We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

連邦政府が定める動物の管理と使用ガイドラインに従って - （350gの250）とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校で施設内動物管理使用委員会によって承認された実験的なプロトコルでは、女性のロングEvansラットで行った。 1.ボディ拘束へのラットを順応注：制限食でラットを置きます。拘束（後述）にラットを順応さただちに各毎日の取り扱いセッションの後一日一回のラットを養う。その初期重量の80％で動物を維持するための十分な供給を提供する。この量は、250グラムのメスのロングエバンスラットのための一日あたりの飼料の約6グラムである。 <ol><li>人間によって処理されることにラットを順応さ。ゆっくりと約5秒ごとに30秒の期間の手でラットを拘束。 2日連続で15分間日のためにこれを行います。訓練期間中のストレスの徴候について毎日ラットを監視します。兆候は苦労私を含む拘束、発声、および歯チャタリングn個の応答。 </li><li> 3 日目には、2日連続で15分間、一日のために（ 図1）身体を拘束布靴下にラットを置く。 </li><li> 5日目に、靴下の中にラットを置き、実験的な治具（ 図4）に剛性管の内側に靴下を置く。 2日連続で15分間の日にチューブでラットのままにしておきます。 </li><li>各トレーニングセッションの直後にラットを養う。最後のセッション（6 日目 ）の終わりに、食品への無制限のアクセスを与える。移植のために最後の訓練の日に過度のストレスの兆候を示していないだけで、これらのラットを選択します。 注：注入用ラットの選択は主観的であるが、我々の手で、ラットの90％以上が慣れに応じて、移植を受けることができることが見出された。 </li></ol> 2.録音商工頭部拘束機構を注入<ol><li>再を作るピンコネクタに裸のステンレス鋼線を半田付けすることによりフェレンスワイヤー。 3〜5ミリメ​​ートルは、ピンによって発見されたままであるようにワイヤーをカット。すべての手術のツールと​​一緒に、参照線をオートクレーブ。 </li><li>ケタミン/キシラジン麻酔を管理します。 95ミリグラム/腹腔内に5 mg / kgをキシラジンと混合kgのケタミンを管理します。初期投与量は1.5〜2時間持続する。必要に応じて、すべての30〜45分間、その後、麻酔を補足する。眼軟膏で動物の目に注油。 </li><li>麻酔の平面を決定するために、そのTOE引っ込め反射を確認し、必要に応じて麻酔を維持。 </li><li>耳バー付きの定位保持枠にラットを置きます （ 図3A）。頭の毛を剃るとポビドンヨード（10％溶液）で創傷部位を消毒する。彼らは鼓膜を損傷しないように適切に耳バーを挿入するように注意してください。鈍ヒントを耳バーが好ましい。 </li><li>メスapproxiで切開するmately耳の後ろに目の吻側 - 尾側レベルから頭蓋の正中線に沿って。切開の両側の皮膚2-3 mmのストリップをカットし、削除するにはハサミを使用してください。 </li><li>横方向の尾根に出て頭蓋の表面を露出させる骨膜を削り取る。瞬間接着剤の薄層で暴露頭蓋をカバーしています。 </li><li> ½直径ドリルバリ（ 材料の項を参照）を使用して、0〜80のネジよりもわずかに小さい直径で、小さな穴を開けます。ネジが下よりも横方向のトップで行くことができるように、ブレグマ縫合糸が横尾根を満たしている場所に後方、および30〜45°の角度で頭蓋にすぐに穴を開けます。 </li><li> 30〜45°の角度で、穴（約3回転）に0-80平底小ネジにねじ込みます。基盤となる脳組織の損傷を防ぐために、あまりにも深くでネジしないように注意してください。 </li><li>示した構成にさらに6本のネジに対してこの手順を繰り返し<strong&gt;（ 図3B）。すべてのネジのベースに瞬間接着剤を適用します。 </li><li> stereotaxマニピュレータにおける注射針を配置します。基準マークとして、外部の目的の開頭の場所のブレグマ縫合糸から測定し、近くに針で頭蓋内凹みを作るが、。 注：このデモでは、マークの定位座標は、3ミリメートルの後部とブレグマ縫合に横方向の1ミリメートルである。 </li><li>永久的なマーカーで凹みをマークします。その定位基準点となるように、マークの定位座標を注 （ 図3B）。 </li><li>希望する座標（3ミリメートルの後部と、この例ではブレグマへ横3ミリメートル）を中心に開頭術を行います。無傷の硬膜のままにしておきます。修正された人工脳脊髄液（125ミリモルのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1のCaCl 2、1.3のMgCl 2、pH7.4）中13（ 図3C）との開頭術を覆う。 </li&gt; <li> 4に0.2ミリリットルの遠心管をカット - 長さ5mm、およびキャップを切断。頭蓋上にチューブを置き、開頭の上にセンター。 </li><li>頭蓋にチューブのベースをシールするために、チューブの底を中心に歯科用セメントを適用します。暴露開頭術（ 図3D）にセメントが漏れないように注意してください。 </li><li>反対側の頭蓋プレート内（直径約1/2）別の小さな穴を開け、慎重に参照線を挿入します。ワイヤの端に記録アンプ（ 設備の項を参照）とのインタフェースピンをハンダ付けして基準線を構築します。それが脳に入ると、これは損傷の原因となり、基準線を移動しないでください。 </li><li>ワイヤが挿入された穴に瞬間接着剤を適用します。これは一時的に所定の位置にピンとワイヤーをシールします。 </li><li>ほぼ等しい部分に（ 材料の項を参照）シリコーンゲルキットの2つの部分を混ぜる。混合およびFILのために2分待ちゲルとの完全なL遠心管約⅓。 </li><li>ヘッドレストバーに（ 材料の項を参照）直角ポストクランプを取り付けます。プレートの底を動物の鼻に向かっているように、45°のピッチ角の保持バー（ 図2B）、ヘッドプレート（ 図2A）を取り付ける。これは、実験的な治具（ 図4）と一致するようにピッチ角を設定する傾斜計を使用することが有用である。 </li><li>バーは耳の棒と平行になるようにstereotaxマニピュレータアームに保持バーを取り付けます。プレートは尾最もネジにラムダ縫合糸と前の後部になるようにバーとプレートを下げます。 </li><li>ねじの頭がダウンして、動物の尾の方に向くように、援助の手アームとクランプで約45°の角度で（ 材料の項を参照、8-32スタッドまたはネジ）フロントヘッドボルトをつかみ。それはアリに触れるようネジを下げるerior 0-80ネジ （ 図3F、G）。 </li><li>歯科アクリルのある場所にボルトとプレートを固定します。歯科用骨ネジの頭の周りにアクリル、リファレンス·ピン、および遠心管の側面の周りを適用します。歯科アクリルを乾燥するのに約10分を待ちます （ 図3H）。 </li><li>インプラントに皮膚を接合し、歯科アクリルのエッジの周り歯科用セメントの層を適用します。セメントを乾燥するのを待ちます。 </li><li>遠心管のキャップにいくつかの穴を突く、チューブのキャップを配置します。 </li><li>援助の手クランプを取り外します。その後、慎重にstereotaxからヘッド保持バーを削除してから、バー（ 図3I）からヘッドプレートを取り外します。 </li><li> stereotaxから動物を削除し、術後ケアとモニタリング、該当するすべての規則に従って、規制、法律（ 例えば、ブプレノルフィン0.02 mg / kgを、24の最小ごとに8-12時間を管理する時間）。炎症はインプラントの縁の周りを開発する場合、解決まで毎日患部に抗生物質軟膏の薄い層を適用する。 </li></ol>ニューロンユニットの3 Juxtacellularモニタリング<ol><li>炭酸ガスレーザーマイクロピペットプラー上の石英キャピラリーチューブを引っ張る1μm未満（ 図5A）の先端径を有する（ 機器の項を参照）。 注：加熱パラメータは、特定の機器に応じて変化する、必要なネック径は、関心のある脳構造に依存して変化すること。ラットの視床における記録のために、マイクロピペットは5〜7ミリメートルまでの首を持っている。 </li><li>長作動距離の目標を装備した微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡下で所定の位置にピペットを固定します。顕微鏡のステージ上で所定の位置にピペットを保持するためのモデリング粘土を使用してください。 </li><li> makのに使用されるガラス片;厚さ1cm - ゆっくりガラスブロック（0.5を移動ウルトラミクロトームナイフをると、ピペットチップで視野に）便利です。ステージマイクロマニピュレーターを用いて、そっとガラスにピペットチップに触れ、それを破る原因。ピペットチップ外径が1-3ミクロンの間になるまで、必要に応じて繰り返します （ 図5B、C）。これらのマイクロピペットは、約5〜15MΩ間のインピーダンスを有していることを確認してください。 </li><li>細胞外生理食塩水（135のNaCl、5.4のKCl、1.8のCaCl 2、1mMのMgCl 2、5mMのHEPES、NaOHでpH7.2）で8を準備し、シカゴスカイブルー（w / v）の2％を追加します。 30 G針または小さなシリンジを使用して、溶液をピペットの後端を埋める。あるいは、単一セルjuxtacellular標識のためにシカゴスカイブルーの代わりに生理食塩水に2％（w / v）のNeurobiotinまたはビオチン化デキストランアミン（BDA-3000またはBDA-10000）を追加します。 </li><li>適切な実験治具に剛性チューブの内側の布の靴下の中にラットを置きます （ <stronG&gt;図4）頭部拘束治具に動物を配置する前に、手術後72時間の最小値を.WAIT。気道の閉塞を回避するために、むしろ首よりも、上方の胸骨の周りにドローストリングを締めます。呼吸が苦しいまたは妨げていると思われる場合は、引き紐を緩めるか、後方に移動します。ラットがアラートである間は、この手順を行ってください。 </li><li>ジグの対応ピースにラットにヘッド拘束プレートを取り付けます。これを行うには、最初の場所でヘッド拘束プレートをピンしてから、4-40ネジを使用して固定します。動物が頭に過大なトルクを加えないようにするために穏やかになるまで待つようにしてください。次に、ラットに移植されたヘッド·拘束ボルトに8-32ナットを配置します。その後、ヘッドボルトのねじステンレス製の棒にねじ込みます。それが所定の位置に締め付けることができるような方法で実験的な治具（ 図4）にロッドを固定。 注：ヘッドボルトならびに頭拘束プレート分で動物を保​​護する装置の曲げimizesと記録安定性を向上させる。ほとんどの場合、記録は、動物が頭抑制され、初日に開始することができる。動物が過度にそわそわまたは発声場合は、すべての録音を開始する前に、ヘッド拘束馴化訓練の一日を提供する。この場合は、15分間の治具に動物を残して、そのケージに戻ってそれを配置します。次の日、この手順を繰り返し、プロトコルを続行。 </li><li>記録チャンバーを開き、シリコーンゲルを削除します。組織は開頭で再成長してきた場合には罰金ピンセットを用いて開頭術を清掃してください。 </li><li>電動マイクロマニピュレーターにピペットを取り付け、ヘッドステージ前置増幅器に接続します。 注：本デモンストレーションでは、ヘッドステージに小さなリレー回路は、増幅器のリード線と高いコンプライアンス（ 図6A-C）と外部電流源を切り替えるために使用される。いくつかのアンプが内蔵され、適切な高コンプライアンス源を持っていることに注意してください（ ディスカッション · 材料のセクションを参照してください）。 </li><li>記録チャンバー内定位的に識別マークにピペットの先端を移動するための電動マイクロマニピュレーターを使用してください。この場所の座標を注意してください。頭蓋にピペットの先端を壊さないように注意してください。 </li><li>後部-前方および内外方向の軸で所望の記録位置にピペットを移動します。それが意図された記録場所に約500μmの背側になるまで続いて硬膜を通して腹側にピペットを進める。 </li><li>ピペットチップと基準線との間で記録された増幅された電圧のオーディオモニター上のイベントをスパイクするために聞きながらゆっくりピペットを進める。一度スパイクイベントが識別され、約500μVが観察されているよりも大きな正方向の電圧偏位までピペット0-100ミクロンを移動し続ける。 注記：電極抵抗は、約1.5〜10のwh倍に増加するこれが発生したEN。 </li><li>ユニットは、関心のあるすべての他の行動や生理的な対策とともに、3.11ステップに従ってとして単離されたら録音を開始。現在のデモンストレーションでは、自己生成された感覚毛の動きは（ 材料の項を参照）、高速ビデオ撮影で監視されている。 </li><li>記録サイトにラベルを付けるには、電極は、電流源に接続するためにつながる切り替える。手動で、内蔵アンプの電流源、または（ 図6D、ステップ3.8および考察を参照） -いくつかのリレー回路（C図6A）のいずれかを使用してこれを行う方法がある。通過-4μAを2秒パルスで4分間、50％のデューティサイクルでイオン泳動ピペットを通してシカゴスカイブルーを注入する。 </li><li>標準的な慣行に従って、いくつかの標識方法の後に動物を殺し、灌流。第記録SITの解剖学的位置を特定するために、必要に応じて脳と対比E。 14あたりとしてシトクロム酸化酵素反応のための組織を対比。代替的に、蛍光顕微鏡を用いてシカゴスカイブルー沈着を識別する。 注：正確には、すべてのラベルはラベル間のピペットをアンクランプすることなく、同じ日に同じピペットを用いて作られていることが重要である異なるラベルのユニットを区別するために。この場合、記録部位は（ステップ3.9参照）、各サイトの注目マニピュレータ座標とともに事後​​組織学におけるそれらの相対的な位置によって区別す​​ることができる。明確な同定のために、互いに離れて少なくとも200ミクロン、及び脳領域あたりせいぜい3-5のラベルをラベルをマークします。 </li></ol>

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(Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation).</a> Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

実験的な治具の構築 それは、様々な方法で構築することができるように、実験治具（ 図4）を構築するために使用される機械部品の説明は、プロトコルから省略されている。このデモでは、標準的な光学機械部品とサポートクランプは（ 材料の項を参照）ヘッドレストバーと身体拘束チューブを取り付けるために使用されている。類似の光学機械部品、電動マニピュレーターに電極ホルダを取り付けるために使用することができる。これは、冶具上のヘッドレストバーは、手術中に頭部拘束板を移植するために使用されるバーと同じピッチ角度で取り付けられていることが重要である。電極は、標準的な定位軸に沿って移動させる場合（、その後電極のx軸は、頭部拘束バーに平行に移動する必要があり、地面にラムダとブレグマと平行を含む平面に垂直なz軸<strong&gt;図4）。 適切なアンプと電流源の種類 この実験のために使用することができる商業増幅器および電流源の様々なものがある。 1,000倍の合計利得を達成電流クランプモードでほとんどの細胞外および細胞内電気生理学アンプが適切である。 1-3μmのピペットとのシカゴスカイブルーのイオントフォレーシス用、少なくとも1μAと、少なくとも100 Vの遵守の解像度で10μAを供給することができます電流源が推奨されます。いくつかの商用アンプは持っていることに注意し、適切な内蔵の電流源（ 材料セクションの代替部品を参照）。しかし、適切な複合増幅器/電流源の必要性を回避するために、磁気リレー回路は、増幅器のヘッドステージ（ 図6A - C）の前端部に取り付けることができる。このような回路は、Oであるptionalそれは実験者が物理的に電極を摂動することなく、イオン導入パルスを提供するために、アンプと別個の電流源を切り替えることができます。別のアプローチは、手動で電流源に接続するもので、電極リード線を交換することである。この場合には、ピペットの上部（切れ目のないエンド）で囲みせず、柔軟なリード線（ 図6D）を使用するようにピペットホルダーを使用するのが最適です。 反復練習が必要な場合がありますステップマスターに練習が必要な場合がありますいくつかのステップがあります。ほとんどの器用さを必要とする段階は、ピペットの先端を壊すです。それは、ガラスで、先端の反射を可視化するためにガラスブロックのエッジをペイントすると便利です。先端がかろうじてその反射を満たすまで、1ゆっくりブロックとピペットを進めることができます。マイクロピペットを粉砕し、先端径が大きラーグ作ることができる速すぎピペットまたはブロックを推進eまたは不均一。プロトコールに記載されているように私たちは、石英製のマイクロピペットの使用をお勧めします。マイクロピペットを効果的に曲げたり壊すことなく、慢性的に準備された開頭術で無傷のラットの硬膜を貫通する石英。これは、付加的な合併症を引き起こす可能性が硬膜切除の必要性を排除する。短いテーパ付きホウケイ酸マイクロピペット（&lt;5ミリメートル）も、硬膜を貫通するが、それらの使用は、大脳皮質または線条体の​​ような表面的な構造から記録に制限されています。特に視床や脳幹でより深い構造、からの記録、長いテーパー、好ましくは石英マイクロピペットを必要とします。練習が必要第二段階は、juxtacellular構成でピペットを位置づけている。セルの近くには、膜を破裂させることができたときにあまりにも迅速にピペットを移動する。そのため、先端が推定細胞に近いときに知ってピペットの抵抗を監視すると便利です。少なくとも2倍の膜抵抗の変化は、電極がねであり得ることを示すArまたは細胞膜に触れる。 一般的な落とし穴心に留めてするには、いくつかの一般的な落とし穴があります。ピペットチップは、必ずしも細胞に非常に近いため、最初、それは、ピペットが膜から離れてドリフトした場合、セルを「失う」ことが可能である。セルが攪拌なったり、記録の途中を破裂させることも可能である。それがない場合には、スパイク幅、発火率を増加させることができ、スパイク振幅が低下することがある。これらは、細胞が不健康かもしれ表示である。動物の動きは必然的にこれらのイベントは、録音のある割合で発生する原因となりますが、よく慣れ、不要な、突然の大きな音を作る回避または動物驚愕の振動を引き起こすことによって動物を持っていることによって最小限に抑えることができる。 プロトコルへの潜在的な変更これは、動物がである文脈で、この記録及び標識技術を使用することが可能である行動のさまざまなタスクを実行する。特定の行動タスクの訓練は手術後が、記録を開始する前に行うことができる。ニューロンの活性は、少なくとも1~2週間開頭を調製した後に記録することができ、イオン導入スポットは、少なくとも2~3日間続くことができる。この時間枠は、別々のレコーディングセッション中に複数の脳領域から記録を含む実験操作、さ​​まざまなことを可能にする。 技術は、記録が作られる個々のニューロンを満たすように修正することができる。シングルニューロンのjuxtacellularラベリングのこの代替戦略は、動物がまだまたは麻酔をかけたときにのみ達成され、機械的安定性が必要です。このラベリング戦略については、BDAの使用はNeurobiotinをお勧めします。 BDAは著しくNeurobiotinオーバー成功率を増加させるプロテアーゼによって分解されない。標識は、灌流前の最後の記録セッション中に試みるべきである動物。 juxtacellularプロトコルの詳細な説明は、以前に6,19シカゴスカイブルーの我々の経験のイオン導入注入が実質的により高い収率を有するに技術は、8警告ラットで成功して採用されている.While記載されている注意してください。シカゴスカイブルーとNeurobiotinまたはBDAラベルの両方が同じ動物で行うことができることに注意してください。 この技術は、種々の種のために適切である可能性がある。 juxtacellularの録音には、例えば、警報マウス9の皮質領域で行われていることに注意してください。トレーニング、ハンドリング、そして頭部拘束が特定の種であるが、このプロトコルに記載の監視と標識のための特別な技術は同じままにしてください。最後に、単純にピペットチップの大きさと電流パルスのパラメータを変更することによって、この技術は、薬理学的薬剤20,21を含む分子の種々のイオン導入注入のために使用することができる。このように、技術はまた、行動する動物を伴う神経薬理学的研究に有用である可能性があります。 結論それは、多くの場合、一緒に非常に近接している脳の領域が著しく異なる特性及び/又は機能22を有することができる場合である。このような場合には、生物の行動に解剖学的に定義された領域からの単一ニューロンの活動に関連して神経回路や演算を理解するために重要です。現在の記事では、標準的な技術の組み合わせを使用してこれを達成するためのプロトコルを示し、例として、VPM視床ニューロンにおける感覚エンコーディングについて説明します。技術は、異なる動物モデルにおける脳領域と行動パラダイムの様々な適切かつ実行可能である可能性が高い。それは6,8アラート動物において単細胞juxtacellular標識よりも実質的に高い成功率を有し、およびマルチELEを利用する技術より良い解剖学的解像度の利点を有しているctrodeアレイまたはマイクロドライブ。

積極的に行動のタスクに従事し、アラート、動物における神経活動の監視は、神経系の機能と組織を理解するために重要です。シングルニューロンユニットからの電気的活動の細胞外記録は、長いシステム神経科学の定番ツールとなって、現在で使用されて広くまだいる。電極の種類とさまざまな構成は、特定の実験の科学的·技術的な要求に応じて利用可能です。慢性移植マイクロドライブまたは電極アレイは、多くの場合、鳥類、げっ歯類、非ヒト霊長類を含む1-4、自由に動物を移動させる際に使用される。また、外部のマイクロマニピュレーターを経由して金属やガラス微小電極を伴う急性の貫通部は、多くの場合、麻酔をかけたり頭拘束動物から記録するために使用されます。ガラスマイクロピペット電極は、それらが明確に隔離するjuxtacellularまたは「細胞添付」構成で使用することができるという利点を有する5ソート事後スパイクの合併症のない単一ニューロンの活動。これらは、色素または神経解剖学的トレーサーの小さな堆積物を注入するために、または個々のセルを記録充填するために使用することができるようにこれらの電極はさらに、解剖学的に同定された細胞または場所から記録を可能にする。この構成は、正常に、ラット、マウス、鳥類6-10に適用されている。現在記載の技術は、juxtacellular監視や警告における細胞外の色素沈着、頭部拘束ラットに焦点を当てています。埋めjuxtacellular単一のセルとは異なり、これらの色素の沈着は細胞形態または軸索突起11についての情報を提供していないが、彼 ​​らは約50μmの正確な解剖学的局在を有効にし、批判的に、アラートの動物では有意に高い収量を持っていることに注意してください。それにもかかわらず、解剖学的標識のための代替戦略として提供されて埋めjuxtacellular単一セルに関する情報。 要するに、プロトコルは3主要な段階で構成されています。第一段階では、ラットを6日間にわたって布靴下（ 図1）身体拘束に順応される。第2段階では、ヘッドレスト装置（ 図2）および記録チャンバーは、外科的に、ラットは、複数の次の記録セッション（ 図3）の間に定位面内に維持することができるように注入される。この手順は、標準的な参照が12を座標に基づいて、電気生理学的研究のために、脳の特定のサブ皮質領域を標的とするように実験者が可能になります。第三相は、確実に1つのユニット6-9を分離juxtacellularニューロンの記録を、（ 図5）石英キャピラリー管から電極を構成し、行動および電気生理学的実験（ 図4）を行って製造するための適切な治具にラットを配置することを含む、および解剖locatiマーキングシカゴスカイブルー色素（ 図6および7）と記録部位の上。録音は、同時行動の監視を行っている。しかし、行動の技術的な詳細は、各実験の科学的な目標に依存し、単一のプロトコルの範囲を超えてこのようにある。複数の日に繰り返すことができる実験手順の完了後、動物を安楽死させる。脳は、明視野または蛍光顕微鏡のいずれかを使用して、標準的な神経解剖技術に従って抽出され、処理される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td style="width:179px;">Fort Dodge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Anased (Xylazine solution)</td>
			<td style="width:179px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Betadyne (Povidone-Iodine)</td>
			<td style="width:179px;">CVS Pharmacy</td>
			<td align="right" style="width:175px;">269281</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Loctite 495</td>
			<td style="width:179px;">Grainger Industrial Supply</td>
			<td style="width:175px;">4KL86</td>
			<td style="width:315px;">20-40 cp cyanoacrylate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Vetbond</td>
			<td style="width:179px;">3M</td>
			<td style="width:175px;">1469SB</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement powder</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675571</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement liquid</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675572</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Silicone Gel</td>
			<td style="width:179px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:175px;">Mar-80</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Jet denture repair acrylic powder</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Chicago sky blue</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C8679</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:175px;">158127</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P3813</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C2506</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Diaminobenzidine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D5905</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Material Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Rat sock</td>
			<td style="width:179px;">Sew Elegant (San Diego, CA)</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 1, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">PVC tube 2 &#189;&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">U.S. Plastic Co.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">34108</td>
			<td style="width:315px;">Figure 4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Subminiature D pins &#38; sockets</td>
			<td style="width:179px;">TE Connectivity</td>
			<td style="width:175px;">205089-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel music wire 0.010&#8221; diameter</td>
			<td style="width:179px;">Precision Brand Products, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">21010</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic holding frame</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 900</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic ear bars</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 957</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic manipulator</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 960</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">&#189; mm drill burr</td>
			<td style="width:179px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:175px;">100-3995</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quiet-Air dental drill&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Midwest Dental</td>
			<td style="width:175px;">393-1600</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel 0-80 1/8&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">247438</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">0.2mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">05-407-8A</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Custom head-holding bar</td>
			<td style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:191px;">Custom head-holding plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:315px;">Custom made, Figure 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Right angle post-clamp</td>
			<td style="width:179px;">Newport</td>
			<td style="width:175px;">MCA-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">8-32 3/4&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">240181</td>
			<td style="width:315px;">For head-restraint, Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">4-40 &#188;&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">239958</td>
			<td style="width:315px;">For head restraint, Figures 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quartz capillary tubing</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">QF-100-60-10</td>
			<td style="width:315px;">Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Carbon dioxide laser puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:175px;">P-2000</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">MP-285</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier head stage</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">CV-7B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Isolated pulse stimulator</td>
			<td style="width:179px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:175px;">Model 2100</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Audio monitor</td>
			<td style="width:179px;">Radio Shack</td>
			<td style="width:175px;">32-2040</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:191px;">Pipette holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">Warner Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">#MEW-F10T</td>
			<td style="width:315px;">Alternate parts: see Discussion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Figure 6A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Electrode lead wire</td>
			<td style="width:179px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:175px;">NEF34-1646</td>
			<td style="width:315px;">(optional), Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Relay for amplifier head-stage</td>
			<td style="width:179px;">COTO Technology</td>
			<td style="width:175px;">#2342-05-000</td>
			<td style="width:315px;">(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Digital video camera</td>
			<td style="width:179px;">Basler</td>
			<td style="width:175px;">A602fm</td>
			<td style="width:315px;">(optional) For behavioral monitoring, Figure 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html>エンコード視床腹側後部内側（VPM）におけるニューロンユニット自己生成15,16を泡立てる時の感覚毛運動の段階。ラットが積極的に泡立てるされる。 図7Bは、スパイクのヒストグラムを示す。図7（a）は、VPM視床単位のサンプルスパイク活性を示す感覚毛の運動17の瞬時位相に合わせ回。泡立ての収縮期の間、よりスパイクがある。 図7Cに示すように記録した後、ユニットの位置は、シカゴスカイブルー染料のイオントフォレーシスを介して標識した。組織は、VPMの視床の神経解剖学的境界を明らかにするために、シトクロム酸化酵素活性のために対比される。このプロトコルに類似した内容が、最近、特定の脳幹核18で泡立てる関連のマルチユニット神経活動（10〜20μmの直径のピペットチップ）を監視するために適用した。 <html> 1再 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 51453 / 51453fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：布拘束靴下ドローストリングと巾着留め金とラット靴下の（A）写真。。小端部は胸骨、および尾の周りの大端部の周りにぴったりと配置されます。 （B）パネル1A靴下のためのデザインパターン。寸法はインチである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：ヘッドレスト装置の機械設計（A）ラット用精密ヘッドレストプレートの機械設計。。寸法はインチである。 （B）パネル2Aのプレートで使用するためのヘッドレストバーの機械設計。プロトコルはこれらの部品のうちの2つを必要とし、同じピッチ角に直角ポストクランプを使用してマウント。_blank &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig3highres.jpg" width="700" /> 図3：手術手順定位保持枠における（A）ラット（プロトコルステップ2.4）。 （B）移植されたネジと頭蓋マーキング（プロトコルステップ2.10）と手術部位。 （C）開頭術（プロトコルステップ2.12）と手術部位。 （D）記録チャンバー（プロトコルステップ2.14）と手術部位。基準線とシリコーンゲル（プロトコールステップ2.17）と（E）手術部位。 （F、G）所定の位置に保持ヘッドレストプレート、バー（プロトコルステップ2.20）と手術部位。 （H）場所（プロトコルステップ2.21）の接合プレート、バーとで手術部位。 （I）最終頭部拘束と記録室独自の実装アリ（プロトコルステップ2.24）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51453/51453fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig4.jpg" /> 図4：電気生理学的および行動モニタリング実験のための機械の治具におけるラットの実験的治図（プロトコルは3.5から3.6ステップ）。ジグは、 図2のバーとプレートを利用しています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig5highres.jpg" width="500" /> 図5：マイクロピペット電極構造切れ目のないマイクロピペットの（A）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.1）。。スケールバーは顕微鏡下で切れ目のないマイクロピペットとガラスブロックのパネルC.（B）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.2）のようになる。チップの反射は、ガラスに見ることができる。スケールバーは、パネルC.壊れたマイクロピペットの（C）顕微鏡写真（プロトコルステップ3.3）のようになる。 （D）パネルA.スケールバーの箱入りの領域での切れ目のないマイクロピペットの先端の顕微鏡写真は、パネルCの箱入りの領域で壊れたマイクロピペットの先端のE.（E）写真パネルのようになる<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51453/51453fig5highres.jpg" target="_blank">にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig6highres.jpg" width="500" /> 図6：アンプと電流源の切り替えのための機器 （オプション）磁気リレーを介して電流源にアンプからのリード線を切り替える（A）セットアップ。。電圧制御リレースイッチを含むプリント回路基板はATTACあるアンプヘッドステージにHED。 （B）パネル（a）のプリント回路基板のレイアウト。ボードは、増幅器リードを接続し、電流源は、リレーの入力端子につながり、電極が出力端子につながる。電極は、リレー制御端子に0または5 Vを印加することにより、電流源または増幅器のいずれかに接続されている。底面図。寸法はインチである。 （C）パネル6Bのボード·レイアウトの上面図。 （オプション）を手動で電流源にアンプからのリード線を切り替える（D）セットアップは、オープンピペットホルダーと（：機器の項をも参照）に示すもののような柔軟なリード線が必要です。このアプローチは、パネル6A-Cでのリレー回路に代わるものです。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51453/51453fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img aLT =「図7」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51453 / 51453fig7highres.jpg&quot;幅= &quot;700&quot; /&gt; 図7：実験セットアップと代表的な結果（A）スパイクと1単位（プロトコルステップ3.12）から、感覚毛の動き。。泡立て器サイクルにおける位相対（B1）正規化された鼻毛の位置。各泡立て器は泡立て器中に最も尾側の位置をゼロとして定義され、最も吻側位置は1と定義されるように正規化される。軌道は、泡立て器サイクル17における瞬時位相に対して正規化された位置を示している。すべての識別泡立て器が重畳されている。 （B2）のスパイクが発生するで泡立て器サイクルの位相のラスター。縦軸上の各試験は、単一の泡立て器を表す。 （B3）は、同じユニットの尊重泡立て器サイクル相とスパイク率のヒストグラム。シトクロムオキシダーゼ対比シカゴスカイブルー色素の（C1）の場所（プロトコルは3.13から3.14ステップ）。 （C2 </st栄&gt;）パネルC1において概説領域の高解像度のビュー。色素標識に矢じりのポイント。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51453/51453fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K ビュー.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

神経科学

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

警告齧歯動物で経頭蓋脳の電気的刺激

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

マウスの脳、青斑核の局在

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A Bedside, Single Burr Hole Approach to Multimodality Monitoring in Severe Brain Injury

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic brain injury. While elevations in ICP are common, data regarding the measurement and treatment of these ICP elevations are conflicting. There is increasing recognition that changes in the balance between supply and demand of brain tissue are critically important and therefore the measurement of multiple modalities is required. Approaches are not standard, and therefore this article provides a description of a bedside, single burr hole approach to multimodality monitoring that allows the passage of probes designed to measure not only ICP but brain tissue oxygen, blood flow, and intracranial electroencephalography. Patient selection criteria, operative procedures, and practical considerations for securing probes during critical care are described. This method is readily performed, safe, secure, and flexible for the adoption of a variety of multimodality monitoring approaches aimed at detecting or preventing secondary brain injuries.

A method of recording multimodality monitoring signals in patients with severe brain injuries using a bedside, single burr hole technique is described.

集学的治療の深刻な脳損傷の監視にベッドサイド、単一のバリの穴のアプローチ

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

脳構造の3次元形状モデリングと解析

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential for recovery based on clinical assessments alone. The functional integrity of the corticospinal tract is an important prognostic biomarker for recovery of UL function, particularly for those with severe initial UL impairment. This article presents a protocol for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. This protocol can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve UL motor recovery and outcomes after stroke. The protocol also forms part of the PREP2 algorithm, which predicts UL function for individual patients 3 months poststroke. The algorithm sequentially combines a UL strength assessment, age, transcranial magnetic stimulation, and stroke severity, within a few days of the stroke. The benefits of using PREP2 in clinical practice are described elsewhere. This article focuses on the use of a UL strength assessment and transcranial magnetic stimulation to evaluate corticospinal tract function.

This protocol is for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. It can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve upper limb motor recovery and outcomes and in clinical practice for predicting upper limb functional outcomes 3 months after stroke.

脳卒中1週間以内のコルチコ脊柱管の機能状態の判定

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...