私たちは、CDR2抗体を提供するための胸腺サンプルとブルーノKyewski（DKFZ、ハイデルベルグ、ドイツ）を私たちに提供するための胸部心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲンの外科医に感謝しています。また、仕分け施設（チュービンゲン大学）からハンス·イェルクBühringとサブリナグリムに感謝したいと思います。この作品は、SFB 685とHertie財団によってサポートされていました。

<ol>
	<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discovery+of+thymus+function+and+of+thymus-derived+lymphocytes.">The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes.</a> Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).</li><li>Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymus+contains+2+distinct+dendritic+cell+populations.">Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations.</a> Blood. 97, 1733-1741 (2001).</li><li>Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullary+Epithelial+Cells+of+the+Human+Thymus+Express+a+Highly+Diverse+Selection+of+Tissue-specific+Genes+Colocalized+in+Chromosomal+Clusters.">Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).</li><li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+S+dominates+autoantigen+processing+in+human+thymic+dendritic+cells.">Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells.</a> Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).</li><li>Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+trans-differentiation+of+thymus+cells+into+parathyroid-like+cells+without+genetic+manipulation.">Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).</li><li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Analysis+of+Complex+Thymus+Stromal+Cell+Populations:+Rapid+Thymic+Epithelia+Preparation+Characterizes+Radiation+Injury.">Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury.</a> Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).</li><li>Bendriss-Vermare, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+thymus+contains+IFN-&#945;-producing+CD11c-,+myeloid+CD11c+,+and+mature+interdigitating+dendritic+cells.">Human thymus contains IFN-&#945;-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).</li><li>Schmitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+of+human+thymic+dendritic+cell+subsets.">Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets.</a> Immunobiology. 212, 167-177 (2007).</li><li>Dzionek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDCA-4:+Three+Markers+for+Distinct+Subsets+of+Dendritic+Cells+in+Human+Peripheral+Blood.">BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood.</a> The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).</li><li>Wu, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+thymic+dendritic+cells.">Heterogeneity of thymic dendritic cells.</a> Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).</li><li>Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+MHC-peptide+matrix+of+central+tolerance+in+the+human+thymus.">Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus.</a> Nature Communications. , (2013).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ここで説明するプロトコルは、ゴッターら 4が発行するプロトコルの改変である。プロトコルにおける重要なステップは、条件や組織の初期準備だけでなく、パーコール密度分離である。私たちは強く、採取後できるだけ速やかに組織を処理することをお勧めします。これは、清掃や組織を切断する際に高速だが、十分に機能することが重要です。ステップ2.3で説明した胸腺細胞の洗浄中に、間質細胞に損傷を与える可能性があまりにも積極的かつ長期圧力などの組織片にシリンジプランジャの背に圧力をかけたときに適切なバランスを見つけることが重要です。摂動を引き起こすことなく、パーコール溶液/細胞懸濁液の上に媒体を積層することもいくつかの練習を必要とし得る。遠心分離後、それは可能な限り迅速にパーコール溶液の最小量を有するパーコール層からすべての低密度画分細胞を収集することが重要である。 ザ·全体の細胞収率および相対APC番号（ 表1参照）、非常に可変であっても（特に年齢に関して）ドナーおよび実験者の取スキルに依存することができる。概要については、細胞懸濁液は、必要に応じて、プロトコルの異なる手順に従って、HLA-DRおよび/または他のマーカーで染色することができる。表現型分析のために使用される全ての抗体は、最適な結果を達成するために滴定されるべきである。 単離された細胞の高い数値が必要な場合のためthymoctyesに比べ、胸腺内のAPCタイプの比較的少量のため、胸腺の大部分は必要になることがあります。 組織解離は、実験室で使用できる場合は、これはかなり組織処理を高速化しますが、ここで説明する両方のバリエーションは同様に機能。比較的頻繁な問題は、特にパーコール分離とMACS / FACSソーティング間のステップの間に、細胞の凝集可能性があります。この場合、短いDNアーゼI掘るプロトコールに記載されているようestionは通常、問題を解決します。胸腺組織を連続的により古いドナーからの老化、胸腺異なる消化工程から得られた単一細胞懸濁液を遠心分離した後、管の上に泳ぐするいくつかの脂肪が含まれる場合があり間に脂肪組織によって置き換えられるからである。このような場合には、脂肪は、プロトコルを続行する前に、ピペットを用いて除去されるべきである。最適な結果を得るだけでなく、経済上の理由から、我々は抗体だけでなく、抗PEマイクロビーズ（セクション5および6）だけでなく、滴定へのアドバイス。マウス胸腺から、TECの単離のために、代わりの酵素混合物は、TEC収量8,13を強化するために記載されているが、我々はヒト組織でそれらをテストしていません。 原理的には、B細胞およびpDCのような他の胸腺APC細胞および間質細胞は、それぞれのマーカーが知られている場合FACSソーティング/ MACSによって（コラゲナーゼ/ DNアーゼ消化およびパーコール以下）LDF細胞から単離することができる。例えば、PDC、BDCA-2、BDCA-FOR図4およびCD123は、マーカ6,14として記載されている。胸腺細胞サブセットの分析や隔離が必要な場合、彼らは非常に純粋であり、最小限の操作を受けているので、我々は、（ステップ2.3）を絞ることによって放出された細胞を使用することをお勧めします。

胸腺はT細胞の発達が起こる器官である。胸腺の活動はまだ古い時代に検出することができますが、それが連続して脂肪に置き換えるになったとき、その相対的で絶対的なサイズは、年齢とともに減少する。免疫応答のためのその重要性は1960年代初頭1で示された。 T細胞レパートリーは、主に機能性および自己寛容T細胞レパートリー2で、その結果、T細胞の開発に生死キューを提供胸腺APCの異なる種類に対するペプチド-MHC複合体とT細胞受容体の相互作用を介して形成されている。 ヒト胸腺細胞の約98％は、胸腺細胞とも呼ばれるT細胞を開発している。残りの2％は、TEC（皮質、髄質、被膜下）、骨髄および形質DC（MDC、PDC）、マクロファージ、B細胞、成熟した再循環T細胞、顆粒球、様々含む異なる細胞型の数で構成されFibroblasts、内皮細胞および筋肉、神経細胞および気道上皮（ 図1）のような他の組織からの細胞に似た発現表現型を有する上皮細胞を非常にまれ。これらのうち、TECとDCは通常の胸腺に見られる主要なAPCタイプです。近年では、文化や分子プロファイリングのためのこれらのAPCタイプの精製は、より多くの関心を集めている。それらの低い周波数に、詳細な分析のためにこれらの細胞型のいずれかの単離は、効率的で再現可能で費用効果の高い手順を必要とする。ここで紹介する方法は、以前に発表された研究3,4からの変更です。 任意の他の組織と同様に、胸腺からの細胞抽出は、単一細胞の懸濁液を得るために、酵素的に細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用ネットワークを脱凝集することによって達成することができる。良好な解離効率、細胞収量、細胞生存率および細胞秒の保持のような特定のパラメータがあります重要であるとurfaceマーカーは、これらの稀な細胞集団の単離の成功のために最適化される必要がある。 このプロトコルでは、DCおよびTECサブセットの単離は、機械的破壊及び酵素消化によって組織の単一細胞懸濁液を作製することによって行われる。私たちは、組織を一緒に保持している天然コラーゲンを打破するために、様々な酵素活性のバランスの取れた比率がクロストリジウムヒストリからコラゲナーゼAを使用しています。 DNアーゼIは死細胞（胸腺細胞は非常に敏感である）からの遊離DNAによる細胞凝集を減少させるために酵素液に含まれています。我々はまた、組織の解離剤により補助機械的および酵素組織治療を含む一般的な酵素組織消化の代替アプローチを提供する。単一細胞懸濁液を、次いで、細胞の低密度画分（LDF）の富化のための単一のパーコール密度遠心分離にかけられる。細胞のこの画分から、DCはFを染色することによって単離することができるまたはDC表面マーカー（ すなわち、のCD11c +）および磁気分離または蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて。胸腺細胞の大部分を含むリンパ系細胞とは異なり、TECは高レベルでCD45を発現しないが、上皮細胞接着分子EpCAMのために陽性である。 CTECは、CDR-2（皮質樹状網状-2）により認識まだ未定義の抗原抗体4,5および幾分低いEpCAM発現の発現によって髄TECと区別することができる。のEpCAMおよびCDR2の差動共発現は、6ソーティング高速セルを介してこれらのTECサブセットの効率的な単離を可能にする。 ここで紹介するプロトコルは、人間の胸腺組織に最適化されています。 FACS選別を使用した場合の手順の持続時間は、組織の量及び実験者の能力ならびにセルソーターの速度に依存する。通常は、DCを単離するためのプロトコルは、5以内に完了することができます-6時間および8〜10時間でのTECの単離のため。胸腺組織からDCおよびTECサブセットの分離は、時間に敏感である。より高速な単離操作、優れた細胞の状態。最後に、単離された細胞は、mRNAの比較研究およびタンパク質発現、PCR実験では、タンパク質の単離、分子プロファイリング（ すなわちトランスクリプトミクス、マイクロRNA分析）、ならびに細胞培養6のようなさらなる調査のために使用することができる。 倫理に関する声明ヒト胸腺組織と連携できるようにするために研究者は、組織は通常、未成年から取得されるため、ローカル倫理委員会や責任ある当局だけでなく、ドナーの書面によるインフォームドコンセント（または通常は彼または彼女の両親からの承認を得る必要がある子どもたち）。さらに、すべてのヒト組織は、潜在的に感染し、適切な処置などなど 、手袋での作業のように、注意が必要であるとして処理する必要があります。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>K41-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 103 586 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II bovine pancreatic</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-001</td>
			<td>stock conc. 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CDR2 (purified)</td>
			<td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>labeled with Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45 (Pacific Blue)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human EpCAM (APC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD11c (PE)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for tissue dissociator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1.130 g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare, Life Sciences</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamunex 10%</td>
			<td>Tajecris-Biotherapeutics</td>
			<td>G120052</td>
			<td>1:10 pre-dilution, use 20 &#956;l/1 x 106cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millex GS</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td>Syringe driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Pump driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PC oak ridge centrifuge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PP conical tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm 5 ml test tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>FACS stainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INSTRUMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Evolution R6 (rotor)</td>
			<td>Kendro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator REAX 2</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093 235</td>
			<td>tissue dissociator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus

このプロトコルでは、ヒト胸腺から樹状細胞（DC）および上皮細胞（TEC）を単離する方法を提供する。 DCとTECは、主要な抗原提示細胞の正常胸腺に見られる（APC）型であり、それはよく、彼らは胸腺選択の際に異なる役割を果たしていることが確立されている。これらの細胞は、胸腺における異なる微小環境に局在化され、各APC型は、細胞のわずかな集団を構成している。さらに、これらの細胞型の生物学を理解するために、これらの細胞集団の特徴付けは非常に望ましいしかし、それらの低い周波数に、これらの細胞型のいずれかの単離は、効率的かつ再現可能な手順を必要とする。このプロトコルは、多様な細胞の性質の特性に適した細胞を得る方法を詳しく説明します。胸腺組織を機械的に破壊され、酵素消化の異なるステップの後に、得られた細胞懸濁液を、パーコール密度遠心分離工程を用いて濃縮される。骨髄DC（CD11cの単離のための&lt;商標&gt; +）、低密度画分（LDF）からの細胞を磁気細胞選別により免疫選択されている。 TEC集団（MTEC、CTEC）の濃縮は、特定の細胞マーカーを用いて細胞ソーティング（FACS）を蛍光活性化を介してそれらのその後の単離を可能にする低密度パーコール細胞画分からの造血の枯渇（CD45用Hi）細胞によって達成される。単離された細胞は、異なる下流の用途に使用することができる。

このプロトコルでは、出発物質として、我々はインフォームドコンセントの後に、制度的なガイドラインの下で得られた矯正心臓血管外科（学科胸部と心臓血管外科、大学クリニックチュービンゲン）を受けている子供から削除胸腺組織を使用しています。この廃棄された材料は2-30 g以上のサイズで大きく異なります。得られたMDCおよびTECサブセット（CTECとMTEC）の数は、サイズだけでなく、単離に使用胸腺組織サンプルの年齢に依存している。 図2（〜9 CM）6歳の子供から得られた組織のかなり大きな部分を示しています。このプロトコルの重要な最初のステップは、取（白矢印）の望ましくない部分からの組織の洗浄である。 単一パーコール密度遠心分離秒を用いて分離した単一細胞懸濁液を得るために、セクション2と3.1のプロトコルで概説した胸腺組織を処理したTEP単一細胞懸濁液を、一方パーコール遠心分離後に、このパーセンテージは15〜40％に、大型の細胞を含む、低密度画分（LDF）に増加し、HLA-DR +細胞（ 図3A）の約3％を含むが均一な小型の胸腺細胞から主に構成された高密度画分（HDF）は、実質的にそのような細胞（ 図3B）を含まない。近隣（LDF）の画分を含有する濃縮されたAPCは、その後回収し、その後の単離工程に使用するための細胞を回収して洗浄した。 胸腺MDCがCD11c9、10を含む表面マーカーの数の表現によって識別することができますが、PDCはこのようなBDCA-2、BDCA-4、CD45RAおよびCD123 11,12のようなマーカーを発現する。 LDF細胞の濃縮後、両方の細胞型は+磁気細胞分離によって、またはCD11cの流れの選別+またはBDCA-4のいずれかより大きな数でも、それらの効率的な単離を可能にする、この画分の2〜10％を構成する細胞6。 図4は、セクション5に記載された修飾磁気細胞分離プロトコルを使用したCD11c +細胞の効率的な単離を示す。単離された細胞の免疫染色によって確立された単離後、のCD11c + DCの純度は93％であった。平均して、孤立したCD11c + DCの回復がある5×10 5 -5×10 6のmDC 10 9総胸腺細胞ごとに単一の入力範囲で異なる年齢や組織重量のいくつかの個々の胸腺サンプルから得られた。 表1のデータを示す細胞懸濁液だけでなく、総LDF番号とそれに続くのCD11c +収率と純度。 APC濃縮分画では、細胞のわずか約0.5％、CD45 LOのEpCAM +またはCD45 NEGのEpCAM +である。 CTECとMTECはEpCAMのLとしてトリプシン消化CD45 LO / NEG濃縮ストローマ細胞からソートすることができます<html> O CDR2 +とのEpCAM こんにちは CDR2 - 、それぞれ図5に示すように。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50951/50951fig1.jpg" /> 図1。ヒト胸腺の細胞組織と組成の簡略図。胸腺は、異なる成熟段階において、胸腺細胞で構成され、異種のセルラーネットワークは、胸腺の環境を形成し、胸腺間質と称される。胸腺間質の主要な細胞型はMDCおよびPDC、上皮細胞（その小葉内局在性に応じて2つの主なカテゴリに分かれて：皮質、および髄質）であり、マクロファージ略語：DC、樹状細胞、mDCを、骨髄樹状細胞;。 PDC、形質細胞様樹状細胞、Mφ、マクロファージ、モノ、単球、CTEC、皮質上皮細胞、MTEC、髄質上皮細胞。 常に &quot;&gt;：「キープtogether.withinページ= FO」10トン<img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50951/50951fig2.jpg" /> 図2。単一細胞を調製するための組織の第取ステップ。矢印のポイントの前にプロトコルの実行のために廃棄される必要があり、望ましくない組織部分へ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50951/50951fig3.jpg" /> 図3。精製手順の異なる段階の胸腺APC。FACS分析の精製 。胸腺組織の単一細胞懸濁液は、機械的破壊、シリアル酵素消化によって得られ、APCは、パーコール密度分離によって（LDF細胞）を富化。 （A）の前及び（B）後の細胞を、パーコール密度分離は、APCの濃縮を確認するためにHLA-DR-PE抗体で染色した。一般的に観測されたHLA-DR +細胞の割合の範囲はindicatです<html> ED。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50951/50951fig4.jpg" /> 図4。のCD11c +たmDC。胸腺組織の単離は、Iは、単一の細胞懸濁液を作成するためにコラゲナーゼA / DNアーゼを用いて消化し ​​た。のCD11c + MDCは、単一の細胞懸濁液（0.6％）のわずかな集団である。パーコール密度分離を介してLDF細胞の濃縮後のCD11c +細胞の割合は約9％まで上昇する。 LDF細胞はCD11cの-PE抗体で標識し、続いて磁気ビーズ（抗PE）を用いて単離した。直接FACSによる磁気細胞分離後のCD11c +集団の再分析は、93％の純度を示した。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50951/50951fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 0951/50951fig5.jpg &quot;/&gt; 図5。 CD45 LO / neg細胞とTECサブセットのその後の選別の濃縮。A）パーコール密度分離（それぞれ9％及び16.2％）前後のトータル単一細胞懸濁液中のCD45陰性/低胸腺間質細胞の割合を示す代表的なドットプロット。 （MTEC）またはEpCAMのLO CDR2 +（CTEC） - B）LDF細胞は、磁気ビーズとのEpCAM こんにちは CDR2として枯渇画分から替えられたTECのサブセットを使用して、CD45 hi細胞を枯渇させた。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="8"> のCD11c +のMDC周波数、細胞収量と異なるドナーの純度 </td></tr><tr><td> ドナー </td><td> 時代 </td><td> 組織重量 </td><td> サンプルあたりの全細胞 </td><td> サンプルあたりのLDFの細胞 </td><td> のCD11c+％ </td><td> のCD11c +サンプルあたり隔離 </td><td> のCD11c +純度 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 5日間</td><td> 7グラム</td><td> 1.45×10 9 </td><td> 9.5×10 7 </td><td> 12.6 </td><td> 2.4×10 6 </td><td> 89パーセント</td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3年</td><td> 15グラム</td><td> 2×10 9 </td><td> 6.5×10 7 </td><td> 4.3 </td><td> 1.9×10 6 </td><td> 81パーセント</td></tr><tr><td> 3 </td><td> 21日</td><td> 9グラム</td><td> 2.6×10 9 </td><td> 22×10 7 </td><td> 10.3 </td><td> 3.6×10 6 </td><td> 93パーセント</td></tr><tr><td> 4 </td><td> 6年</td><td> 13グラム</td><td> 1.4×10 9 </td><td> 25.4×10 7 </td><td> 4.2 </td><td> 5.7×10 6 </td><td> 82パーセント</td></tr><tr><td> 5 </td><td> 5日間</td><td> 6.5グラム</td><td> 1.3×10 9 </td><td> 16.2×10 7 </td><td> 6 </td><td> 2.9×10 6 </td><td> 91パーセント</td></tr><tr><td> 6 </td><td> 39日</td><td> 3グラム</td><td> 0.6×10 9 </td><td> 8×10 7 </td><td> 3.4 </td><td> 1.3×10 6 </td><td> 80パーセント</td></tr></tbody></table> 表1。 2消化のラウンドならびにパーコール分離後LDF細胞の収量後に放出された全単一細胞懸濁細胞の数は、異なる年齢および組織重量の6人の胸腺の試料で行っ単離のために示されている。たmDCの周波数はベースのフローサイトメトリーにより測定した総LDF細胞におけるCD11cの発現に（APCは濃縮）。収量およびCD11c +細胞の純度は、磁気ビーズ分離後に、個々のドナーについて示されている。

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Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K ビュー.  Hertie Institute for Clinical Brain Research. このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。 

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Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

免疫・感染学

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...