and comprehensive qualitative and quantitative insights into mineralized tissues. Through the standardization of these protocols, we aim to facilitate interstudy comparisons and improve the validity and reliability of research findings.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:骨再生研究における組織石灰化の特性評価のための高度な技術

The proposed protocol entails a global approach to assess bone formation in the context of bone regeneration using multimodal analyses. It aims to provide qualitative and quantitative information on new bone formation, enhancing the rigor and validity of basic and pre-clinical investigations.

小説

要約

さらに動画を探す

薬物治療と

骨転移モデル

シーケンシャル

合わせた

の応用

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

半自動縦マイクロトモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

小説

要約

さらに動画を探す

薬物治療と

骨転移モデル

シーケンシャル

合わせた

の応用

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

半自動縦マイクロ トモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

半自動縦マイクロトモグラフィーを用いた定量的モデルの構造解析、裸ラット骨粗鬆症による椎体骨折