この作品は、健康補助K08 NS061039-01A2の国立研究所、ミシガン大学の神経学研究·ディスカバリー、およびA.アルフレッド·トーブマン医学研究所のためのプログラムによってサポートされていました。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P90 DK-20572の国立研究所によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析コアを使用していました。著者らは、侵害受容性バイオマーカーの免疫組織化学技術の初期開発をサポートするために、人間の皮膚のサンプルの彼らの寛大な寄付のためにロビンソンシングルトンとゴードン·スミス（ユタ大学）に感謝したいと思います。

パート：免疫組織化学バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クライオスタットに厚さ50μmのセクションに区分に埋め込まれ、最大1週間のために4で20％グリセロール°Cとリン酸緩衝食塩水（PBS）で凍結保護されています。以下に説明するプロトコルは、8皮膚切片ワン96ウェルプレートに浮遊免疫組織化学を受けることが可能な皮膚切片の最大数に設計されている。 1日目： 1。角質層非特異免疫反応の防止<ol><li>ラベル96ウェルプレート、 図1に示すように。 </lI&gt; <li>画像-IT 96ウェルプレートの1行目の各ウェルにバックグラウンド染色11,12を遮断するための効果的なFX信号（画像-IT）、150μlのを追加します。 </li><li> 96ウェルプレートの2行目と3で各ウェルに1×PBSを150μlを加える。 </li><li> DLで撮影生から1セクション、PTで取ら生から1セクション：患者ごとに2つの50μmのセクションを取得します。接種ループ（LeLoop）は形態的損傷を避けるために、次へのすすぎ1からセクションを転送するために使用されます。そっと画像-ITを含む、よく行1の個体に、接種ループを使用して、各50μmのセクションを転送します。フラットロッカーで室温で30分間画像-ITのセクションをインキュベートする。 </li><li>室温で10分間1X PBS（行2と3）で2回のセクションをすすぐ。リンスの間にフラットロッカーにウェルプレートを置きます。 </li></ol> 2。 5％BSAブロッキング溶液と1％のリンス液の調製<ol><li>生検のセクションでは、画像-ITでインキュベートされていますが、ソリューションをブロック5％を準備る（5％BSAが完全に溶解するまでBSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦溶液）。 </li><li> 4行目の各ウェルに5％BSAブロッキング溶液150μlのを追加します。 </li><li>接種ループを使用して、5％BSAブロッキング溶液の個々のウェル内にセクションを転送します。フラットロッカーで室温で1〜2時間で5％BSAブロッキング溶液内のセクションをインキュベートする。 </li></ol> 3。一次抗体の1％BSAリンス液と希釈の調製<ol><li>のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液（1％BSA、0.3％TX-100、0.1 M PBS-渦解をBSAが完全に溶解するまで）をご用意。 </li><li>のセクションでは、5％BSAブロッキング溶液でインキュベートされていますが、1％のリンス液に一次抗体を希釈。 <ol><li> 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。一次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。 </li><li>一次抗体の希釈：PGP、1:500; TrkのA、1％BSAリンス液で1:500。 </li></ol></li></ol> 4。一次抗体に区画検のインキュベーション<ol><li> 96ウェルプレート（5行目）の指定されたウェルに希釈した一次抗体を150μlを加える。 </li><li>指定されたプライマリ抗体井戸（5行目）に5％ブロッキング溶液（行4）からセクションを転送します。 </li><li>乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。 </li><li>フラットロッカーで96ウェルプレート4でO / N°Cをインキュベートする。 </li></ol> 2日目： 5。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ<ol><li>各行6でよく、図7、図8に1％BSAリンス液を150μlを加える。 </li><li> RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列6,7、および8）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。 </li></ol> 6。二次抗体の希釈 &lt;OL&gt; <li> 1％BSAリンス液（行8）のすすぎセクションが最後でインキュベートされているが、1％BSA溶液でリンス二次抗体を希釈する。 <ol><li> 8つのセクション（8×150μlを= 1,200μl）を、1,200μlの合計が必要です。二次抗体は1,500μL（約20％の余分なボリューム）で構成されています。 </li><li>二次抗体の希釈液：1％BSAリンス液でTrkのA（アレクサフルーア647ロバ抗ヤギ、1:250）のためのPGP（アレクサフルーア488ロバ抗ウサギ、1:250）、のために。 </li></ol></li></ol> 7。二次抗体に区画検のインキュベーション<ol><li> 96ウェルプレート（行9）の彼らの指定ウェルに希釈した二次抗体を150μlを加える。 </li><li>よく二次抗体に1％BSAブロッキング溶液（行8）（行9）からセクションを転送します。 </li><li>乾燥および露光を避けるために、パラフィルム及びアルミ箔で96ウェルプレートを密封する。 </li><li>指定した二次抗体Oのセクションをインキュベート4℃/ N°フラットロッカー上のC。 </li></ol> 8。 1％BSAリンス液で生検をすすぐ<ol><li>行10,11、および12の各ウェルに1％BSAリンス液を150μlを加える。 </li><li> RTで1時間たびに1％BSAリンス液（列10,11、および12）で切片を三回すすぎ。リンスの間にフラットロッカー上のアルミホイルと場所とのウェルプレートをカバーしています。 </li></ol> 9。顕微鏡スライドとマウント区分検の準備<ol><li>生検のセクションでは、1％BSAリンス液（行12）の最後のすすぎにインキュベートされていますが、顕微鏡スライドを準備します。 </li><li>一度スライドに1％BSAすすぎ溶液50μlを置きます。 </li><li> 1％BSAリンス液（行12）からセクションを削除し、指定した顕微鏡スライド上の1％BSAリンス液50μlのドロップに配置します。セクションの位置を最適化した後、対策を講じて、球根のガラスピペットで余分な1％BSAリンス液を除去標本に触れないように。 </li></ol> 注：セクションが折り返されていないことを確認し、試料が顕微鏡スライドの表面に平らにする必要があります。 <ol start="4"><li>顕微鏡スライド上に生の近くにDAPIでゴールド退色マウンティング試薬を延長の代わりに1滴。 22x22のmmの顕微鏡カバーガラスを取り、優しく生と延長のドロップDAPIドロップゴールド退色防止剤の上に置きます。各セクションごとに繰り返します。 </li><li>暗闇の中で室温でO / N顕微鏡スライドが乾燥しましょう​​。 </li></ol> 注：ピペットチップを使用して、任意の気泡を取り除きます。 Gold退色防止試薬を延長過剰拭き取り。 パートB：共焦点イメージング 10。共焦点像<ol><li> FluoViewバージョン5.0ソフトウェアと40X油浸（1.3 NA）客観的かつズームで2回共焦点顕微鏡オリンパスFluoView 500レーザーを使用して画像蛍光シグナル。 </李&gt; <li>それぞれ543 nmのヘリウムネオングリーンレーザーと633 nmのヘリウムネオン赤色レーザーを励起するためにアレクサフルーア488とアレクサフルーア647を使用してください。アレクサフルーア488信号が赤LUTによって緑見上げるテーブル（LUT）とアレクサフルーア647で表されます。 </li><li>信号を強化するためには400μmで、各検出器のための共焦点開口部を設定します。シーケンシャルスキャンは1,024×信号分離を最大化するために1,024の解像度で撮影する必要があります。 </li><li>カルマンアベレージ（2フレーム）と1.2μmのZステップの間隔（FluoViewソフトウェアによって計算された最適なスキャンユニットに基づく）を使用して三次元のZシリーズをキャプチャします。 </li></ol>パートC：三次元可視化とアニメーション 11。 3次元（3D）可視化とアニメーション<ol><li> 3D画像セットを可視化するImaris x64のソフトウェアで開くFluoviewファイル（バージョン7.3、ビットプレンAG）。 </li><li>として神経特定の信号のコントラストを向上させるために必要な表示に調整します。 </li><li> suコマンドを作成します。真皮表皮境界を可視化するためにデータポート。境界線を描画する描画モードで等高線ツールを使用します。 </li><li>基礎蛍光シグナルを見るために境界に半透明な表面を割り当てます。 </li><li> 3D映画のスナップショットイメージを作成するために、3D蛍光シグナルの静止画をキャプチャします。 </li><li> 3D映画を作成するためにアニメーション機能を使用します。画像（ 図2、図3、及び図4）別々にマージされた各信号を表示するために360度を数回回転させることができる。毎秒15フレームでアニメーション化された200のフレームで構成されるムービーを作成するためにアニメーションを設定します。生のAVIファイルとして各ムービーを保存します。 </li><li> VirtualDubのソフトウェア（バージョン1.9.4）で最終AVIムービーを圧縮します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. 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V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. 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Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

宣言するために特別の利害関係はありません。

IENFDの測定は広く末梢神経障害13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN 15の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。 我々は以前侵害IENFD数の増加は、DB / dbマウスにおける疼痛行動、2型糖尿病5のマウスモデルに関連付けられていることを報告した。そのレポートでは、まず侵害IENFを研究するための二重免疫蛍光プロトコルを適用した。現在の研究では、PNの患者から、ヒトの皮膚への我々のプロトコルを展開します。二重免疫蛍光分析は、仲介IENFsのサブセットで、合計IENF及び侵害IENF両方の測定値を提供します痛み。これらの侵害IENFはTrkのAや他の侵害受容神経ペプチド5のために主に陽性である。痛みを伴う神経障害のために類似した二重免疫蛍光分析はラウリアら10によって記載されている。彼らは、報告された痛みを伴う神経障害を有する患者において一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーV部材1（TRPV1）のためIENFD減少。現在のプロトコルでは、我々の動物のデータ5に基づいて侵害IENFDを測定するための代替的アプローチを提供することができます。 現在のプロトコルはIENF構造を研究するための3次元的なアプローチを提供しています。ダブルimmunofluorecent分析と組み合わせることで、現在のプロトコルは、侵害受容IENFsの形態を調べるためのメソッドを提供します。これまでの研究では、密度との関連を報告したり、PNと侵害受容IENFの分岐していない。ここでは、人間の皮膚のIENFsの分岐や腫れ軸索研究するためのプロトコルを示しています。当社の3D分析は、このmのことを示唆しているethodはPNでIENFの形態学的変化を研究するために使用することができる。また、3D画像は、2Dイメージングに関連付けられている構造を重複の減少可視化に関連するエラーを回避することによってIENFD測定の現在のプロトコルを向上させることができます。 軸索の膨潤は、元の軸索の口径16の二度よりも大きな直径を有する軸索部の拡大として定義される。この構造は、軸索の細胞骨格と軸索輸送のコンポーネントの断片が含まれています。軸索の腫脹は、軸索神経障害6,16,17の初期の特徴と考えられている。しかし、軸索の膨潤構造の3次元解析は、文献に報告されていない。 図3に示すように、3次元イメージングはPNに関連付けられた軸索の膨潤のために重要な洞察を提供することができる。 それはよく軸索分岐が神経損傷18からの回復を伴うことを特徴としている。しかし、軸索の分岐を定量化するための利用可能な方法論はまだ2Dの画像に基づいて制限されています。 図4で説明したように、軸索の分岐が再生神経の曲がりくねった性質によって複雑にすることができる。従って、分岐点は、定量の正確さに影響を与える周辺の神経線維によって隠さすることができる。我々のプロトコルの3次元画像解析、分岐神経の詳細については、改善された可視化を提供します。

現在のところ、それは小さなファイバ神経障害、3つ6-8を診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘9 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡6 PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリアらはPN、侵害受容性マーカー10との共同標識PGP陽性IENFを研究する二重標識法を適用した。我々の以前の研究では、我々はTrkの陽性IENFを実証しなく、Trkの陰性IENF、痛みを伴う糖尿病性神経障害5の動物モデルにおいてアップレギュレートされた。この共同標識法はIENFDとPNに関連付けられている形態学的変化を研究する能力を合計する侵害受容IENFDの定量化を比較する機能を提供します。侵害受容IENFとコンパを可視化する機能侵害IENFDにIENFD合計の定量化を再度客観的疼痛の存在の証拠、そしておそらくPNに伴う痛みの重症度に関する洞察を提供することができます。また、この手法は、動物モデルの皮膚に適用可能である。以前の研究と比較して、現在のプロトコルは、2D画像解析で発生するエラーを回避する機会を作成し、3次元画像解析のための方法が記載されている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発3の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。 現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3Dイメージングは​​さらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。

私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を持つ66歳の男性、2型糖尿病（：;疼痛スコア108ヶ月47期間）の。定量的な官能試験及び神経伝導研究を含む神経学的検査履歴とは、末梢神経障害を評価するために実施した。疼痛スコアは、0〜100のビジュアルアナログ痛みのスケールに基づいて決定した。 このプロトコルを使用して、我々は、ヒトの皮膚におけるIENFs（ 図2）の3次元構造を研究することができる。 図2の</strオングは&gt;、PGP陽性IENFsは緑色信号によって同定された、とTrkの陽性IENFsは赤信号で標識した。すべてTrkはA陽性IENFsはPGPにもプラスで、重複信号が黄色に表示されます。 IENFsを検査することに加えて、これらの方法はまたIENFs（ 図3）で軸索の腫脹を研究するために使用することができる。 図3に示す軸索の腫脹の3D画像は、これらの腫れがIENFsに沿って分布球状構造体であることを示している。さらに、これらの方法はIENFs（ 図4）の分岐研究するために用いることができる。 図4に示す分岐の3D画像は、形態学的変化は、PNの存在と場所を取ることを示している。前述したように、真皮-表皮境界は形態および配向神経及び真皮と表皮の間に8画素強度差に基づいて決定された。青図2、図3に示すようにトレース、 および4、真皮表皮接合部を示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50331/50331fig1.jpg" /> 図1。皮膚生検免疫組織化学のための96ウェルプレートのセットアップを示す模式図である。 図2。 IENFの三次元（3D）画像。合計IENFを表すグリーンラベル（A）PGP陽性IENF、、（最初の360°回転）の代表的な3D画像と侵害受容IENF（1秒360°回転）を表す赤、ラベル（B）Trkの陽性IENF、および（C ）ケース1から皮膚サンプルでPGP陽性、侵害受容IENFを（第3 360°回転）実証合成画像。バー=20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50331/50331fig2.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a> 図3。 PNのIENFにおける軸索腫脹の3次元（3D）画像。ケース2から皮膚サンプルで緑信号とPGPにより標識IENFsに沿って軸索の腫脹（矢じり）、、のと皮下神経叢内の代表的な3D画像。バー=10μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50331/50331fig3.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a> 図4。 PNのIENFの分岐軸索の三次元（3D）画像。ケース3から皮膚サンプルでは、緑色の信号とPGPにより標識IENFsに沿って軸索の分岐（矢じり）の代表的な3D画像、。バー=20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50331/50331fig4.avi" target="_blank">ムービーを表示するにはここをクリックしてください。</a> <table border="1"><tbody><tr><td> 5％BSAブロッキングソリューションのコンポーネント： </td><td> 12.5ミリリットルのために必要な量 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td>8.125ミリリットル</td></tr><tr><td> 0.1％トリトンX-100（TX-100）[最終濃度：0.03％] </td><td> 3.75ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> 0.625グラム</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 12.5ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表1。 5％BSA、ソリューションをブロック。 <table border="1"><tbody><tr><td> 1％のリンス液のコンポーネント： </td><td> 12ミリリットルのために必要な量 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> 8.625ミリリットル</td></tr><tr><td> 0.1％TX-100 [最終濃度：0.03％] </td><td> 3.25ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td> 0.125グラム</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 12ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表2。 1％BSAは、ソリューションをブロック。

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

three-dimensional-imaging-nociceptive-intraepidermal-nerve-fibers

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.1K ビュー.  University of Michigan. 痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

医学

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

複雑な大動脈の異常の三次元印刷

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

ガイド付き歯内療法:歯内アクセス虫歯の3次元計画とテンプレート支援準備

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

Although conventional pathology provided numerous information about kidney microstructure, it was difficult to know the precise structure of blood vessels, proximal tubules, collecting ducts, glomeruli, and sympathetic nerves in the kidney due to the lack of three-dimensional (3D) information. Optical clearing is a good strategy to overcome this big hurdle. Multiple cells in a whole organ can be analyzed at single-cell resolution by combining tissue clearing and 3D imaging technique. However, cell labeling methods for whole-organ imaging remain underdeveloped. In particular, whole-mount organ staining is challenging because of the difficulty in antibody penetration. The present protocol developed a whole-mount mouse kidney staining for 3D imaging with the CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) tissue clearing method. The protocol has enabled visualizing renal sympathetic denervation after ischemia-reperfusion injury and glomerulomegaly in the early stage of diabetic kidney disease from a comprehensive viewpoint. Thus, this technique can lead to new discoveries in kidney research by providing a macroscopic perspective.

The present protocol describes a tissue clearing method and whole-mount immunofluorescent staining for three-dimensional (3D) kidney imaging. This technique can offer macroscopic perspectives in kidney pathology, leading to new biological discoveries.