私は中の助けを実験計画を概念と素材を支援、治療レジメンと剖検を確立する助けA. Pessier分析し、MWHチャットフィールド、MJ Robak、K.タスカーとDレンゲルヘルプCLリチャーズ-Zawackiに感謝したいと思います研究室や撮影中にそのスペースを使用するためのサポートとタロンガ動物園でのM·マクファデンとP.ハーロウ。プロジェクトは、部分的に、LA Brannellyに授与ルイジアナ州環境教育委員会の許可を経てライフ·テクノロジーズによって野生生物水産ルイジアナ州省によって資金を供給された。

倫理承認：本研究は、そのメソッドは、チューレーン大学の動物への使用、およびケア委員会（。プロトコルなし0407）によって承認された。 1。 Bdの感染症の検査<ol><li> BD用拭き取り<ol><li>無菌綿棒で綿棒動物ventrumに5回、各太もも、それぞれの側、および45ストロークの合計各肢に5回。拭き取りは両生類の皮膚にBD用のサンプリングの非侵襲的な方法である。 </li><li>静かに、DNAの最大量を綿棒で収集されていることを確認するために、ストロークの際との間で綿棒を回転させます。 </li><li> -20℃で1.5ミリリットルマイクロチューブに保管して綿棒</li></ol></li><li> DNA抽出および定量PCRアッセイ<ol><li>動物の組織のための取扱説明書に従って、市販のDNA単離キットを使用してスワブからのゲノムDNAを抽出する。 </li><li>ボイル以下の定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を用いて抽出したDNAを分析する<eM&gt;ら17、以下の変更を加えて。： </li><li> DNA抽出サンプルを二重脱イオン水で1:10に希釈する。 </li><li> PCR阻害を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）0.7μlを添加する。 </li><li> PCR阻害が結果に影響を与えていなかったことを確認するために、各サンプル中の内部陽性対照を含める。 </li><li>正と負の制御と遊走子（感染症）の負荷を推定するための希釈一連の標準を使用して実行サンプル。 </li></ol></li></ol> 2。接種<ol><li>文化のBd <ol><li> （40分間121°C）オートクレーブ処理し、冷却させ、1 Lの逆浸透水または脱イオン水に、10gのトリプトンを添加することによってトリプトンブロスを調製する。一度23℃に冷却し、1ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。 </li><li> Bdの株 （J. LongcoreからJEL411、PhyllomedusaキツネザルからGuabal、パナマから単離された）、23℃で7日間、リプトンブロスで成長</li></ol></li><li> Bを転送リプトンと寒天平板にロス文化。 <ol><li>プレートを作るために、1Lの逆浸透または脱イオン水、オートクレーブ（40分間121℃）に10グラムのトリプトンと10グラム寒天を加える。 </li><li>オートクレーブ処理した混合物を、層流フードでは、タッチするのに十分なクールですが、それは凝固する前に、ペトリ皿に入れ、フル1/4-1/3たら。 </li><li>寒天が完全に凝固し、冷却したときに、各プレートに0.5ミリリットルのBdブロスを追加し、プレートの周りに均等に分散。乾燥することができます。 </li><li>プレートは 、BD の遊走子、パラフィルムでシールプレートを接種したら。 </li><li>プレートは5〜7日、23℃でインキュベートすることができます。接種前に実行可能性を確保するために運動を遊走子確認してください。 </li></ol></li><li>遊走子接種ソリューションの洪水プレート<ol><li> Bdのインキュベーションおよび成長の5〜7日後に、エージング水道水5mlで各プレートをあふれさせると遊走子を10分間メディアを入力することができます。 </li><li>遊走子suspeを注ぐポータブル容器にnsion。 </li><li>血球計数器で遊走子濃度を推定。 </li><li>高齢者水道水で3ミリリットル当たり1×10 6の濃度に混合物を希釈。 </li></ol></li><li>動物に接種<ol><li>個々の50ミリリットルの容器では、そのventrum上で3ミリリットルの接種液を注ぐことにより、各動物に接種。余分な接種物接種用容器の底に滴下することができます。 </li><li>各動物には感染を確実にするために24時間接種容器内に残ります。 </li><li>接種の24時間後に、個々の消毒をterrariaに動物を戻す。 </li><li>感染は2週間用にビルドすることができます。綿棒と定量PCRの結果の感染を確認し、治療を開始。 </li><li> BD-ネガティブコントロールの場合、5ミリリットルと洪水BD-フリーの寒天プレートは、上記と同じ方法を使用して、水道水、かつモック接種動物歳。 </li></ol></li></ol> 3。治療計画<ol><li> PREPA処理槽の再<ol><li> 1Lの両生類リンゲル液（ - 最小有効治療濃度0.0025％のイトラコナゾール）に2.50ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。 <ol><li>両生類リンゲル溶液レシピ：1 Lの逆浸透水または脱イオン水、6.6グラムの塩化ナトリウム、0.15グラムの塩化カリウム、0.15グラムの塩化カルシウム、および0.2グラムの重炭酸ナトリウム。オートクレーブ溶液（40分間121°C）し、室温まで冷却する。 </li><li> 0.01％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に10.00ミリリットル水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加</li><li> 0.005％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に5.00ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。 </li></ol></li><li> BD-陽性およびBD-ネガティブコントロールの場合、無イトラコナゾールと両生類のリンゲル液中の動物を入浴。 </li></ol></li><li>治療&lt;OL&gt; <li>処理液の35ミリリットルで消毒50ミリリットルの容器内の個々の両生類を配置します。 </li><li>動物が完全に静かにコンテナを回転させることによって5分間カバーされていることを確認してください。 </li><li>消毒しterrariaに動物を返します。 6日間繰り返します。 </li></ol></li><li>治療の成功を確実にする<ol><li>日間の治療上のBd感染の試験動物が始まる。 </li><li>テスト1週間の治療が終了した後のBd感染の動物、および感染がクリアされたことを確認するために4週間、週に一度。 </li></ol></li></ol>バイオハザードとして4、BD <ol><li>個々のterrariaを毎週消毒。 <ol><li> 10％の漂白剤溶液浴中terrariaと治療コンテナを浴びる。 </li><li>流水で二回、各漂白コンテナを洗浄します。 </li><li>容器は再使用する前に24時間乾燥させます。 </li></ol></li><li>クリーンニトリル手袋を着用し、交差汚染を防ぐために、動物を取り扱う際Bdは病原体の。各動物の取り扱いの間に手袋を変更します。 </li><li> 10％の漂白剤の解決策をもたらすことにより、廃棄前に、すべての液体廃棄物を消毒する。 </li><li>可能性のある廃棄前にBdのにさらされているすべての固形廃棄物をオートクレーブ。 </li></ol>

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著者は、競合する経済的利益を宣言していません。

このプロトコルを用いて、我々は、安全かつ効果的に両生類でBdのためのイトラコナゾール処置の治療投与量と時間を削減することができた。最低治療用量および時間（6日間0.0025％）は無症状感染Iについて治療の成功だったnebulifer。低用量と治療時間の両方の有効性は、両生類のすべての種と年齢のクラスに使用すべき安全かつ効果的な治療法はまだありませんように 、BD 感染治療のための臨床治療試験の必要性を示しています。 イトラコナゾール処理から生じる死因は、この点11で不明である。剖検および組織病 ​​理学は、中または直後Brannelly らで治療期間後に死亡した個体の小さなサブセットを行った。15研究。それは動物が死亡していないことは明らかであるが、これらの分析の結果は、死因に関して決定的だったツボカビの。適度な自己分解は、治療群間の微妙な違いを検出するために我々の能力に影響を与えた可能性があり、死亡と試料の保存の間に発生しました。 このプロトコルは1安全で効果的な治療計画の存在をサポートしていますが、今回のようなより多くの臨床試験が進行中である必要があります。第アゾール処理、ボリコナゾールは、少なくとも一種18に有効であることが実証されている。ボリコナゾールは、イトラコナゾールよりも水溶液中でより安定であり、オタマジャクシの使用18のために安全であることが実証されている。イトラコナゾールおよびボリコナゾールの単一の治療用量は価格設定に似ていますが、ボリコナゾールは、より定期的にイトラコナゾールを選択することが研究者やキャプティブマネジャーをリードし、イトラコナゾールよりも購入のためにはるかに高価である。このとき、一つだけ発表された研究は、効果的にボリコナゾール18の実証されています。有効性を実証するために、より多くの種がトライアルが行われる必要がある。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;アゾール抗真菌剤は、真菌の増殖を抑制する13抗真菌化学療法の1種類を表しています。 、BDが表皮でのBdを殺すことを目的と28℃、温熱療法を超える温度で、in vitroで殺されている真菌病原体を殺すだけでなく、成長を削減することを目指し、他の治療法があります。塩酸テルビナフィン、いくつかの種で19 Bdの感染症の治療に成功している代替的な抗真菌剤は、真菌細胞の溶解を引き起こすことによって機能する。直接病原体を攻撃する抗真菌剤は、より成功治療法とすることができ、より多くの仕事は 、BD 感染のための有望な治療の選択肢をテストするために行われる必要があります。 イトラコナゾール処置は、無症状感染した動物において有効であることが示されているが、臨床ツボカビの処置は、ほとんど成功していた。日付20への唯一の1の研究では、成功し、末端治療している私<html> llの両生類、および治療は、電解療法と化学療法の組み合わせを積極的に関与する。末期症状の動物のための成功の治療の選択肢は、特にすべての個々の保護は種の保全に不可欠であるキャプティブ植民地で絶滅寸前の動物のために、必要とされている。 用量および治療 ​​時間を減少させることI.成功であったがnebulifer、治療は臨床感染症、他の種や動物に試験的にされていません。いくつかの種やライフステージは、イトラコナゾール治療の不寛容であるため、大規模な治療計画を適用する前に、キャプティブ管理者は、安全性と有効性を、個人の小さなサブセット上の試用処理を判断する必要があります。治療終了後少なくとも4週間処置した動物を試験することは、低レベルの感染7の根絶を確保する必要がある、あらゆる治療計画の後に実施されるべきである。 両生類保全への取り組みのためにキャプティブ保証コロニー面積優先の BD感染症のための安全で効果的な治療の選択肢の確立テント&quot;&gt;、BD自由コロニーを維持することは、絶滅の危機に種のための唯一の生命線である保全活動および捕獲コロニーの成功に不可欠である。

両生類は現在、すべての脊椎動物の分類群1の生物多様性の最大の下落を経験している。ツボカビ、ツボカビ真菌病原体Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）によって引き起こされる皮膚病、これらの劇的な下落2の主要な原因の1つであるBdは生物多様性の損失を生じさせるための記録最悪病原体である：それは両生類の600以上の種に感染し、持ってできるだけ多く200種が絶滅危惧または2,3絶滅したそのうちの300種以上の減少を引き起こした。両生類ツボカビ菌は、特定のホストされていない、それは 、BD 感染が深刻な病気を引き起こす進行するためにホストの資質が許すかは不明である。ツボカビは、電解質の損失および心不全4で得られた、皮膚におけるイオンチャネルを破壊することによって死を引き起こす。また、（何のBdの遊走子を含まない） のBd上清オタマジャクシ5最先端レベルの免疫応答を引き起こすGの研究者は 、BD は 、副生成物6毒性を生産信じています。 多くの種が急速に減少しているため、キャプティブ保証コロニー繁殖プログラムは、重要な保全対策であり、いくつかの種のための唯一の生命線である。確立し、無病コロニーを維持することは両生類管理施設のための挑戦である。 Bdの感染症を治療するための現在の化学療法の方法は、有効であるが、治療される動物に有害であることができ、単一の治療法は、種および両生類7歳クラスの両端に成功しなかった。 Bdの感染の治療のいくつかの臨床試験では、07行われている。治療の三最も一般的に使用される方法は、温熱療法、クロラムフェニコールおよびイトラコナゾールである。温熱療法は、ほとんど副作用を有すると思われるnonchemotherapeutic治療選択肢である複数のライフステージで使用することができ、GENERである同盟国効果的。治療試験では、チャットフィールドとリチャーズ- Zawacki 8は、処置した動物の96％が10日間30°Cに収容された後、感染をクリアしていたことが分かった。この試験は100パーセント成功しませんでしたが、それは他の人が自分の種のための温熱療法を評価するためのベースラインを提供しています。温熱療法は、多くの種に有効であるが、長時間にわたって高温に留まることができない多くの高山種について非実用的である。クロラムフェニコール、抗菌性は、多くの種でのBdを治療するために成功裏に使用され、 インビトロでの真菌の成長を阻害されている。抗菌ように、クロラムフェニコールは、具体的には真菌を攻撃しないが、真核細胞9においてアポトーシスを引き起こすことが知られている。これは、作用の正確なメカニズムは不明であるが、クロラムフェニコール療法は、細胞内の胞子を死滅させる、皮膚におけるアポトーシスを引き起こすことが推測されている。臨床試験は行われないので、したが用量および治療 ​​時間が評価されておらず、現在の治療プロトコルは、典型的には、地上両生類のためのこの治療は実用的でない、2〜4週間10,11のための浸水を必要とする。ヒトへの暴露は、再生不良性貧血12のまれな形態と関連していたので、クロラムフェニコールはまた、獣医学的使用のためのいくつかの国で制限されています。 イトラコナゾール、アゾール系抗真菌は、最も広く飼育されている両生類のBd感染の治療のために使用される。最も広く使用されるプロトコルは、5分11日間連続日の0.01％イトラコナゾール溶液中に入浴動物である。このプロトコルは、両生類のために有効であるが、それは両生類11,13での臨床試験に基づくものではない、哺乳動物への投与に使用される基準に由来した。このプロトコルは、特に属ラナにし、オタマジャクシ、最近metamorphs 11で、特定の種の負の副作用を引き起こす可能性があります。オタマジャクシ処理は、イトラコナゾールのはるかに低い濃度（0.0005％）を用いて成功しているが、脱色14と関連していた。これと同じ濃度は、最近のmetamorphsでトライアルが行われ、感染15の治療に失敗したことが判明した。イトラコナゾール治療によるマイナスの副作用の危険性がありますので、いくつかの専門家は、11日間連続して1の半分の通常の濃度（0.005％）を使用し、これが BD 感染の16を硬化させることに成功したことが判明しました。 本研究では 、BD 感染 15を治療するためのイトラコナゾールを使用して臨床治療試験の要約である。プロトコルは、イトラコナゾールの BD感染動物の治療のための安全かつ効果的である最低用量や治療時間を見つけるための試みを説明しています。本研究で使用した動物は、湾岸のヒキガエルの最近のmetamorphs、Incilius nebuliferた。

<table><tbody><tr><td>0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox</td><td>Janssen Pharmaceutica Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-100</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Medical and Wire Equipment</td><td>MW113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microtubes</td><td>Sarstedt</td><td>73.703.217</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td></td></tr><tr><td>7500 Real-time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351104</td><td></td></tr><tr><td>VIC IPC</td><td>Applied Biosystems</td><td>4308323</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Invitrogen</td><td>Q10029</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430589</td><td></td></tr></tbody></table>

reduced itraconazole concentration and durations are successful in treating batrachochytrium dendrobatidis infection in amphibians

両生類は、任意の脊椎動物クラスの最大の下落を経験しているし、これらの減少の主な原因は、疾患ツボカビを引き起こす真菌の病原体、Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）、である。キャプティブ保証コロニーが絶滅両生類で世界的に重要であり、絶滅の重大な脅威のそれらのための唯一の生命線である。無病コロニーを維持することは、キャプティブ経営者の優先事項である、まだすべての種のため、ライフステージ全体で安全かつ効果的な治療が同定されていない。一般的に使用される投与量は、いくつかの個人や種に害を及ぼす可能性があるが、最も広く使用されている化学療法は、イトラコナゾールである。我々は、イトラコナゾールの低い、より安全で効果的な投与量は、Bdの感染症を治すために見つけることができるかどうかを評価するための臨床治療の治験を行った。我々は発見した0.01から0.0025パーセント処理濃度を低下させ、11から処理時間を減少させることによって5分浴の-6日間、カエルは副作用が少ないと少ない治療に関連した死亡の BD感染の硬化させることができた。

すべての動物は、治療が終わった4週間後にBD-陰性であった場合は、イトラコナゾール治療が成功したと考えられた。治療が開始される前に、2週間接種後、全てのBD-接種した動物は、治療後4週が終了している間、BD-陽性対照動物は（16,765.12の平均遊走子負荷を持っていた、（17.34±）1,121.7の平均遊走子負荷で、感染していた）14643.08±。 Incilius nebuliferの治療（N = 15）が6日間、5分の日の0.0025％イトラコナゾール濃度のバスを使用して成功した。 （ 図1B）、多くの：BD-ポジティブコントロール（χ2,1 = 2.17、EXP（B）= 20,500、P = 0.339 Cox回帰）と比較した場合、イトラコナゾール治療のこの低濃度投与量は、死亡率に有意差は認められなかった誰は 、BDに感染した臨床試験の終了まで生存した。 0.0025％iの浴場11日間traconazole、および0.005％の両方と6日間0.0025％のイトラコナゾールは、全て（ 図1Aおよび1B）が有意に増加した11日間の治療期間のための推奨処理濃度とその半分の濃度を効果的かつ安全な治療の選択肢であることが見出されたBD-ポジティブコントロール（Cox回帰に比べて死亡率：2,1 = 35.68χ0.01％イトラコナゾール、EXP（B）= 307.54、P &lt;0.01、0.005％のイトラコナゾール2,1 = 16.17χ、EXP（B）= 9.40はp &lt;0.01）（ 図1A）。 11日間の0.01％イトラコナゾール治療はIに100％の死亡率を引き起こしたnebuliferは 、と半分濃度（11日間0.005％イトラコナゾール）を60％の死亡率（ 図1A）を引き起こした。治療中に死亡した動物の小さなサブセットのための剖検及び病理組織学的検査を行った。この研究には動物がツボカビで死亡していません。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withiNページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51166/51166fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51166/51166fig1.jpg" width="600px" /> 図1。イトラコナゾール治療15全体の生存率の差（A）Incilius nebulifer：11 D処理（N =各イトラコナゾール0.01、0.005の濃度、および0.0025％のための15、N = 17、BD-陽性対照群のためであり、n = 9 Bdは陰性対照群）。 （B）Ⅰ。 nebulifer：（Bdは陰性対照群ではn = 15 0.01、0.005と0.0025％の各イトラコナゾール濃度についてはn = Bdは陽性対照群では17であり、n = 9）6dを治療。黒い矢印は、治療の最終日を示している。実線は対照群（黒= BD-陽性の、灰色= BD-ネガティブ）の生存を示す。破線はイトラコナゾール処置群の生存率を示している（薄い灰色の点= 0.01％、ミディアムグレードット= 0.005％、黒い点= 0.0025％のイトラコナゾール）。 （この図はBrannelly ら 15、図1Bおよび1Cから変更されている）。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51166/51166fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

両生類におけるBatrachochytriumのdendrobatidis感染が低減濃度（0.0025％）、および一般的に使用されるよりもイトラコナゾールの短い持続時間（6日間5分浴）を用いて除去することができる。以下で死亡率およびより少ない負の副作用は、この修飾治療プロトコルを用いて観察した。

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している<em&gt; Batrachochytriumのdendrobatidis</em&gt;両生類の感染

Amphibians are experiencing the greatest decline of any vertebrate class and a leading cause of these declines is a fungal pathogen, Batrachochytrium ...

reduced-itraconazole-concentration-durations-are-successful-treating

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

11.5K ビュー.  James Cook University. 両生類におけるBatrachochytriumのdendrobatidis感染が低減濃度（0.0025％）、および一般的に使用されるよりもイトラコナゾールの短い持続時間（6日間5分浴）を用いて除去することができる。以下で死亡率およびより少ない負の副作用は、この修飾治療プロトコルを用いて観察した。 

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

免疫・感染学

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em&gt;ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における&gt;無鞭毛

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

This study involves methods to reveal effects on a model fish host following alteration of the skin and gut microbiome communities&#160;composition by an antibiotic.

ホスト表現型の検討で<em&gt;カダヤシアフィニス</em&gt;続き抗生物質治療

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is caused by the fungal pathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), which infects and disrupts frog epidermis; however, pathological changes have not been explicitly characterized. Apoptosis (programmed cell death) can be used by pathogens to damage host tissue, but can also be a host mechanism of disease resistance for pathogen removal. In this study, we quantify epidermal cell death of infected and uninfected animals using two different assays: terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL), and caspase 3/7. Using ventral, dorsal, and thigh skin tissue in the TUNEL assay, we observe cell death in the epidermal cells in situ of clinically infected animals and compare cell death with uninfected animals using fluorescent microscopy. In order to determine how apoptosis levels in the epidermis change over the course of infection we remove toe-tip samples fortnightly over an 8-week period, and use a caspase 3/7 assay with extracted proteins to quantify activity within the samples. We then correlate caspase 3/7 activity with infection load. The TUNEL assay is useful for localization of cell death in situ, but is expensive and time intensive per sample. The caspase 3/7 assay is efficient for large sample sizes and time course experiments. However, because frog toe tip biopsies are small there is limited extract available for sample standardization via protein quantification methods, such as the Bradford assay. Therefore, we suggest estimating skin surface area through photographic analysis of toe biopsies to avoid consuming extracts during sample standardization.

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

We quantify epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis using two methods. First, we use terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ histology to determine differences between clinically infected and uninfected animals. Second, we conduct a time series analysis of apoptosis over infection using a caspase 3/7 protein analysis.

ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

規制カンジダバイオ フィルムの成長する赤い光で毎日光線

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa have the potential to impair animal welfare and research. The fish are typically analyzed post mortem to detect microbes. The use of sentinels is a suggested way to improve the sensitivity of the surveillance and to reduce the number of animals to sample. The setting of a pre-filtration sentinel tank out of a recirculating system is described. The technique is developed to prevent water pollution and to represent the fish population by a careful selection of age, gender, and strains. In order to use the minimum number of animals, techniques to screen the environment are also detailed. Polymerase Chain Reaction (PCR) on surface sump swabs is used to significantly improve the detection of some prevalent and pathogenic mycobacterial species such as Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum, and Mycobacterium chelonae. Another environmental method consists of processing the sludge at the bottom of a holding tank or sump to look for P. tomentosa eggs. This is a cheap and fast technique that can be applied in quarantine where a breeding device is submerged into the holding tank of imported animals. Finally, PCR is applied to the sludge sample and A. hydrophila is detected at the sump&#39;s bottom and surface. Generally, these environmental screening techniques applied to these specific pathogens have led to an increased sensitivity compared to the testing of pre-filtration sentinels.

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

This protocol describes the use of sump swabs and sludge analysis of zebrafish systems, which leads to increased detection compared to the sole use of sentinels to detect pathogens such as Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa. A system to monitor P. tomentosa eggs in quarantine is also proposed.

ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

生物学

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している

要約

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監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

ホスト表現型の検討で

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム

ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。

規制カンジダバイオフィルムの成長する赤い光で毎日光線

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナスサルモニシダ環境スクリーニング

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

減少イトラコナゾール濃度および期間は、治療するのに成功している

要約

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ホスト表現型の検討で

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