この作品は、アメリカ心臓協会GRAの春09ポストドクトラルフェローシップ（09POST2250268）およびNIH R01 CA097465によって部分的にサポートされています。我々は非常に腫瘍移植の彼女の援助のために博士ウェン李博士とヴィカスGulaniのMRIプロトコル·テストとセットアップのため、氏とイヴォンヌ·パーカーを高く評価しています。

プロトコルは、以前の研究11から適応。 1。 CLT1ペプチドにのGd-DOTAの結合体<ol><li>標準固相ペプチド合成を使用して、2 - クロロトリチルクロリド樹脂上のFmoc-保護アミノ酸（1.0ミリモル）からCLT1ペプチド（CGLIIQKNEC）を合成する。 </li><li>最後のアミノ酸を添加した後、2時間0℃でDMF中のタリウム（III）トリフルオロ酢酸塩（1​​.09g、2.0ミリモル、2当量）を用いて樹脂上の線状ペプチド（20ml）に環化する。 </li><li>次に、コンジュゲートPEGおよびFmoc-NH-PEG-COOH（3.0ミリモル）のFmoc-Lysのカルボニル（Fmoc）-OH（3.0ミリモル）で連続的に反応させることにより、樹脂上CLT1ペプチド（1.0ミリモル）のN末端へのリジンを順次、およびFmoc-Lysのカルボニル（Fmoc）-OH（6）の第二バッチ。 </li><li>ピペリジンでのFmocを除去します。 2時間、樹脂上のリシンデンドリマーから4本の遊離アミンと反応するDOTA-トリス（Buはt-ブチル）（4.58g、8.0ミリモル、各アミノ基に2当量）を添加する。 </li><li>最後に、生成物を切断し、脱保護樹脂からの室温で8時間、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソブチル（TIS）（20ミリリットル、95/2.5/2.5）のカクテルで処理することによって。トリフルオロ酢酸（TFA）で洗浄した濾過により樹脂を除去。合わせたろ液は、遠心分離器、冷たいエチルエーテル（200ミリリットル）に滴下追加し、エチルエーテル4Xで洗浄する。無色の固体（1.99g、61％収率）を得、真空下で乾燥させる。 </li><li> 10分間の溶媒Aで20分間、40〜90％溶媒Bのための溶媒A（0.1％TFA水溶液）中アセトニトリル（0.1％TFA）〜40％溶媒Bの勾配を使用する分取HPLCで粗生成物を精製し。 </li><li>溶解DI水中CLT1-DL-（DOTA）4（250mgを、0.077ミリモル）（15ml）および1 M NaOHを用いてpHを6に調整する。 1 M NaOHを用いてpHを6に維持しながら、溶液に少しずつのGd（OAcでの）3·H 2 O（472ミリグラム、0.462ミリモル、DOTAモノアミドに1.5当量）を添加する。 48時間RTで反応液を撹拌した。 </li><li> Eとの複合体の残存のGd（III）thylenediaminetetraacetic酢酸（EDTA）（90mg、0.31ミリモル）、及び最終製品CLT1-DL-（のGd-DOTA）4（169mg、57％）を得サイズ排除カラムで粗生成物を精製する。 </li></ol> 2。造影剤の特性評価<ol><li>誘導結合プラズマ発光分光分析とのGd（III）の含有量を測定する。 </li><li>マトリックスとして2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（2,5-DHB）を用いて線形モードで、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）質量スペクトルを取得する。 </li><li>緩和計with CLT1-デシリットル-（のGd DOTA）4コントラスト剤および非標的制御エージェント60メガヘルツ（1.5 T）少なくとも異なる濃度sCLT1-デシリットル-（のGd DOTA）4水溶液緩和時間を測定37℃で、 T 2を測定するために、500のエコーとT 1とハーンメイブーム-ギルシーケンスを測定するために、反転回復パルスシーケンスを使用しています。 T 1とTを目の2緩和を計算するGdの濃度対1 / T 1および1 / T 2のプロットの傾きから電子剤。 </li></ol> 3。同所PC3前立腺腫瘍を持つ動物モデルの細胞培養および開発<ol><li> /μlのPBS 2.5×10 4細胞の密度で、5％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン、トリプシン処理によって収穫し、再懸濁を補充したRPMI培地中で緑色蛍光タンパク質（GFP）の構成的発現を有する培養PC3前立腺癌細胞。 </li><li> CWRU機関動物実験委員会によって承認された動物プロトコルに従って胸腺欠損動物基盤施設の雄のNIH胸腺ヌードマウス（4-5週齢）、ケースウエスタンリザーブ大学（CWRU）を維持する。 </li><li>外科用表面は、2％クロルヘキシジン溶液を噴霧し、次いで、吸収性ドレープで覆った。無菌手術用手袋は、手術中に着用された。動物の手術前に、IPはanesthetizにアベルチン（250 mg / kgの）を注入マウスを電子。代替的に、ケタミン/キシラジン/アセプロマジンで50/5/1 mg / kgの濃度で使用することができる。眼軟膏は、麻酔中に十分な水分を維持するために、マウスに適用した。 </li><li>滅菌メスを使用して約1cmの長さで下正中線に沿って皮膚や腹膜を通して小さな切開を切断することにより、手術を開始します。無菌手術用ドレープは、生存の手術の際に切開部位を中心に覆われていた。 </li><li>優しく前立腺を露出させ、前立腺背側葉を体外にして安定させる。 30ゲージの針を用いて前立腺にPBS（20μL）で、PC3-GFP細胞の懸濁液を注入する。最終的に創傷オートクリップ12で切開を閉じます。 </li><li>後手順の監視については、1週間1日2回、動物を監視します。病気の兆候は食べるの欠如、尿道の周りの濃い尿の収集、およびステープルで膀胱の感染症や閉塞を示している可能性が不安定歩行が含まれています。 </li><li> 10日後、Tを削除彼は、ステープルステープルリムーバーを使用して。腫瘍サイズおよび体重減少、行動偏差、モータ欠陥などの疼痛の証拠を評価するために動物を毎日監視する。腫瘍増殖の際の痛みの倫理的に許容限度又は証拠を超える腫瘍サイズを示した動物を安楽死させる。 </li></ol> 4。蛍光イメージングおよび組織学を有するペプチドの結合特異性腫瘍の確認<ol><li>腫瘍細胞接種の後、腫瘍増殖の約4週間撮像始まる前に可能にする。ペプチドプローブの注射の前に、腫瘍の存在を確認するために、蛍光イメージャー上の生きたマウスでGFP蛍光画像を取得する。 </li><li> IVは、テキサスレッドが10ナノモル/マウスの用量で腫瘍を有するマウスにペプチドをラベル注入する。 </li><li>頸椎脱臼により2時間後にマウスを犠牲に、腫瘍および主要な器官を収集し、すぐに蛍光イメージャー上の画像。 44：GFP（励起用の緑色光フィルタを使用する4から490ナノメートル、放出：515 nmのロングパスフィルタ、取得設定：テキサスレッドための10 nmのステップで500から720）と赤色光フィルター（励起：576から621ナノメートル;放射：635nmのロングパスフィルタ;買収設定：10 nmのステップで630から800）。 GFP及びテキサスレッド、150ミリ秒10ミリ秒の露光時間。 </li><li>すぐに全体の組織蛍光を測定した後、腫瘍組織を収集し、ホルマリンで固定し、凍結切片5μmのスライスに。 </li><li> PBSですすいだ後、直ちに、共焦点レーザー走査顕微鏡に4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を含有する封入剤1滴、画像にマウントする。 </li></ol> 5。磁気共鳴イメージング（MRI） <ol><li>腫瘍細胞接種後約4週間は、腫瘍の直径が0.3〜0.6センチメートルまで成長することができます。 MRIの研究のためのボリュームの無線周波数（RF）コイルが7 T MRIスキャナを使用してください。 </li><li>イソフルラン誘導チャンバ内の2％イソフルランと酸素の混合物で、マウスを麻酔。 OPHthalmic軟膏は、麻酔中に十分な水分を維持するために、マウスに適用した。 </li><li>ヘパリン処理した生理食塩水で満たされた1.0メートルの長いチューブに30ゲージの針を挿入します。マウス尾静脈に自作のカテーテルを配置します。 </li><li>磁石にマウスを置き、ノーズ​​コーンを経由して1.5％イソフルランと酸素と吸入麻酔下に保つ。 </li><li>呼吸の速度と深さを監視するための腹部に監視システムに接続され、呼吸センサーを配置します。フィードバック制御システムを介して磁石に熱風を吹き込んで、37℃で体温を維持する。 </li><li>腫瘍の位置（TR / TE = 200/3.7ミリ秒、FOV = 3.0センチメートル、スライス厚= 2.2ミリメートル、2 =平均スライス数= 16、フリップ角度= 45°を識別するために局在化配列を用いてサジタル断面画像で始まるマトリックス= 128×128）。 </li><li> CE-MRI（TR / TE = 151.2/1.9ミリ秒、FOV = 3.0センチ×3.0センチメートル、用2Dアキシャル画像を取得するために2次元T1強調勾配脂肪抑制シーケンスを使用して、Sシラミ厚さ= 1.2ミリメートル、スライス番号= 12、平均= 1、フリップ角= 80°、マトリックス= 128×128）。 </li><li>注入前のベースラインMR画像の取得後に、生理食塩水200μlでフラッシュすることにより0.03ミリモルのGd / kgの用量で標的化剤または抑制剤を注入し始める。 </li><li>最大30分間、異なる時点でCE-MRI画像を取得し続ける。 </li></ol> 6。画像処理と解析<ol><li>画像解析のためのイメージングソフトウェアを使用してください。 </li><li> 2次元の撮像面に全腫瘍の上の関心領域（ROI）と腎臓を引き出し、平均信号強度を測定する。 </li><li> （S 0 - ΔSNR=（S トン/σt）は ：CE-MRIデータを定量化するために、以下の式を用いて造影前SNRオーバー造影後SNRの増加を計算することによって、腫瘍または腎臓コントラスト強調（ΔSNR）を測定/σ0）、S 0、SはTタムの信号を表す場合、またはまたはコントラスト前と後の腎臓、σ0、σtは 、コントラストの前後背景空気から測定されたノイズの標準偏差である。 </li><li> 、p &lt;0.05で統計的有意性を仮定し、スチューデントの両側t検定を用いてp値を計算する。 </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resin-coupled+cyclic+peptides+as+proteinase+inhibitors.">Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors.</a> Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).</li><li>Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+method+for+facile+intramolecular+disulfide+formation+in+synthetic+peptides.">General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

重要なステップ 適切なバイオマーカーの選択と小ペプチドをターゲットに 正常に小さいサイズを有する標的化造影剤を開発するために、2つの重要な点を考慮する必要がある。第一に、正常組織にはほとんど存在感のある病変組織に豊富に存在する適切な分子バイオマーカーを選択することが重要である。私たちの選択された癌関連バイオマーカー、凝固した血漿タンパク質は、この要件を満たしています。十分な造影剤が十分なコントラスト増強をもたらす、これらの標的に結合することができるように、第2の、選択された標的小分子薬剤は、バイオマーカーに対して高い結合親和性を有するべきである。本研究では、腫瘍の11中の凝固した血漿タンパク質への結合の強い特定を示しているクロット結合ペプチドCLT1を選びました。 エージェント合成コントラスト ペプチド合成は、牛を含む最終的な巡回CLT1ペプチドを形成するために、線状ペプチド分子内に2個のチオール基をidizing。ペプチド環化は通常、潜在的な集約、二量体化およびオリゴマー化を最小限に抑えるために、低濃度の溶液中で実施される一方で、樹脂上環化は、擬似希釈現象だけでなく、簡単な洗浄および濾過13による試薬の除去を利用しています。私たちの合成手順では、我々はそれを処理しながら、タリウム（III）トリフルオロ酢酸は、非常に毒性が世話しているが、高収量の少ない二量体化でうまく動作トリフルオロ酢酸タリウム（III）を使用して、樹脂上環化が行われなければならないことがわかります。第二のアプローチは、低いペプチド濃度で溶液中の20％DMSOを使用する。しかし、より多くのステップはDMSOを除去するために必要であり、大容量の溶液を凍結乾燥すると、時間がかかる。いずれの方法を用いることで、分子内ジスルフィド結合の完全な形成を確認するために重要である。 Gdを有するペプチドリガンドを複合すると、遊離チオールを誘導することができる実質的な集計緩衝液中の微量金属は、重合14を形成するシステインの過酸化を生じ、空気酸化を触媒するからである。これは通常、劇的に最終生成物の収率および純度を低下させる。必ず完全なジスルフィド帯形成を行うには、まず、二量体以上のオリゴマー形成を生じる分子間ジスルフィド結合の形成を回避するために、穏やかな酸化条件を使用する必要がある。第二に、十分な長さ、反応時間は、すべてのチオール基がGdの共役工程の前に酸化されることを確認するために維持されるべきである。 マウス尾静脈の動物モデルおよびカニューレ挿入 動物腫瘍モデルおよび尾静脈カニューレ挿入の調製は、この手順の非常に重要な側面である。手術中に、ツール/ベンチはマウスを傷つけたり殺すことができる潜在的な感染を防ぐために、清潔で無菌に保つ必要があります。 injec前後にマウスを移動回避するためにTiONから、それは、マウスの尾静脈にカニューレを挿入する必要がある。 、カニューレ挿入用のカテーテルを準備ハブから30ゲージの針を壊し、1.0メートルの長いチューブに平滑末端を挿入し、1％のヘパリン化生理食塩水でロードされた注射器にチューブの他端を接続します。チューブを埋めるために、注射器を押してください。温水（〜105°F）で尾を拡張。静脈に針を挿入します。チューブに血液の逆流は、カテーテルの挿入が成功したことを示します。針が静脈にあることを確認するには、ゆっくりとシリンジと生理食塩水をスムーズに注入することができるを押し、静脈に生理食塩水を少量注入してクリアされます。スキャナにマウスを移動する前に、テープでカテーテルを固定します。 制限事項および可能な変更 我々の現在の研究では、いくつかの制限があります。まず、予備的な結果から、我々はそれがshをもののCLT1が標的のサイトから非常に迅速に行わ洗うことに気付く腫瘍への結合の優れたOWS。 インビボタンパク質分解は、おそらくCLT1の不安定性の原因となる。タンパク質分解から保護するCLT1の改変は、その安定性を向上させ、その生体でのウォッシュアウト時間を長くする必要があります。天然のL-型アミノ酸を置換するD型アミノ酸を使用すると、この目標を達成するための潜在的な戦略である。第二に、現在の研究では、CLT1ペプチドが特異的に結合凝固血漿タンパク質のどの正確なコンポーネントを明確にしていません。最後に、我々は、主に、比較的低い収率と高いコストで固相合成を用いて造影剤を合成する。液相合成法の開発は、収率を向上させ、コストを下げるべきである。 アプリケーション 私たちは、造影MRIと小さな悪性腫瘍を正確に検出する技術を開発している。標的薬剤とのMRIは、がんの分子イメージングのためのより効果的で安全な代替手段を提供します。

癌に関連する分子標的の有効撮像は、以前の癌の検出および診断の精度を向上させるために非常に重要である。磁気共鳴イメージング（MRI）は、高空間分解能なし電離放射線1を備えた強力な臨床イメージング様式である。ただし、対象となる造影剤は、臨床MRがん分子イメージングのため利用できません。目標とMRI造影剤の革新的なデザインと開発は大幅にMRがん分子イメージングの応用を進めるだろう。かなりの努力が、癌細胞の表面に発現されるバイオマーカーのMRイメージングのための標的造影剤の開発がなされてきた。によるMRI及びこれらのバイオマーカーの低濃度の比較的低い感度のために、小さな分子標的造影剤2,3を用いた効果的なMR分子イメージングのための十分なコントラスト強調を生成することが課題である。十分な増強を得るために、種々の送達系の成功常磁性のGd（III）キレートの高いペイロードを有するリポソーム、ナノ粒子及びポリマー結合体としてのhは、標的部位での4,5造影剤の局所濃度を増加させるために調製されている。これらの送達システムは、動物モデルにおいて有意な腫瘍増強を生成することができたが、それらの大きなサイズは、重大な安全上の懸念6原因となり、毒性のGd（III）イオンの長期蓄積をもたらす、身体からゆっくりと不完全な除去をもたらした。最近、いくつかの研究は、分子イメージングのためのMRIの限界が高い局所病変において発現と適切な分子バイオマーカーを選択し、容易に7,8排泄することができる小分子薬剤を使用することによって克服することができることを示している。これらの薬剤の重要な特徴は、正常組織にはほとんど存在感のある病変組織に豊富に存在する分子マーカーを標的としていることである。造影剤の高い濃度が十分に得られ、これらの標的に結合することができる効果的なMR分子イメージングのための効率の良いコントラスト強調。それらのサイズは腎臓濾過閾値よりも小さいので、結合していない造影剤は、容易に縮小背景ノイズが体内から排出することができる。私たちは、豊富に腫瘍間質に存在する凝固血漿タンパク質を、普遍的な癌関連バイオマーカーを選択し、まれに正常組織9に存在していない。我々は、強力なPC3前立腺腫瘍モデル10への特異的結合、および4つのGd-DOTAモノアミドキレートを示し、小さな標的化ペプチドCGLIIQKNEC（CLT1）を含む標的化造影剤を合成した。ここでは、マウスにおいて腫瘍を検出するためのMR癌分子イメージングのための方法を提供する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fmoc protected amino acids</td><td>EMD Chemicals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-tris(&lt;em&gt;t&lt;/em&gt;-Bu)</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyBOP, HOBt, HBTU</td><td>Nova Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red, succinimidyl ester, single isomer</td><td>Invitrogen</td><td>T20175</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPMENTS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agilent 1100 HPLC system</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICP-&amp;#8211;S Optima 3100XL</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometer</td><td>Bruker</td><td>AutoflexTM Speed</td><td></td></tr><tr><td>Maestro FLEX In Vivo Imaging System</td><td>Cambridge Research Instrumentation, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biospec 7T MRI scanner</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mr molecular imaging of prostate cancer with a small molecular clt1 peptide targeted contrast agent

腫瘍細胞外マトリックス分子イメージングは​​、癌のバイオマーカーとして使用することができる癌関連タンパク質の存在量を有する。本研究では、腫瘍間質内凝固した血漿タンパク質に特有の標的MRI造影剤としてのGd-DOTAモノアミド複合体の標的小分子のペプチドを用いた効果的なのMRがん分子イメージングを示した。我々は、マウス同所性PC-3前立腺癌モデルにおけるMRIによる前立腺腫瘍の非侵襲的検出のための薬剤の有効性を評価する実験を行った。標的化造影剤は、0.03ミリモルのGd / kgの低用量で有意な腫瘍コントラスト強調を生成するのに有効であった。ペプチド標的化MRI造影剤は、前立腺腫瘍のMR分子イメージングのために有望である。

図1は、標的化造影剤CLT1-DL-（のGd-DOTA）4、実験の全体的なスキームの合成を示す。 CLT1-DL-（GD-DOTA）4臨床のGd-DOTA（表1）よりもはるかに高い緩和度を示しています。 1.5 Tで、PBS（pH7.4）中CLT1-DL-（のGd-DOTA）4のガドリニウム当たりのT 1緩和度のGd-DOTA 10のそれよりも約3倍高い。マエストロイメージングは、非特異的ペプチド（sCLT1-TR）をスクランブルしながら、テキサスレッドの強い特異的結合（ 図2）はほとんど腫瘍が結合を示す、正常な臓器や組織にはほとんど結合して腫瘍へCLT1（CLT1-TR）をラベルを確認します。 図3は、典型的なプレを示し、拡張後噴射コントラスト（CE）T 1強調画像。標的化剤は、非標的化スクランブル剤と比較して、腫瘍組織においてより長く増強をもたらす。膀胱におけるコントラスト強調が徐々とともに増加時間、造影剤は、腎臓濾過を介して排泄されたことを示す。定量的な信号解析は、標的薬剤が30分まで調整剤よりも腫瘍組織においてより有意な信号増強した（p &lt;0.05）を生じたことを明らかにしている。生体内分布の研究では、エージェントが2日、注入後の主な器官や組織における最小限のGd保持を持って示しています。我々の予備データは、CLT1は、MRI造影剤は特異的に、比較的低用量（臨床用量の三分の一）で、腫瘍に送達することができる標的とすることを示している。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> R 2（mMの-1。S -1） </td><td colspan="2"> R 1（mMの-1。S -1） </td><td rowspan="2"> GDの内容（ミリモル-GD / G） </td></tr><tr><td></td><td> あたりのGd </td><td> 1分子当たり </td><td> あたりのGd </td><td> PER分子</td></tr><tr><td> CLT1-（GD-DOTA）4 </td><td> 10.1±1.0 </td><td> 40.4±3.0 </td><td> 13.0±3.1 </td><td> 52.0±9.6 </td><td> 1.05±0.10 </td></tr><tr><td> sCLT1 - （GD-DOTA）4 </td><td> 11.5±1.4 </td><td> 46.​​0±5.0 </td><td> 12.4±0.3 </td><td> 49.6±1.3 </td><td> 0.97±0.08 </td></tr><tr><td> GD-DOTA 4 </td><td> 2.9 * </td><td> 2.9 * </td><td> 3.2 * </td><td> 3.2 * </td><td></td></tr></tbody></table> 表1。 1.5 Tを対象とスクランブルMRI造影剤の物理化学的特性、37℃（37℃の水中でのGd-DOTAのための*緩和は参考10からのもの）。 <img alt="図1" width="600px" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50565/50565fig1highres.jpg" /> &gt; 図1。合成手順と全体的な実験のグラフ表示。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50565/50565fig1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" width="600px" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50565/50565fig2highres.jpg" /> 図2。 CLT1-Trの結合腫瘍。 CLT1-TR（A）および非標的sCLT1-TR（B）目標が10ナノモル/マウスの用量で同所性PC3-GFP前立腺を有する無胸腺ヌードマウスに静脈内注射した。2時間後、腫瘍および様々な器官を回収した画像化した。緑色蛍光画像は、PC3-GFP腫瘍細胞由来である。赤色蛍光イメージはCLT1-TR（A）及びsCLT1-TR（B）プローブからである。 1。腫瘍; 2。脾臓; 3。心; 4。腎臓、5。睾丸; 6。肝臓、7。肺; 8。筋肉; 9。脳。565fig2highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図3" width="600px" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50565/50565fig3highres.jpg" /> 図3。代表的なT1強調軸2D勾配同所PC-3ヒト前立腺腫瘍の画像CLT1-DL-（のGd-DOTA）4（A）及びsCLT1-DL-（のGd-DOTA）4（B）の静脈内注射前および後にNU / NUマウスでの0.03ミリモルのGd / kgであった。緑色の円で標識赤い円と膀胱で標識腫瘍。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50565/50565fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。

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MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

mr-molecular-imaging-prostate-cancer-with-small-molecular-clt1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Case Western Reserve University. マウス前立腺癌モデルにおける腫瘍間質内の凝固した血漿タンパク質に特異的な小ペプチド標的化MRI造影剤を用いてMR癌の分子イメージングを実証した。 

ビデオ: MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have emerged in conjunction with the state-of-the-art positron emission tomography with 18F-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG PET). 13C magnetic resonance spectroscopic imaging (13CMRSI) is a minimally invasive imaging method that enables the monitoring of metabolism in vivo and in real time. As with any other method based on 13C nuclear magnetic resonance (NMR), it faces the challenge of low thermal polarization and a subsequent low signal-to-noise ratio due to the relatively low gyromagnetic ratio of 13C and its low natural abundance in biological samples. By overcoming these limitations, dynamic nuclear polarization (DNP) with subsequent sample dissolution has recently enabled commonly used NMR and magnetic resonance imaging (MRI) systems to measure, study, and image key metabolic pathways in various biological systems. A particularly interesting and promising molecule used in 13CMRSI is [1-13C]pyruvate, which, in the last ten years, has been widely used for in vitro, preclinical, and, more recently, clinical studies to investigate the cellular energy metabolism in cancer and other diseases. In this article, we outline the technique of dissolution DNP using a 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer and demonstrate its usage in in vitro studies. A similar protocol for hyperpolarization may be applied for the most part in in vivo studies as well. To do so, we used lactate dehydrogenase (LDH) and catalyzed the metabolic reaction of [1-13C]pyruvate to [1-13C]lactate in a prostate carcinoma cell line, PC3, in vitro using 13CMRSI.

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

過分極<sup&gt; 13</sup&gt; C代謝磁気共鳴分光法とイメージング

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

がん研究

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.

Diffuse fluorescence tomography offers a relatively low-cost and potentially high-throughout approach to preclinical in vivo tumor imaging. The methodology of optical data collection, calibration, and image reconstruction is presented for a computed tomography-guided non-contact time-domain system using fluorescent targeting of the tumor biomarker epidermal growth factor receptor in a mouse glioma model.

癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

医学

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

プレターゲッティングPETイメージング用バイオ直交逆電子需要ディールスアルダー環化を活用

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

生物工学

Radiosynthesis and PET/CT Imaging of 68Ga-Labelled Nanobody in Xenograft Models

Radiosynthesis, Quality Control, and Small Animal Positron Emission Tomography Imaging of 68Ga-Labelled Nano Molecules

Small animal Positron Emission Tomography (PET) and Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) imaging techniques are crucial in preclinical cancer research, necessitating meticulous attention to radiotracer synthesis, quality assurance, and in vivo injection protocols. This study presents a comprehensive workflow tailored to enhance the robustness and reproducibility of small animal PET experiments. The synthesis process in the radiochemistry laboratory using 68Ga is detailed, highlighting stringent quality control and assurance protocols for each radiotracer production. Parameters such as concentration, molar activity, pH, and purity are rigorously monitored, aligning with standards applicable to human studies. This methodology introduces streamlined syringe preparation and a custom-designed 30G cannula for precise intravenous injections into mice. Monitoring of animal health during scanning, including temperature and heart rate, ensures their well-being throughout the procedure. Dosages for PET and SPECT scans are predetermined to balance data acquisition with minimizing radiation exposure to animals and researchers. Similarly, CT scans employ pre-programmed settings to limit radiation exposure, especially pertinent in long-term studies assessing treatment effects. By optimizing these steps, the workflow aims to standardize procedures, reduce variability, and enhance the quality of small animal PET/SPECT/CT imaging. This resource provides valuable insights for researchers seeking to improve the accuracy and reliability of preclinical investigations in molecular imaging, ultimately advancing the field.

This paper describes the radiosynthesis, formulation, quality control of a new radiolabeled probe (i.e., 68Ga-labeled nanobody NM-02), and its use for small animal PET/CT imaging in a xenograft model.

Small animal Positron Emission Tomography (PET) and Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) imaging techniques are crucial in preclinical ...

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe targeting the fibroblast activation protein for positron emission tomography imaging of the tumor microenvironment. The reaction conditions involved acetate buffer (final concentration: 0.1 M), methionine as an anti-radiolysis agent (final concentration: 5.4 mg/mL), and 30 &#181;g of 3BP-3940, with heating for 8 min at 98 &#176;C. A final purification step on a C18 cartridge was necessary to obtain a radiolabeled product of high purity. In contrast, the generator-produced 68Ga was used directly without a concentration step on a cation exchange cartridge. The production of three validation batches confirmed the method&#39;s reliability, allowing the synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 in 22.3 &#177; 0.6 min with high radiochemical purity (RCP), as determined by both radio-HPLC (99.1% &#177; 0.1%) and radio-TLC (99.2% &#177; 0.1%). The average radiochemical yield, based on RCP values measured by radio-HPLC, was 74.4% &#177; 3.3%. The stability of the radiolabeled product was demonstrated for up to 4 h after preparation. This protocol provides a reliable, rapid, and efficient methodology for the preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940, which can easily be transposed to a clinical setting.

This research describes the automated process for [68Ga]Ga-3BP-3940 production with the GAIA V2 synthesizer, for PET imaging of fibroblast activation protein. The results of quality control tests performed on three test batches are also presented.

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

化学

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of MRI-ultrasound Fusion to Achieve Targeted Prostate Biopsy

Here, we present a protocol to perform targeted prostate biopsy using a magnetic resonance imaging-ultrasound (MRI/US) fusion system. Prostate cancer has traditionally been diagnosed via transrectal ultrasound (TRUS) biopsy. Though considered the gold standard, TRUS is unable to visualize most prostate cancer lesions and therefore requires sampling of the entire prostate. This biopsy method often undergrades prostate cancer and fails to detect up to 35% of cancers on initial biopsy. Prostate MRI has been shown to have excellent sensitivity in the detection of cancerous lesions, and advancements in MRI technology during the last decade have led to the development of targeted biopsy. In targeted biopsy, a software platform overlays MRI data onto live TRUS images to create a fused MRI/US three-dimensional model of the prostate. Regions suspicious for malignancy on MRI are contoured by a radiologist, uploaded into the fusion system, and then displayed within the live MRI/US fused model. The urologist is then able to directly biopsy these targets. When compared to conventional TRUS biopsy, MRI/US fusion technology has been demonstrated to improve the detection of clinically significant cancer while reducing insignificant cancer detection. This technology, therefore, has the potential to diagnose prostate cancer primarily in men who would benefit from treatment.

Presented herein is a protocol to perform targeted biopsy of the prostate using an MRI-ultrasound fusion system.

対象となる前立腺生検を達成するために MRI 超音波核融合の使用

Here, we present a protocol to perform targeted prostate biopsy using a magnetic resonance imaging-ultrasound (MRI/US) fusion system. Prostate cancer has ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

生物学

A Cognitive Fusion-guided Prostate Biopsy Using Multiparametric Magnetic Resonance Imaging and Transrectal Ultrasound

Traditional transrectal ultrasound (TRUS)-guided prostate biopsy has limited sensitivity and specificity, particularly for detecting early-stage prostate cancer, due to a lack of precise lesion targeting. An improved cognitive fusion-guided prostate biopsy method has been developed to enhance lesion targeting by integrating three parameters of prostate multiparametric MR (mpMRI) images into TRUS images. Prostate mpMRI measurement is initially performed to obtain three key parameters: the rotation angle (&#945;), the distance from the rectal wall (X), and the distance from the prostate apex (Y). These parameters are then cognitively applied in real-time, TRUS-guided prostate needle biopsy to detect target lesions. This improved transperineal cognitive fusion biopsy method enhances diagnostic accuracy, improves reproducibility, and reduces reliance on operator experience. Clinical application in 423 patients demonstrated a prostate cancer detection rate of 73.5%, with 62.9% classified as clinically significant cancers. Compared with equipment-intensive methods such as MRI-ultrasound fusion biopsy, this approach is cost-effective, practical, and well-suited for broader clinical adoption. Additionally, the method&#39;s flexibility supports integration with other imaging techniques, such as 68Ga-PSMA PET/CT, further improving detection rates for patients with high-risk prostate cancer.

Prostate biopsy is the gold standard diagnostic method for prostate cancer. Cognitive fusion-guided prostate biopsy, which combines transrectal ultrasound with pre-measured MRI parameters, improves biopsy accuracy and enhances the detection rate of clinically significant prostate cancer.

マルチパラメトリック磁気共鳴画像法と経直腸超音波を使用した認知融合ガイド下前立腺生検

Traditional transrectal ultrasound (TRUS)-guided prostate biopsy has limited sensitivity and specificity, particularly for detecting early-stage prostate ...

低分子CLT1ペプチド標的造影剤を用いて前立腺がんの分子イメージングのMR

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