我々は優雅にスクリプト用ドクタージョンヘイズに感謝;博士。エリック·ブラッドリーと共焦点顕微鏡の支援のためのクリストファー·デル·ネグロ、ドリュー·ヒューズ、プロジェクトを開発し、予備的なデータを提供する際に自分の仕事のためラウラOdorizzi、アレックスGarafalo、レベッカラウデン、とリズ·マクマレイ、統計分析に役立つ提案のための博士グレッグスミス。この作品は、MSSにNIHの助成金（NINDS IR15N5067566-01）とウィリアム·アンド·メアリー大学のハワードヒューズ医学研究所の科学教育助成金によって支えられている。

特別な利害関係は宣言されません。

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフリカツメガエルにおける解剖推定網膜組織からの初代細胞培養のための簡単な手法を提示し、推定網膜が発達し、その初代細胞培養のごく初期の段階から容易にアクセス可能であることを与えられたこのような研究のために特に適した生物がで発生する可能性があります単純な食塩水から成る定義されたメディア。 ほとんどの実験室の設定に容易に適応が、特に細心の注意を必要とするいくつかの手順があります。 Dissectiアドオンは新鮮尖っ鉗子を用いて実施されるべきである。若い段階（&lt;聖30）細胞培養培地と混合コラゲナーゼBと治療の恩恵を受ける。別のメディアから組織や細胞の移転を伴うすべての手順は、空気 - 溶液界面の近傍に入ってくるから組織や細胞を防止するために特別な注意を払って行う必要があります。組織を含むピペットは完全流体の十分に浸漬し、細胞または組織は非常にゆっくりと追放されるべきである。細胞がメッキされた後、Fluo4-AM加えて、細胞培養培地、または固定の洗浄を含め、すべての流体転送は、慎重に細胞が外れやすくすることができることを考えると実行する必要があります。すべての細胞培養と同様に、無菌性が懸念されるので、注意がすべての材料を殺菌するために取られるべきである。最後に、解離網膜外植片は、解離培地中で指定された時間枠に座っせることは成功した細胞接着のために重要であり、ダマにならないようにするために。 間にこのプロトコールに記載切開および培養条件、壊死とアポトーシスの両方を非常に（セル未満の5〜10％）に制限されています。プレート上の細胞（アポトーシス）の損失は、めったに事前および事後の共焦点イメージングセッション中に気づいていません。慎重に培養細胞を処理すると、細胞の生存への鍵となります。ソリューションの変更は、細胞壊死およびアポトーシスを阻止するために、非常にゆっくりと着実に実行する必要があります。網膜の細胞型の正確な比率を線引きする実験が現在進行中であるが、我々は網膜の細胞型の様々な文化で表現されるように見えることと、ミュラーグリア細胞が（これは明確な形態​​を持っている）の文化で支配的ではないことに注意してやる。 in situハイブリダイゼーション実験で後にプレートを分析する潜在的な懸念は、細胞の一部が移動した可能性がありますが、これは細胞追跡プログラムを使用してアドレス指定されるかもしれないということです。また、初代細胞培養の技術に内在する、主要な制限は番目です無傷の組織に存在している空間的なパターニングのe明白損失。個々の細胞のアイデンティティは、組織内の位置によって分子アッセイを使用してではなく、確立されなければならない。ただし、この機能はまた、細胞は非常に正確に、そして継続的な細胞間相互作用の非存在下での仕様の状態を分析する機会を提供しています。また、治験責任医師は、選択的に成長因子または他の化合物と細胞を治療することを可能にし、正確に隣接セルからの信号の影響を受けずに効果を分析。我々は特定の神経伝達物質の表現型マーカーを用いてカルシウムイメージングを相関させるために、この網膜切開および初代細胞培養技術を用いているが、この技術は、電気生理学的記録及びRT-PCRを用いた単一細胞遺伝子発現アッセイを含む他の下流の幅広いアプリケーションに適応可能か &quot;の横にある-genは&quot;トランスクリプトーム解析（ 図1）。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖と培養するための </td></tr><tr><td> BDファルコンイージーグリップ組織培養皿、35ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのポリスチレンペトリ皿、60×15ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35ミリメートルNunclon表面ペトリ皿（Airvent付き） </td><td>フィッシャー</td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td>デュモンファイン鉗子（Dumostar＃55） </td><td>フィッシャー</td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellatticeマイクロ支配プラスチックカバースリップ、25ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td>エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩（MS-222） </td><td> MPバイオメディカル、LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td>エンツォ生命科学</td><td> 380から003-G025 </td><td></td></tr><tr><td>ギブコトリプシン（1:250）パウダー</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> クロストリジウム·ヒストリチカムからのコラゲナーゼB </td><td>ロッシュ</td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>ナイルブルー硫酸（オプション） </td><td>ファルツ＆バウアー</td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500mlの真空フィルター/ストレージボトルシステム、孔径0.22μm33.2センチメートル2 CN膜</td><td>コー​​ニング</td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> カルシウムイメージングのための </td></tr><tr><td>のFluo-4は、DMSOで1mM溶液、永久細胞AM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td>水中でのプルロニックF-127の10％溶液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510共焦点顕微鏡システム</td><td>ツァイス</td><td>モデル廃止</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-POD、Fab断片</td><td>ロッシュ</td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td>抗DNP-HRP抗体</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3でNHSエステル</td><td> GEヘルスケア</td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-フルオレセイン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド、脱イオン</td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td>トルラRNA、IX型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td>ブタ腸粘膜からヘパリンナトリウム塩、 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2に特異的な試薬や機器。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td> リファレンス </td><td> 中身 </td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>チャンとスピッツァー、2009 54 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 2mMのCaCl 2 1.31 mMのMgSO 4を 4.6 mMトリス 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>カルシウム·マグネシウム培地（CMF） </td><td>グーら 、1994 42;。Guとスピッツァー、1995年55 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 4.6 mMトリス 0.4 mMのEDTA 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>マレイン酸バッファ（MAB） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのマレイン酸 150mMのNaCl（pH7.5）で。 </td></tr><tr><td> 10X Marcの修正リンガー（MMR） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのNaCl のKCl 1mMのMgSO 4を 2mMのCaCl 2 5mMのHEPES pHはNaOHで7.4に調整 0.1X MMRは、50 mg / mlの硫酸ゲンタマイシン及びpHをNaOHで7.4に調整されているが含まれています。 </td></tr><tr><td> 10X MEMFAソリューション、 </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td>の0.1M MOPS緩衝液（pH7.4） 2mMのEGTA 1mMのMgSO 4を 3.7％ホルムアルデヒド 10X溶液は、ホルムアルデヒドことなく、4℃で保存することができますホルムアルデヒドは（標準37％ストックの1/10量）新鮮追加されます。 </td></tr><tr><td> in situハイブリダイゼーション緩衝液中に </td><td> SIV電子ら 、2000年53 </td><td> 50％ホルムアミド 5X SSC 1 mg / mlのトルラRNA 100 mg / mlのヘパリン 1Xデンハルト溶液 0.1％のTween20 0.1％CHAPS 10mMのEDTA。 </td></tr></tbody></table>ペニシリンとストレプトマイシンが我々の文化メディアで使用されている間ソリューションを提供しています。*ゲンタマイシン、抗生物質は、私たちのMMRのソリューションで使用されています。 </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。 無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞を用いた7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル5,8,21,24,27-30,33-39に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達19,27,29,31-32,40-42は 、網膜の初代細胞培養10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。 推定網膜組織はすぐに神経誘導25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。 しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35歳以上では、レンズ、網膜の上に透明なレイヤーとして見ることができると鉗子を用いて慎重に削って除去することができる。 首尾よくメッキ初代培養細胞は 、 図3Aに示されている。組織を解離するときに、リンス液に解離するから組織を防ぐために推奨される30秒のインキュベーション時間よりも長くすすぎ液中に網膜外植片を残さないことが重要です。さらに、組織は完全な時間のためにトリプシン溶液中で解離することが許可されていることを確認培養プレート中の細胞の均一な分布を可能にするために（古い胚および幼虫期はさらに長く必要になるかもしれない。）細胞がメッキされたら板を移動させ、プレートから細胞を洗浄避けるためにソリューションを変更する際には注意が必要です。 図3Bおよび3Cはそれぞれ、in situハイブリダイゼーション実験におけるカルシウム活性スキャンおよび蛍光（FISH）からの画像を示しています。カルシウムイメージに明るい緑色で表示された細胞は、内部カルシウム貯蔵の放出の結果として細胞内カルシウム濃度の一過性スパイクを受けている細胞である。次いで、細胞を、FISH法を用いた遺伝子発現についてアッセイすることができ、遺伝子発現パターンは、イメージ（ 図3D）を重ね合わせることでカルシウムスパイク活動のパターンに相関させることができる。 PythonとMATLABスクリプト（ご要望に応じて自由に利用できる）の組み合わせを使用して、データは各individuの蛍光活性を分析することによって得られるイメージングの過程を通じて興味のアル領域（ROI）。イメージングの1時間以上の個々の細胞回収率（ROI）のためのカルシウムの活動の一例を図4に示します。スパイクは、イメージングの約57分で表示されます。 表1において、種々のプローブのための陽性細胞の割合のための代表的なデータが示されており、文献で ​​報告され、この実験（我々の現在の実験のポイントは、これらのパーセンテージを決定することである）に特異的なデータはないものの、我々の調査結果はと一致している脊髄17,55,56におけるカルシウム活性に関する実験同様のタイプのデータ。 分析のために利用されるパラメータは、数、頻度、およびスパイクの振幅が含まれています。 図5を xVglut1、Ptf1a、とxGAD67用プローブを用いた胚性網膜細胞内カルシウムイメージングとFISH実験の代表的な結果を提供します。 MATLABスクリプト、EACのためのスパイク数を使用してhのROIが決定され、スパイクの数は、実験のすべてのROIのために平均化されます。各実験からスパイクの平均数は、その後の実験群の平均で、その結果、他の実験でコンパイルすることができます。累積分布プロットは、グループ内のすべての実験のスパイク数の平均値の分布を表示するために作成することができます。 MATLABスクリプトは、データの統計的分析のために使用されます。 図5は、MATLAB解析、以下の代表的データを示しています。簡単に言えば、我々の結果はスパイクステージ35でピークに達して、カルシウム活性が発生的に調節されていることを示した（p &lt;0.002）（ 図5Aおよび図5C）。統計学的に有意な差はなかったものの、特定のプローブのための陽性細胞でカルシウム活性の相関をとるという点では、しかしhigheを表示するxGAD67（分化GABA作動性細胞のマーカー）陽性の細胞のための傾向（P = 0.08）であった<html>グルタミン酸作動性マーカー、またはPtf1a、GABAeric表現型を促進すると相関転写因子遺伝子をコードする遺伝子陽性細胞よりもカルシウムスパイク活動のrレベル。予備的には、これらのデータはPtf1aまたはその活性依存性神経伝達物質の仕様に依存しない方法で開発するGABA作動性細胞が存在する可能性があることを示唆しているがPtf1aのレベルで動作していません。 <img src="/files/ftp_upload/4377/4377fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4377/4377fig1highres.jpg"/> 図1。手続きの概略図はいったん網膜組織を切開され、解離、初代培養細胞は、多種多様なアプリケーションに使用することができます。 <html> s.jpg &quot;/&gt; 図2。解剖写真である。胚は増加コントラストナイルブルー硫酸で染色した。 AE：ステージ24。 FJ：ステージ35。略語：OV、眼胞、FB、前脳、SC、脊髄、私、中胚葉、そう、体節、LE、レンズ、CG、セメント腺、再度、網膜、EP、上皮。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4377/4377fig2large.jpg" target="_blank">拡大図はこちらをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4377/4377fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 ROIを持つ細胞培養の画像は丸。A.明視野。 ROIを持つのFluo-4（AM）の治療後のB.画像は丸。 CでのFISH画像（矢印は電位依存性カルシウムチャネルCaV2.1のαサブユニットの陽性細胞の例を示す）。明視野のD.オーバーレイ、Fluo-4を、魚の画像。 7/4377fig4.jpgの &quot;alt =&quot;図4 &quot;のfo：コンテンツの幅=&quot; 3.5インチ &quot;のfo：SRC =&quot; / files/ftp_upload/4377/4377fig4highres.jpg &quot;/&gt; 図4。単一細胞率（ROI）のカルシウム活性の例。Fluo4カルシウム蛍光画像から蛍光（相対蛍光単位で、RFU）対時間（分単位）のプロット。 <img src="/files/ftp_upload/4377/4377fig5.jpg" alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4377/4377fig5highres.jpg"/> 図5。結果は、ステージとプローブによってカルシウムスパイクが表示されます。A.平均30段階（n = 4）で、35℃でカ​​ルシウムスパイクの数（n = 8）、38（n = 13）であった。 Bの平均ステージ35 xVglut1（n = 3）の時に、in situハイブリダイゼーションに使用される様々なプローブ間の文化あたりのカルシウムスパイク数、xGAD67（n = 3）であり、Ptf1a（n = 4）であった。ステージ30、35、38の文化当たりスパイクの平均数のC.累積分布プロット。 D.累積distributi正のステージ35でin situハイブリダイゼーションプローブのための信号があると判断された細胞の培養当たりスパイクの平均数のプロット上; xVglut1、xGAD67、とPtf1aを<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4377/4377fig5large.jpg" target="_blank">拡大図はこちらをクリックしてください</a> 。 <table border="1"><tbody><tr><td> プローブ </td><td> ステージ </td><td> N（プレート） </td><td> n個（セル） </td><td> 正パーセント </td></tr><tr><td> xGAD67 </td><td> 35 </td><td> 4 </td><td> 1042 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td></td><td> 38 </td><td> 4 </td><td> 690 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td> Ptf1a </td><td> 30 </td><td> 3 </td><td> 352 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td></td><td> 35 </td><td> 6 </td><td> 1856 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>xVglut1 </td><td> 30 </td><td> 1 </td><td> 47 </td><td> 57パーセント</td></tr><tr><td></td><td> 35 </td><td> 3 </td><td> 692 </td><td>二パーセント</td></tr><tr><td></td><td> 38 </td><td> 3 </td><td> 364 </td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1パーセント陽性細胞。

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

dissection-culture-analysis-xenopus-laevis-embryonic-retinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

13.8K ビュー.  College of William and Mary. アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

発生生物学

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

神経科学

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

生物学

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Xenopusの細胞修復戦略を調査するための網膜変性の生成

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

著者スポットライト:Xenopus Frogの網膜再生メカニズムの探索 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

の解離、文化、および分析

要約

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この動画の章

幹細胞様

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

テスト視機能のための簡単な行動アッセイ

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

の解離、文化、および分析

要約

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幹細胞様

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

テスト視機能のための簡単な行動アッセイ