著者らは、資金調達のためにアメリカ心臓協会国立科学開発グラント（10SDG2600001）、スタンフォード大学のBio-Xの学際的イニシアティブプログラム、スタンフォード医科学者の研究計画を承認したいと思います。

1。ポリマー合成<ol><li>ドラフト内で、ブタンジオールジアクリレート（C）の3,523 mgの秤量し、攪拌棒を含むガラスシンチレーションバイアルに移す。 </li><li>予熱5 - アミノ-1 - ペンタノール（32）が90°Cに塩を可溶化するために、次いでドラフト内で、1,533 mgの32を秤量し、Cを含有するシンチレーションバイアルに追加するこの方法は、モル比をもたらすであろうCの：32 = 1:1.2。 </li><li>すぐに撹拌プレート上に両方のソリューションを含むバイアルを置きます。 600 rpmで撹拌速度を設定します。 </li><li> 90℃に設定したオーブンにシンチレーションバイアルを転送4時間1,000 rpmに攪拌速度を設定します。撹拌棒が動かなくなった場合は、速度を下げる。 4時間後、下300rpmにスピードとは、別の12〜16時間90℃で維持する。 </li><li>攪拌棒を含むガラスシンチレーションバイアル中の無水テトラヒドロフラン（THF）10mlにC32の5グラムを追加します。完全に溶解するまでハイに箔と渦に包みます。 </li><li>別のガラスシンチレーションバイアルのコンタ中攪拌棒ining、Tetraethyleneglycoldiamineの10ミリ（122）を追加します。 THFを40ミリリットルを追加します。 </li><li>一緒になって、その後5分間攪拌プレート上で両方のバイアル（C32および122）を配置します。ホイルで覆い、24時間400 rpmで撹拌し、室温で残す。最終生成物を、C32-122と呼ばれている。 </li><li> C32-122の各5グラムバッチの5×50ミリリットルファルコンチューブを量る。ノートブック内の各管の質量に注意してください。 </li><li>各50mlのFalconチューブに転写無水ジエチルエーテル30mlを。 </li><li>各50ミリリットルファルコンチューブにC32-122の10ミリリットルを転送します。 </li><li>渦ファルコンチューブを激しく次いで、2分間2500rpmで遠心する。注：抽出されたポリマーは、チューブの底部に収集されます。 </li><li>上側の解決策を捨て、ステップ1.9および1.11をさらに2回繰り返します。 </li><li>一晩デシケーターや真空中で抽出されたC32-122を含む、オープンチューブを配置します。すべてのチューブは、光から保護されていることを確認してください。 </li><li>最終的な質量を決定するために、C32-122を含む全てのチューブを量るポリマーを抽出した。 </li><li> 100 mg / mlの濃度で無水DMSO中で抽出された重合体を溶解する。 </li><li>光と水分から保護し、-20℃で溶解したポリマーを保管してください。 </li></ol> 2。細胞播種<ol><li>プレコート0.1％（wt / vol）のゼラチンとT-150組織培養フラスコの底。ゼラチンは30〜45分間フラスコ内で維持する必要があります。ゼラチンコーティングはADSCの接着を支援します。 </li><li>プレコートしたT-150フラスコから吸引ゼラチン。 </li><li> 10％FBSを含有するDMEM 20mlのフラスコに、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10 ngの4×10 6のADSC（≤継代3）を追加/ mlのbFGFを。 </li><li> 37℃で、一晩で5％CO 2のインキュベーター内でのT-150フラスコに配置します。 </li><li>翌日、トランスフェクション手順を開始する。 </li></ol> 3。ナノ粒子の調製とトランスフェクション<ol><li>次の手順はあたり16.1μgのプラスミドDNAを含有するナノ粒子の製造のためのものである30:1の重量比は、プラスミド、ポリマーにおける1.0×10 6細胞。 </li><li>希プラスミドDNA（1 mg / mlの、pVEGF165、Aldevron、ND、USA）を15 50mlのFalconチューブ中の酢酸ナトリウム中で120μgの/ mlの最終濃度（25 mM）をする。 </li><li>希C32-122（100 mg / ml）を第15ミリリットルFalconチューブ中の酢酸ナトリウム（25 mM）の中で3.6 mg / mlの最終濃度。 </li><li> 10秒間、直ちに高い所にシングル15ミリリットルファルコンチューブと渦に各ファルコンチューブの中身を兼ね備えています。 </li><li>管が発生するナノ粒子形成のために10分間室温で放置します。 </li><li>インキュベートしながら、トランスフェクト1.0×10 6細胞あたり7.8ミリリットル完全補充したDMEMで、組織培養フラスコ内でメディアを交換してください。 </li><li>組織培養フラスコにナノ粒子溶液を移し、均等に分散するように前後に傾けてください。 </li><li> 4時間37℃、5％CO 2インキュベーター内で組織培養フラスコを置く。 </li><li> 2時間後、nanoparを交換DMEMでメディアを含むticle。 </li><li> 37℃、5％CO 2でさらに2時間インキュベートした後、細胞を、 インビボ注射の準備ができている。 </li></ol> 4。後肢虚血手順<ol><li>すべての実験は、スタンフォード大学の動物実験委員会のガイドラインおよび承認されたAPLACプロトコルに従って行った。後肢虚血のマウスモデルは、前述のように行われて生成する。8詳細な手順については、リファレンスを参照してください。簡単な説明を以下に提供される。 </li><li>吸入および1L /分の酸素流量で1〜3％の投薬イソフルラン麻酔下でマウスを置きます。つま先のピンチ、呼吸数の減少、および嗜眠で麻酔深度を確保する。 </li><li>腹部やシェービングクリームとマウスの両方の後肢領域から毛を削除します。 </li><li>正中線に向かって大腿内側の中心に切開を加えてから、元に脂肪パッドの上に位置を切断大腿動脈を提起する。 </li><li>遠位部位（膝に近い）と近位サイト（鼠径靭帯のすぐ遠位）：2サイトで動脈を結紮。 </li><li>ライゲーションを作成するには、静脈から動脈を分離し、動脈の周り5-0絹縫合糸を通します。ライゲーションを作るために2ノットで動脈を縛る。 </li><li> 2ライゲーション点間の動脈を削除します。 </li><li> PBSで手術領域を洗浄した後、縫合する切開を閉じた。 </li><li>麻酔は削除することができます。再覚醒するまで、マウスを暖かく保つ。術後ケアのために、2〜4 mg / kgのリドカインは、切開部位に皮下再覚醒する前に注入することができる。さらなる疼痛管理は、12および24時間後に0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィンの皮下送達を含むことができる。呼吸パターン、明白な痛みや苦痛、そして皮膚の色の変化を観察することにより、7日間、一日一回のマウスの健康状態を監視します。 </li><li>レーザードップラー血流イメージングにより後肢虚血​​を確認してください。</li></ol> 5。細胞注射<ol><li>トランスフェクションされた細胞とマウスの準備が整ったら、トリプシン処理し、PBSでトランスフェクトした細胞を洗浄し、遠心分離した後、カウントされます。 </li><li> PBS中ml当たり10×10 6細胞の密度で細胞を再懸濁。 </li><li>細胞懸濁液を110μLの容量で別々のエッペンドルフチュー​​ブに分離してください。これは、各マウスは、細胞の等量を受け取ることを保証する。 </li><li>麻酔下で、各マウスを置き（2.5％イソフルラン、1L /分の酸素流量）。 </li><li>アルコール綿で注射部位を清掃してください。 </li><li> 27のGツベルクリン注射器を利用して、均質な懸濁液が得られることを確認するために注射器には、上下のセルを描画します。シリンジ内に細胞懸濁液容量を100μlを策定。 </li><li>内転筋領域に半細胞懸濁液を注入した後、ふくらはぎの筋肉領域に他の半分を注入する。注入時には、少なくとも15〜30秒のための場所に注射器を残す細胞懸濁液の漏出を防ぐ。 </li><li>動物実験のための適切なコントロールには、次のとおりです。2）細胞単独; 1）非コードプラスミド（生物学的活性を持つ例えば 、プラスミド）でトランスフェクションした細胞を、3）PBS。 </li><li>注射が完了したら、麻酔からマウスを削除し、マウスの再目覚めるまで暖かい保つ。 </li></ol> 6。生物発光画像法<ol><li>生物発光イメージング（BLI）を開始するには、前述したように、マウスを麻酔。 </li><li>アルコール綿で注射部位を清掃してください。 </li><li>利用インスリン注射器、15 mg / mlでのD-ルシフェリン（ホタルルシフェラーゼの基質）の荷重を100μl。光から基板を遠ざけること。 </li><li>腹腔内注射を行うためには、彼らの前方肌がピンと張っ引っ張って自分の背中の皮膚でマウスを押したままにします。腹腔腹部に針を挿入し、基質100μlを注入。 </li><li>麻酔下でIVISルシフェラーゼイメージングチャンバー内にマウスを置きます。 </li><lI&gt; 1.0分の露光時間で画像のマウス。パラメータを設定すると、画像を取得し始める。 </li><li>画像が取得されると、ルシフェラーゼシグナルを測定するように関心領域をマークする。この場合において、細胞注射部位に虚血肢をマーク。 </li><li>信号がピークに達し、減少し始めるまで、ルシフェラーゼシグナルごとに3〜5分を測定し続けています。これは、マウスを横切っていくつかの時間点にわたって比較のために利用される値である。 </li><li>完了すると、室及び麻酔からマウスを外します。再覚醒するまで暖かいマウスを保管してください。 </li></ol> 7。レーザードップラー灌流イメージング<ol><li>レーザードップラー灌流画像化は、以前に記載のように行われる。8手順を簡単に説明する。 </li><li>マウスによる髪へのアーティファクトを防ぐために、後肢と腹部領域の両方の上に位置する領域にきれいに剃っているあるべきイメージングドップラー前に。 </li><li>ドップラ画像に調製される場合、畝前述したように、SEに麻酔されるべきである。 </li><li>直腸温度計で体温を監視しながらホットプレート上で36℃にマウスを温める。 </li><li>非反射黒色の表面にマウスを置き、ノーズ​​コーンにより麻酔維持。マウスが均等にさらされ、その手足との背面に配置する必要があります。 </li><li>約15 CMマウスの上に、マウスの鼠径部地域に向けたセンサからレーザーポインターを向けるレーザードップラーセンサを配置します。 </li><li>マウスおよびドップラーセンサ位置にあるとき、画像は、スタートボタンを押すことによってLDPIwinソフトウェアを利用して撮影することができる。 </li><li>相対潅流測定が利益率（ROI）の領域として両方の後肢（虚血性および非虚血性）を示すことによって取ることができる。非虚血性後肢の虚血性の平均灌流の比率が相対的灌流を示します。 </li></ol> 8。組織の収穫手順<ol><li>収穫マウスTISに調製された場合組織学および/または生化学的処理のために訴訟を起こす、マウスを安楽死させなければならない。ここでは、マウスを頚椎脱臼によりマウスを安楽死して、3〜5分間、5％イソフルランに曝露することによって安楽死させている。 </li><li>後肢の遠位に腹部と近位で円周方向に後肢を取り巻く覆っている皮膚を切った。皮膚は、皮膚が足への後肢上に引き戻すことができるように、背側表面に腹側から切断される。 </li><li>肌を引き戻す際に、四肢、骨盤と大腿骨の関節で切断する鈍い切開はさみを利用することによって切断することができた。 </li><li>二つの主要な組織は、分析のために採取されています。内側転筋および腓腹筋を。 </li><li>組織学のために、凍結切片に最適な切削温度（10月）の1つまたは両方の組織を埋め込む。 </li><li>生化学分析のために、1.5mlのエッペンドルフに一方または両方の組織を収集し、少なくとも2分間液体窒素の浴中に沈める。サンプルは、することができます将来の処理のために-80℃で保存した。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、非ウイルス性、生分解性ナノ粒子を用いた治療因子を過剰発現する成体幹細胞をプログラムする方法を報告している。このプラットフォームは、例えば、虚血および癌などの、ここで幹細胞が自然に自宅できる疾患を治療するために特に有用である。9-10さらに、非ウイルス遺伝子送達プラットフォームは、ほとんどの組織再生および創傷に適した、治療因子の一過性過剰発現を可能にする治癒過程。トランスフェクション法は、細胞への効率的なDNAのエントリに依存し、一般的には、非分裂細胞でも同様ではない積極的に分裂細胞型でうまく動作しますが、。 PBAEポリマーのトランスフェクション効率は、細胞型への細胞型と異なる場合があり、個別に最適化されるべきであり、さらに化学構造の改変は、特定の標的細胞集団における最適なトランスフェクション効率を達成するために探求されてもよい。上記の方法でトランスフェクト11-12細胞通常、私は結果2-4日の周りに達成されるピーク遺伝子発現を有する2週間一過性の遺伝子発現およびタンパク質分泌、nである。動物実験で20％を超えるトランスフェクション効率を有するのADSCが適していると考えられる。これは、プロセスパラメータを順番に変更されるたびに一貫性（ポリマー、プラスミドまたは細胞の、例えば新しいバッチ）を維持FACS分析を行うことが推奨される。 非分解性であり、例えばPEIおよびリポフェクタミン2000として市販されているトランスフェクション試薬と比較して、上記に報告PBAEプラットフォームで使用されるポリマーは、生分解性および臨床的な翻訳のために、より適している。このようなポリマーベクターは加水分解13分解性と光に敏感であることを考えると、注意が適切にPBAEポリマーを保存するために（-20°C、暗闇の中で、乾燥剤）不必要な加水分解や劣化を防ぐために注意が必要です。得られたポリマーは分子量分布を有し、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）mでをyさらに増大トランスフェクション効率とPBAEsを精製するために実行される。14また、ポリマー合成プロトコルの各ステップで、核磁気共鳴（NMR）を行うことが推奨される。 NMRは、その個々のコンポーネントからC32の形成を確認し、再び122 すなわちエンドキャップ基が正常に追加さを確認するために実施すべきである。注：最後の添加は基をキャッピングした後、アクリレート基はNMRスペクトルから消えるべきである。最終ポリマー中の過剰のアミン末端モノマーの存在は、したがって、それが十分に過剰のモノマーの除去を確実にするためにジエチルエーテル中で最終ポリマーを洗浄することが重要で、増加した細胞毒性をもたらし得る。上述のように、SECはまた、純度の最終生成物を促進するために使用することができる。 多くのウイルスに基づく遺伝子送達プラットフォームとは異なり、ここで使用されるポリマーベースの遺伝子送達系は、それによって挿入mの潜在的なリスクを回避する、宿主ゲノムに組み込まれないutagenesisおよび免疫原性。15〜16 記載された手順では、細胞は、コードするタンパク質および非トランスフェクト細胞を過剰発現する細胞の混合物を含有するトランスフェクション法、直後に選別することなく移植される。この手順は、細胞の最小限のex vivoでの操作を可能にし、より臨床的に翻訳可能な時間の短縮、コスト及び汚染の可能性所与である可能性が高い。細胞はまた、唯一のさらにin situで治療因子の過剰発現のレベルを向上させるためにトランスフェクトされた細胞を選択するためにさらに精製することができる。 血管形成のためのプログラムされた幹細胞の有効性は、十分に、細胞形態学的および生理学的含む複数のレベルでの成果を評価するためにアッセイの組み合わせを使用して検討すべきである。生物発光イメージングは​​、経時的な生存および移植細胞の分布のリアルタイムモニタリングを可能にする。遺伝子発現は、HARVから分析し、ested組織は、細胞の生存およびin situで符号化された遺伝的因子のアップレギュレーションの検証を可能にする。組織学的染色は、血管密度、炎症および組織再生の直接可視化を可能にする。これは、新たに形成された血管は未成熟および非機能することができるように、増大した血管密度は、常に、成功した血液灌流につながらないことに留意すべきである。したがって、レーザードップラー灌流画像化を用いて新たに生成された血管の生理学的機能を評価することが重要である。後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するために脂肪由来幹細胞を使用に焦点上記の方法は、薬物送達ビヒクルなどのプログラミング細胞の概念は、広く適用可能である。プラットフォームは、容易に、癌および筋骨格系疾患などの他の疾患の治療に関連する治療因子を過剰発現する他の細胞型をプログラムするように適合されてもよい。

この技術の全体的な目標は、虚血の部位で治療因子を過剰発現する非ウイルスプログラムされた幹細胞を用いた治療的血管新生を促進することである。幹細胞は、実験室で合成された生分解性ナノ粒子を用いてex vivoで最初に修飾し、次いで血管形成および組織サルベージを高めるためのその可能性を検証するために、後肢虚血のマウスモデルに移植した。 制御された血管増殖に成功した重要な組織再生の成分、ならびに卒中、四肢虚血、および心筋梗塞のような種々の虚血性疾患を治療するためのものである。いくつかの戦略は、成長因子の送達および細胞ベースの治療を含む血管の成長を促進するために開発されてきた。1動物疾患モデルにおいて観察された効力にもかかわらず、これらの方法は未だに不十分な成長因子の送達のための超生理学的用量の必要性などの制約に直面し、又はパラクリン細胞のみでリリースする。上記の制限を克服するための1つの潜在的な戦略は、幹細胞療法及び幹細胞が遺伝的に望ましい治療因子を過剰発現するようにex vivoで移植前にプログラムされることにより、遺伝子治療を組み合わせることである。このアプローチは、 等後肢虚血2、心疾患3、骨治癒4および神経損傷5を含む種々の疾患モデルで実証されている。しかし、ほとんどの遺伝子治療技術は、このような潜在的な免疫原性および挿入突然変異のような安全性の懸念に関連しているウイルスベクターに依存している。非ウイルス遺伝子送達媒介される生体材料は、これらの制限を克服するが、多くの場合、低いトランスフェクション効率に悩まされる可能性がある。効率的な非ウイルス性遺伝子送達のための新規な生体材料の発見を加速するために、最近の研究は、コンビナトリアルケミストリーおよびハイスループットスクリーニングアプローチを採用している。このようなポリ（β-アミノESとして生分解性ポリマーのライブラリTERS）（PBAE）は、従来の高分子のベクトルの対応に比べて格段に強化されたトランスフェクション効率を持つ大手ポリマーの発見につながっている、開発され、上映されている。6-7 ここで、我々は、後肢虚血のマウスモデルにおいて血管内皮増殖因子（VEGF）を過剰発現する遺伝子改変されたADSCのその後の移植に続いて、PBAEの合成およびインビトロで脂肪由来幹細胞（ADSCを）をトランスフェクトする能力の検証を記載。成果は、生物発光イメージングを用いて細胞の運命を追跡するレーザードップラー灌流画像（LDPI）を用いて、組織灌流を評価し、組織学により、血管新生および組織サルベージを決定することによって評価した。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td>Acronym: C</td></tr><tr><td>5-amino-1-pentanol (97 %)</td><td>Alfa Aesar</td><td>2508-29-4</td><td>Acronym: 32</td></tr><tr><td>Tetraethyleneglycoldiamine &amp;gt;99 %)</td><td>Molecular Biosciences</td><td>17774</td><td>Acronym: 122</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>G-Biosciences</td><td>R010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahyofuran Anhydrous (&amp;gt;99.9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether Anhydrous (&amp;gt;99 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO Anhydrous (&amp;gt;99.9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-Mouse CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr></tbody></table>

programming stem cells for therapeutic angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles

制御された血管増殖は、正常組織再生および創傷治癒、ならびに、例えば、脳卒中、心臓発作、または末梢動脈疾患などの虚血性疾患を治療するために重要である。血管新生増殖因子の直接送達は、新たな血管の成長を刺激する潜在能力を有するが、しばしば、標的化および生体内での半減期が短いの欠如などの制限に関連付けられる。遺伝子治療は、血管新生因子をコードする遺伝子を提供することにより、別のアプローチを提供するが、多くの場合、ウイルスを用いる必要があり、安全上の懸念によって制限される。ここでは、生分解性高分子ナノ粒子を用いてin situ での血管新生因子を過剰発現するようにプログラミング幹細胞によって血管成長を刺激するために最近開発された戦略を記載している。具体的には我々の戦略は、 インビボにおける虚血組織に向かって移動する能力を利用することにより、送達ビヒクルとしての幹細胞を利用した。最適化された高分子のベクターを用いて、脂肪由来幹細胞は、血管内皮増殖因子（VEGF）をコードする遺伝子、血管新生を過剰発現するように改変した。我々は、ポリマー合成、ナノ粒子形成、 インビトロで幹細胞をトランスフェクトするだけでなく、マウスの後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するVEGFを発現する幹細胞の有効性を検証するための方法のためのプロセスを説明した。

一緒に混合すると、正に帯電したポリマー（C32-122）及び負に荷電したDNAプラスミド自己集合ナノ粒子に変換する。 C32-122とプラスミドDNAとの間の複合体形成は、電気泳動中にDNAの動員を防止する、すなわち 、ナノ粒子の形成は、電気泳動分析を通じて確認することができる。ポリマーは、標的細胞へのDNAの増強された取り込みおよびコードするタンパク質のその後の発現（ 図2）を容易にするために、トランスフェクション試薬として機能する。細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）および蛍光顕微鏡法（ 図3）を用いて高効率を有するポリマーベクター設計およびトランスフェクション条件の迅速な最適化を容易にするために、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの任意の治療遺伝子またはレポーターDNAでトランスフェクトすることができる。 ADSCをするために、20％以上の効率が適切であると考えている。 細胞運命ポストtransplantaの追跡を容易にするTiONから、細胞は、安定的に非侵襲的生物発光イメージング（BLI）を用いて、in vivoでの細胞生存率および分布のリアルタイムモニタリングを可能にするルシフェラーゼで形質導入することができる。 BLIイメージングは、移植された細胞は、数日間の注射部位に残っており、我々は21の過程で、他の組織や臓器に向けて顕著な細胞遊走を守らないことを示し、後肢（ 図4、左パネル）から高強度の発光シグナルを示した日。一般的なセル信号は、残業の減少、ほとんどの移植された細胞は、最大2週間の治療因子を過剰発現するために利用可能であることを示唆し、14日間（ 図4、右パネル）まで続いた。 ドップラー画像は、虚血性四肢への血液灌流のリアルタイムモニタリングを可能にする有用なツールである。 図5の左側のパネルには、虚血誘導後の血流の代表画像です。暗い領域は、大成功を示している手術後の血流の遮断sful。 図5の右側のパネルには、14日、トランスフェクトされた細胞を用いた治療後の四肢の完全な再灌流を示している。 上述した技術は、リアルタイム定量化を可能にし、追加のエンドポイントを徹底的に治療効果を調べるために解析と結合されるべきである。移植細胞を受けた筋組織は、遺伝子発現及び組織学的分析のために、異なる時点で回収することができる。 RT-PCRは、トランスフェクトされた細胞において、数日後に移植を、遺伝子のアップレギュレーションを確認するために後肢における遺伝子発現を定量するために使用することができる。 図6は、PBSを注射またはのADSCを発現するVEGFを注入し、未処理の肢におけるVEGF発現を示す。結果はさらに、移植された細胞の生存の証拠を提供する、非ウイルストランスフェクションした細胞におけるVEGFの上方制御4日後に移植して確認します。 組織学外科染色は組織形態および組織再生の程度の直接可視化を可能にする。血管密度のための組織学的分析は、血液灌流（ 図7）の有効性を評価するためドップラー画像データと結合することができる。そのようなH＆Eのような組織形態染色およびマッソントリクローム染色は、組織再生または壊死の程度を評価するために有用である。壊死組織は、多くの場合、実質的な組織線維症またはマクロファージなどの炎症細胞数の増加を示し、一方、正常に新しく再生された筋肉組織は、中央に位置する核を有する筋細胞によって特徴付けられる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig1.jpg" /> 図1。概略ポリ（β-アミノエチル）エステル（PBAE）系ベクターC32-122の合成を示す。（A）アクリル化は、C32-Acをdiacrylatを有するモノマーとの間のマイケル付加反応により形成された末端電子末端基（C）および第一級アミン末端基（32）を有するモノマー。 （B）エンド変性PBAEポリマーは、強化されたトランスフェクション効率のためのアミン末端単量体を添加することにより形成することができる。 （C）Tetraethyleneglycoldiamine（122）は、端末アミンモノマーとして選ば ​​れました。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50736/50736fig1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig2.jpg" /> 図2。生分解性高分子ナノ粒子の形成の概略図、およびタンパク質発現のためのそれらのその後の細胞のアップテイクプロセス。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig3.jpg" /> 図3。緑色蛍光タンパク質（GFP）を過剰発現するヒト脂肪由来幹細胞を、トランスフェクションは、C32-122およびGFPプラスミドDNAを用いて形成されたポリマーナノ粒子を用いて行った。スケールBAR：200ミクロン。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig4.jpg" /> 図4。マウスの後肢に、GFP-ルシフェラーゼ陽性の脂肪由来幹細胞を注入した後、代表生物発光イメージング（BLI）0日目のマウスの肢のデータ（左パネル）、および14日目（右パネル）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig5.jpg" /> 図5。 14日、VEGFを過剰発現する脂肪由来幹細胞（右パネル）の注射後0日目（左パネル）でのマウス後肢の片側における虚血の誘導、および成功した血液の再灌流を示す代表的なドップラー画像。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig6.jpg" /> 図6。 その場で符号化された治療因子の細胞生存および過剰発現を確認するために、組織は、遺伝子exprで注射部位から採取することができるession分析。全く発現がPBSコントロールで検出されなかったRT-PCRは、4日間、細胞注射後処置群（ADSC-VEGF）は、VEGFが正常にアップレギュレーション、符号化された治療用タンパク質を確認した。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50736/50736fig7.jpg" /> 図7。代表的外科処置後28日目の抗CD31染色により毛細血管密度を実証した免疫組織化学画像スケールバー：100μmである。

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Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

我々は、生分解性高分子ナノ粒子を用いて、血管新生のための治療因子を過剰発現するためのプログラミング幹細胞の方法を記載している。記載された方法は、 インビトロで脂肪由来幹細胞をトランスフェクトし、マウス後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するためにプログラムされた幹細胞の有効性を検証する、ポリマー合成が挙げられる。

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K ビュー.  Stanford University. 我々は、生分解性高分子ナノ粒子を用いて、血管新生のための治療因子を過剰発現するためのプログラミング幹細胞の方法を記載している。記載された方法は、 インビトロで脂肪由来幹細胞をトランスフェクトし、マウス後肢虚血モデルにおける血管新生を促進するためにプログラムされた幹細胞の有効性を検証する、ポリマー合成が挙げられる?...

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Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

後肢虚血の治療のための胚性幹細胞由来血管内皮細胞

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

生物学

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

生物工学

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

発生生物学

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically narrowed segments of coronary and peripheral arteries. Endovascular stents capable of tunable release of genes with anti-restenotic activity may present an alternative strategy to presently used drug-eluting stents. In order to attain clinical translation, gene-eluting stents must exhibit predictable kinetics of stent-immobilized gene vector release and site-specific transduction of vasculature, while avoiding an excessive inflammatory response typically associated with the polymer coatings used for physical entrapment of the vector. This paper describes a detailed methodology for coatless tethering of adenoviral gene vectors to stents based on a reversible binding of the adenoviral particles to polyallylamine bisphosphonate (PABT)-modified stainless steel surface via hydrolysable cross-linkers (HC). A family of bifunctional (amine- and thiol-reactive) HC with an average t1/2 of the in-chain ester hydrolysis ranging between 5 and 50 days were used to link the vector with the stent. The vector immobilization procedure is typically carried out within 9 hr&#160;and consists of several steps: 1) incubation of the metal samples in an aqueous solution of PABT (4 hr); 2) deprotection of thiol groups installed in PABT with tris(2-carboxyethyl) phosphine (20 min); 3) expansion of thiol reactive capacity of the metal surface by reacting the samples with polyethyleneimine derivatized with pyridyldithio (PDT) groups (2 hr); 4) conversion of PDT groups to thiols with dithiothreitol (10 min); 5) modification of adenoviruses with HC (1 hr); 6) purification of modified adenoviral particles by size-exclusion column chromatography (15 min) and 7) immobilization of thiol-reactive adenoviral particles on the thiolated steel surface (1 hr). This technique has wide potential applicability beyond stents, by facilitating surface engineering of bioprosthetic devices to enhance their biocompatibility through the substrate-mediated gene delivery to the cells interfacing the implanted foreign material.

These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.

加水分解性架橋剤を介してアデノウイルスベクターテザーを使用した金属ステント表面からの血管の遺伝子導入

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

医学

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection has been used for decades to deliver stem cells in stroke models, this technique is limited by the lack of ability to manipulate the stem cells prior to injection. This paper details a method of using an electrically conductive polymer scaffold for stem cell delivery. Electrical stimulation of stem cells using a conductive polymer scaffold alters the stem cell's genes involved in cell survival, inflammatory response, and synaptic remodeling. After electrical preconditioning, the stem cells on the scaffold are transplanted intracranially in a distal middle cerebral artery occlusion rat model. This protocol describes a powerful technique to manipulate stem cells via a conductive polymer scaffold and creates a new tool to further develop stem cell-based therapy.

This protocol describes fabrication of a cell culture system to allow seeding of stem cells on a conductive polymer scaffold for in vitro electrical stimulation and subsequent in vivo implantation of the stem cell-seeded scaffold using a minimally invasive technique.

導電性足場を調節して幹細胞を提供するには

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

糖尿病性ウサギにおける後肢虚血の前臨床モデル

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...