我々は、有用な議論M. Winkelbauer·ハート、E.イブラヒム、P.バレンシア、K. Dufu、H.チェンに感謝しています。 HeLa細胞は、ナショナル細胞培養センター（ミネアポリス、MN）から得られた。また、光学顕微鏡のヘルプはハーバードメディカルスクールでE7107とニコンイメージングセンターを提供するためにエーザイ株式会社に感謝します。この作品は、JLHにRRとEGFとNRSAフェローシップにNIHの助成金GM043375によってサポートされていました。

1。核抽出のための成長HeLa細胞<ol><li> 10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM培地を持つ3つの150ミリメートルプレート上にプレートしたHeLa細胞。細胞が90％コンフルエントになるまで、5％CO 2で37℃のインキュベーター内で成長する。 </li></ol> 3日に分割した後コンフルエントプレートと収穫〜1:10先端セルの分割。 先端の余分な板を3枚のプレート（例えば、細胞が90％未満のコンフルエントである場合）との十分な細胞が存在しない場合には成長させることができる。 2。核抽出液を調製し、チル<ol><li> 表2に示すように、新鮮な溶液を調製する。 </li><li> 15mlファルコンチューブに低張緩衝液のアリコートを10ミリリットル。高塩緩衝と1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに低塩緩衝液1mlのアリコート1ミリリットル。氷の上でバッファを冷やす。使用直前にそれぞれのバッファにPMSFとDTTの適切なボリュームを追加します（参照してください。 <strong&gt;表1）。 </li></ol> 3。核抽出のためにHeLa細胞を収穫<ol><li>細胞から培地を吸引除去し、プレートごと室温の1X PBSを13ミリリットルで一回細胞を洗浄する。 </li><li> PBS洗浄を吸引除去する。 </li></ol>その後、数秒待って、残りを吸引し、その側の板に立って、最初の吸引によってできるだけ多くのPBS、可能な限りの先端吸引します。 <ol start="3"><li>セルリフターを使用して、プレートの下端に細胞をこすり、次にエッペンドルフチュー​​ブに細胞を移す。泡を作ることは避けてください。スクレイプ細胞の3プレートが1 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに収まる必要があります。 </li></ol>ヒント - それはエッペンドルフチュー​​ブが使用されている場合はセルの体積を推定する方が簡単です。スケールアップについては、ファルコンチューブを使用しています。 <ol start="4"><li>ペレット細胞にxgの100℃で5分間遠心は4℃で遠心します。 </li></ol> 4。低張緩衝液でHeLa細胞を膨潤させる</p&gt; <ol><li>慎重に細胞ペレットからPBSを吸引し、チューブにグラデーションを見て、血球容積（PCV）を見積もります。 HeLa細胞の三コンフルエントプレートはPCVの約500μlを得ることができます。 </li><li>細胞ペレットに低張緩衝液のPCVを2倍に追加します。細胞を再懸濁するために静かに振る。穏やかに、必要に応じて上下にピペッティングして細胞を再懸濁するためにP1000ピペットマンを使用しています。 </li><li>ペレット細胞にxgの100℃で5分間遠心は4℃で遠心します。 *細胞はこの時点で膨潤し始めているし、細胞容積は現在、750μlの-1000μL程度でなければなりません。 </li><li>慎重に低張緩衝液を吸引し、1.5mlの最終容量に新しい低張緩衝液を追加します。細胞を再懸濁します。 </li><li>氷上で10分間再懸濁した腫れた細胞をインキュベートします。 </li></ol> 5。ダウンスホモジナイザーを用いて細胞を溶解<ol><li>ダウンスをすすぎ、その後氷上で寒さを低張緩衝液を使用しています。繊細な作業仕掛品の乾燥乳棒を拭くER（例：キムワイプ）。 1000μlの拡張されたマイクロピペットチップを使用して、ダウンスから、残りのバッファを削除します。 </li><li>ダウンスに腫れた細胞を転送します。徐々に気泡がないように注意しながら、細胞を溶解するために上下に5回ダウンスのタイト乳棒を移動します。 </li><li>ダウンスから細胞を5μlのアリコートを用いて細胞溶解のアッセイ。エッペンドルフチュー​​ブに分注しを配置し​​、トリパンブルーの等量を追加します。スライド上に混合物を置き、光学顕微鏡を用いて細胞を調べます。溶解した細胞の核は青で表示されます。約90％の溶解が理想的です。 </li></ol>先端細胞がdouncedなければならない回数がダウンスの気密性に応じて異なります。初めて、このプロトコルを実施する場合、ダウンス、各ストロークの後、ステップ5.3を実施することによりダウンスする回数を決定します。オーバーダウンスない、過度のdouncingは、核を破壊します。 <ol start="4"><li>プリchilleに溶解した細胞を転送1500×gで5分間、4℃遠心のdエッペンドルフチュー​​ブとスピン。ペレットは核を含んでいます。慎重に核を中断することなく、上清を新しいチューブに移す。上清を細胞質を含んでいます。 </li></ol>先端細胞質はバルク抽出物（バルク抽出からアクティブS100を準備するため1を参照）に使用されているのと同じ高速スピンを使用することであるとして使用したり、さらにS100に処理することができます。 6。塩抽出核<ol><li>チューブのグラデーションを見て、ランチ原子力ボリューム（PNV）を推定する。 500μlのPCVは一般的に400μlのPNVが得られます。 </li><li>チューブの底にマイクロピペットの先端を挿入し、穏やかに混合しながら徐々に核内にバッファを潮吹きで核に低塩緩衝液の½X PNVを追加します。ピペット上下しないでください。静かに続行する前にペレットが完全に低塩濃度のバッファーに再懸濁していることを確認するためにチューブをフリックします。 </li> &lt;LI&gt;追加½X高塩緩衝かつ迅速に反転管で1時間を混在させるのPNV。振らないでください。 30分間、4℃で回転させます。 </li></ol>それらを溶解避けるために、高塩緩衝である核をもつ優しい先端ください。 <ol start="4"><li> 18000×gで15分間遠心は4℃で遠心する。上清は、高い塩核抽出（HS-NE）です。細胞の3枚のプレートは、通常、HS-NEの500から600μlを得ることができます。 </li></ol> 7。核抽出物を濃縮し、透析<ol><li>冷やしたミニcentricons（アミコン社製）および14000×gで遠心の4時50分°CのスピンにHS-NE 500μlを転送します。ミニセントリコン（アミコン社製）を反転すると新しいエッペンドルフチュー​​ブに入れてください。 4で2分間スピン°C、HS-NEを回復するために1000年XG。 HS-NEは約115μlに濃縮することになります。 </li><li> P200ピペットマンを使用して、ミニ透析スライド-LyzersにHS-NEの45μlを転送し、50に配置しチルド透析バッファの0ミリリットル。スライドA·アナライザの底がフローターの下部に揃えて配置されていることを確認します。 4℃で1〜2時間撹拌NEは、透析後の曇りが表示されます。 </li></ol>先端でください。この遠心抽出物の活性を低下として、透析後に観測された濁った沈殿物を除去するために遠心分離しません。 <ol start="3"><li> NEは、直ちに使用または等分することができます。アリコートは、フラッシュ液体窒素中で凍結し、-80℃で保存しなければなりませんNEが格納されていると活性を失うことなく、少なくとも2回の凍結融解サイクルを受けることができます。 </li></ol> 8。代表的な結果最近では、スプライシングにRNAP IIの転写を結合するためのin vitro系で効率的に2-5を開発されました。これらのシステムは、バルクで成長したHeLa細胞を用いたため、急速に複数のサンプルに特異的な細胞治療の効果をテストするに従順ではありません。このようなニーズに基づいてndは小規模な抽出プロトコルの一般的なユーティリティでは、（説明を参照）、我々は、堅牢な小規模の核抽出法を確立した。バルク核抽出物の小規模な核抽出物でRNAP II転写/スプライシング反応を比較する代表的なデータを図2に示します。 CMVプロモーターを含む、標準的なスプライシングの基質（FTZ 3、 図2A）をコードする CMV-DNAコンストラクトは、分析のために使用されていました。この構造は、バルク（レーン1-3）または小規模（レーン4-6）エキスでインキュベートされたときに、初期のpre-mRNAの同様のレベルは5分の時点で合成した（ 図2、レーン1と4 。）さらに、転写をブロックするα-アマニチンを添加した後、スプライシング中間体およびスプライスの製品は、抽出物の両方のタイプ（ 図2、レーン2、3、5、6）で同様の動態を時間の経過とともに蓄積された。これらの代表的な結果は、クーデターの効率化<html> LED RNAP II転写/スプライシングシステムは、バルクと小規模核抽出物に似ています。 小規模な抽出方法の有用性を実証するために、抽出物は、スプライシング阻害剤で処理したHeLa細胞、E7107、または陰性対照化合物プラジエノライドF 6,7から調製し、次いで結合RNAP II転写/スプライシングアッセイを行った。 図3に示すように、RNAP IIによる転写は、プラジエノライドFとE7107処理した細胞（10分の時点）の両方から調製した抽出液で効率的に発生しました。対照的に、選択的スプライシングは、プラジエノライドF処理した細胞から調製した抽出液では正常に発生したが、E7107で処理した細胞（ 図3、20から60分時点）に廃止された。これらのデータは、小規模のセルの特別な治療のために小規模の核抽出物を使用するための概念の証拠を提供しています。 JPG &quot;/&gt; 図1。小規模エキスプロトコルの概略は、ステップ P1を。細胞を低張緩衝液の添加によりセルリフターや腫れを使用して、プレートから採取した単層として栽培されています。 P2を入れます。細胞は、ダウンスホモジナイザーを用いて溶解し、ペレットに核を遠心分離しています。 P3を入れます。核が細胞質から分離し、塩の抽出を受けています。 P4を入れます。核抽出物を濃縮し、透析されています。 P5を入れます。結果は、核抽出物が機能していることを示して（より詳細については、 図2を参照）が得られる。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> 図2。小規模の核抽出物は、結合RNAP II転写/スプライシングアッセイで堅牢です。A.結合RNAP II転写/スプライシングのために使用CMV-FTZのDNAテンプレートの模式図。 CMVプロモーターとエクソンとイントロンのサイズが示されている。結合RNAPのB.の比較バルク核抽出物または小規模の核抽出物のいずれかを使用して、II転写/スプライシングアッセイ。転写とスプライシングの5分、30分および60分で発生させた後、α-アマニチンが追加されました。 RNAを抽出し、分画し、5パーセント変性ポリアクリルアミドゲル上およびphosphoimagerによって検出された。スプライシング中間体および製品が示されています。内因性のU6 snRNAのとtRNAは抽出物中に存在する、それが32インキュベーションの間にP-ラベルされ示されています。結合RNAP II転写/スプライシングシステムの詳細なプロトコルのための3を参照してください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> 図3。スプライシング阻害薬E7107で処理したHeLa細胞から調製した小規模な核抽出物は、スプライシングに欠陥があります。細胞は、3μMで処理したプラジエノライドFまたはE7107として6に記載して、小規模の核抽出物を調製するために使用されます。時間経過は図2と同様に転写/スプライシングアッセイを用いて行った。スプライシング中間体、製品、およびU6 snRNAのとtRNAが示されている。

<ol>
	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

この記事への生産とフリーアクセスは、アブカムは、PLCが主催しています。

我々は、単層として成長したHeLa細胞の少量からの核抽出物を調製するための迅速かつ再現性のある方法を確立しています。我々は、これらの抽出物はRNAP II転写/スプライシングアッセイの動態と効率が小規模とバルク核抽出物と同様であることを示すことによって、堅牢であることを実証した。我々はスプライシング阻害薬で処理した細胞から調製した抽出物は、転写の活性が選択的スプライシングの欠陥であることを示すことによって、抽出の有用性を示した。 小規模の核抽出物を調製するために我々の手法は、以前大規模な1,8の懸濁液中で増殖させたHeLa細胞から抽出し、抽出し9の小規模な製造方法を作るために確立された方法を組み合わせて最適化することによって設立されました。前の小規模な抽出物はいくつかのアッセイのための機能ではなかったので、私たちはそのような結合転写/ SPのように、我々のプロトコルを確立しアッセイをlicing。前の小規模なプロトコル9と我々の重要な違いは、以前のプロトコルは小さなゲージの針9を介してそれらを押すことによって細胞を溶解したのに対し、我々はミニダウンスを用いて細胞を溶解するための条件を最適化することである。抽出物は、いくつかのアッセイのために再現することが非アクティブおよび/または困難であった理由を説明することが気泡の針溶解の結果、。我々はまたプロトコルへの濃縮工程を追加しました。このステップでは、濃度に非常に敏感で抽出、の活性を増加し、また、小規模の準備に固有である抽出の間にばらつきが制限されます。最後に、私たちの準備が日常的に大量の抽出物と比較して、活動に重要な影響を与えることなく、単層細胞の3つのみ150ミリメートルのプレートを用いて実施される。したがって、プロシージャは高価な試薬や限られた細胞の可用性を必要とする小規模の準備のために容易に適している。たとえば、我々は、SMAを用意しましたLL-スケールのRNAiノックダウン細胞から慢性リンパ性白血病（CLL）患者の細胞から抽出し、機能的および/または生化学的アッセイ（EGF、JLH、TYとRR、未発表）のためにこれらの抽出物を使用していました。我々は、抽出物は、そのようなimmunopreciptations、西部、および銀染色などの特定の生化学的アッセイ、続いてRNAiに貴重であることを見出した。特定のタンパク質をノックダウンの有効性を確立した後、より詳細な研究は、低コストで追加の抽出物を調製するために使用することができ、安定したノックダウン細胞株を作ることによって行うことができる。これらのノックダウン細胞株から得られた免疫沈降物中に存在するタンパク質の質量分析は、メソッドの有用なアプリケーションになります。ここで我々のプロトコルを記述するための例として使用した結合転写/スプライシングアッセイに加えて、小規模の抽出物は、さまざまな世紀に使用されるものとして、多くの機能や生化学的アッセイに一般的に適用する必要があります遺伝子発現のEPS（キャッピング、スプライシング、転写、ポリアデニル化、microRNAの処理など）。プロトコルはまた、いずれかの懸濁液中で得られた（例えば、CLL細胞など）、または（例えば、患者の線維芽細胞など）を培養で増殖することができ、患者の細胞型に適応することができます。最後に、プロシージャの間に得られた細胞質画分は細胞質を必要とする機能や生化学的アッセイの両方に有用であることが分かるはずです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 試薬のフルネーム </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - （2 - ヒドロキシエチル）ピペラジン-1 - エタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td>のMgCl 2·6H 2 O </td><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ</td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>シグマ</td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td>ジチオスレイトール</td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物</td><td>バイオ分析アメリカン</td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ダルベッコの最小必須培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td> 16140 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td></td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td> Cellgro </td><td> 21から040-CV </td></tr><tr><td>トリパンブルーは0.4％の染色</td><td></td><td>ギブコ</td><td> 15250 </td></tr><tr><td>セルリフター</td><td></td><td>コー​​ニング</td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> 150ミリメートルプレート</td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td>拡張されたマイクロピペットチップ</td><td></td><td>デンヴィル</td><td> P1126 </td></tr><tr><td>タイト乳棒でダウンスホモジナイザー、1ミリリットル、 </td><td></td><td>ホイートン</td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers、MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td>ミニCentricons、MWCO 3kDa </td><td></td><td>ミリポア（アミコン社製） </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および装置。 <table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td> 最後の </td><td> 株式 </td><td> ディスペンス </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低張の</td><td> 10mMのHEPES、pHが7.9 </td><td> 1M HEPES、pHが7.9 </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td></td> &lt;TD&gt; 1.5 mMのMgCl 2 </td><td> 1MのMgCl 2 </td><td> 750μlの</td></tr><tr><td></td><td> 10mMのKClを</td><td> 3MのKCl </td><td> 1.67ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのPMSF </td><td> 200mMのPMSF </td><td> 500μlの</td></tr><tr><td></td><td> 0.5mMのDTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125μlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 水で500mlに持ち出す </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低塩</td><td> 20mMのHEPES、pHが7.9 </td><td> 1M HEPES、pHが7.9 </td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 1.5mMのMgCl 2 </td><td> 1MのMgCl 2 </td><td> 150μlの</td></tr><tr><td></td><td> 20mMのKClを</td><td> 3MのKCl </td><td> 667μlの</td></tr><tr><td> ＆nbのSPの; </td><td> 0.2mMのEDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40μlの</td></tr><tr><td></td><td> 25％のグリセロール</td><td>グリセロール</td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのPMSF </td><td> 200mMのPMSF </td><td> 100μlの</td></tr><tr><td></td><td> 0.5mMのDTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25μlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 水で100mlに持ち出す </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高塩</td><td> 20mMのHEPES、pHが7.9 </td><td> 1M HEPES、pHが7.9 </td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 1.5mMのMgCl 2 </td><td> 1MのMgCl 2 </td><td> 150μlの</td></tr><tr><td></td><td> 1.4MのKCl </td><td> 3MのKCl </td><td> 48ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのEDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40μlの</td></tr><tr><td></td><td> 25％のグリセロール</td><td>グリセロール</td><td> 25ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのPMSF </td><td> 200mMのPMSF </td><td> 100μlの</td></tr><tr><td></td><td> 0.5mMのDTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25μlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 水で100mlに持ち出す </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透析</td><td> 20mMのHEPES、pHが7.9 </td><td> 1M HEPES、pHが7.9 </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 100mMのKCl </td><td> 3MのKCl </td><td> 16.625ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのEDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td></td><td> 20％のグリセロール</td><td>グリセロール</td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td></td><td> 0.2mMのPMSF </td><td> 200mMのPMSF </td><td> 500μlの</td></tr><tr><td></td><td> 0.5mMのDTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125μlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 水で500mlに持ち出す </td></tr></tbody></table> 表2。核抽出物の調製のためのソリューション。

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

を理解する遺伝子発現の大きな進歩は 、in vitro 系で使用して行われました。ほとんどの研究では、機能アッセイは、懸濁液で培養した細胞の10〜50以上リットルから大量に調製される抽出物を用いて行われている。しかし、これらの大規模な準備が急速に生体細胞の治療法や条件での様々な結果からそのin vitroでの効果をテストするに従順ではありません。このジャーナルのビデオ記事では、例としてHeLa細胞を用いて、機能的な小規模の核抽出物を調製するための方法を示しています。このメソッドは、接着単層として培養した細胞のようにいくつかの150 3 mmのプレートを用いて行われる。小規模の抽出の効率を示すために、我々は、彼らが結合されたRNAポリメラーゼII転写/スプライシング反応のバルク核抽出物のようにアクティブであることを示している。抽出プロトコルの有用性を実証するために、我々はスプライシングがHeLa細胞から調製した抽出物中に廃止されていることを示すsはスプライシング阻害薬E7107で処理した。小規模なプロトコルは、細胞抽出物を用いてin vitro で調べることができ、任意のプロセスまたは細胞型に一般的に適用する必要があります。これらは、小細胞集団の使用を必要とする薬剤、DNA損傷剤は、RNAi、またはトランスフェクション、など多くの薬剤にさらされる限られた量または細胞内でのみ利用可能です患者の細胞が含まれています。さらに、新たに培養した細胞の少量の便利な、そして/または、一部のアプリケーションで必要となります。

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

堅牢な、小規模のHeLa細胞核抽出物を調製するためのプロトコルが記述されています。このプロトコルはそのような薬剤又はRNAi処理した細胞などの細胞の小集団の使用を必要とするアッセイのために貴重なものです。方法は、患者の細胞を含む遺伝子発現アッセイおよび他の細胞さまざまな種類のに適用する必要があります。

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

small-scale-nuclear-extracts-for-functional-assays-gene-expression

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

25.9K ビュー.  Harvard Medical School. 堅牢な、小規模のHeLa細胞核抽出物を調製するためのプロトコルが記述されています。このプロトコルはそのような薬剤又はRNAi処理した細胞などの細胞の小集団の使用を必要とするアッセイのために貴重なものです。方法は、患者の細胞を含む遺伝子発現アッセイおよび他の細胞さまざまな種類のに適用する必要があります。

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

生物学

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

機能アッセイのための組織抗原の抽出

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...