著者らは、E1E4抗体の種類のギフト用サリー·ロバーツ（バーミンガム大学、バーミンガム、英国）に感謝したいと思います。この作品は、国立がん研究所（4R00CA137160-03）からの助成金によってサポートされていました。

1。カドヘリンの文化のための準備<ol><li>金属製のいかだグリッドは、多くの第一分化過程を妨げる可能性のある残留物を除去するためにクロム硫酸で処理することができます。一時間のために硫酸を含有するガラスビーカーに浸した金属グリッドは、その後継続的に水道水で一晩洗浄した。すすぎ一晩後、いかだグリッドは、蒸留水で3-5時間のためにリンスする必要があります。 </li><li>ラフトのサポートを提供するために、互いに等しい距離で約0.5cmいかだの3辺を曲げる。金属グリッドはその後オートクレーブする必要があります。 </li><li> 2.2グラム炭酸水素ナトリウムと4.8グラムのHepesを追加することによって、10X再構成バッファを準備します。 0.05 MのNaOH 100mlに溶解する。濾過滅菌し、-20℃で5ミリリットルのアリコートに格納</li><li>重炭酸ナトリウムなく、10X DMEMを準備します。濾過滅菌し、-20℃で5ミリリットルのアリコートに格納</li><li>マウス上皮細胞増殖因子を準備します。EGF 100mgのAとBの10 mgを溶かし、10ミリリットルのSAは、それぞれのddH 2 0脱。 EGFおよびBSAを結合し、100ミリリットルの合計体積の脱イオンのddH 2 0の80ミリリットルに追加します。ろ過滅菌し、アリコート（5ml）中、-20℃に保管しE培地の各リットルに1 mg / mlのEGF（最終濃度5 ng / ml）を5 mlを加える。 </li></ol> 2。コラーゲンゲルの調製<ol><li> Oneコラーゲンゲルは、それぞれのいかだに必要とされています。コラーゲンは凝固を防止するために氷上で保存する必要があります。コールドラット尾コラーゲンI型（最終濃度3から4 mg / ml）を、0.3ミリリットル10X再構成バッファ、0.3ミリリットル10X DMEM AND1-2×10 6マウスの2.4ミリリットル：各コラーゲンゲルは、以下から構成されるコラーゲンミックスの3ミリリットルを必要とするフィーダー細胞として3T3線維芽細胞のJ2。ラット尾コラーゲンの高濃度溶液の場合は、正しい仕事濃度を達成するために、0.02 M酢酸で希釈します。 </li><li>あなたが必要としてコラーゲンの量のマスターミックスを計算します。コラーゲンゲルの数（ラフト）、10X reconstitを決定utionバッファ、10X DMEMとJ2線維芽細胞が必要です。コラーゲンの粘度のために3月4日余分なゲルの各マスターミックスに十分含まれています。 </li><li>コラーゲンゲルを準備するには、J2線維芽細胞をトリプシン処理し、培地で中和する。 50 mlコニカルバイアル内のすべての線維芽細胞と場所を兼ね備えています。行うことができますラフトの数を決定するために細胞をカウントします。再び、1×10 6線維芽細胞がいかだあたりしたがって、コラーゲンゲルごとに必要とされています。低速度で細胞をスピンダウンする。 </li><li>計算されたラフトの数の線維芽細胞ペレットを再懸濁し10X再構成バッファの適切な量で、10X DMEMとコラーゲンから培地を吸引除去する。早すぎると凝固からゲルを防ぐために、最後のコラーゲンを追加します。コラーゲンが追加されると、すぐに混ぜますが、静かにゲル化気泡の導入を防ぐことができます。ゲルは、適切なpHの示す赤みがかったオレンジ色でなければなりません。ゲル混合物があまりにも黄色である場合、フィルタ滅菌1Nの滴のカップルを追加するNaOHおよび正しい色を得るために静かに混ぜる。 </li><li>コラーゲンの3ミリリットルを追加します。線維芽細胞の混合物を6ウェル培養皿のウェルに。コラーゲン混合物は、泡の生成を回避するために各ウェルの側をゆっくりとピペッティングする必要があります。 37℃の組織培養インキュベーター内でプレートを置き、30分間固化することができます。 </li><li> 30分後、固化したコラーゲンゲルの上にEGFをE培地3 mlを追加し、インキュベーターにプレートを返します。ゲルは、少なくとも1日に37°Cに保持しますが、4日以内に使用する必要があります。最適な結果を得るには、インキュベーションの2日後に発生します。 </li></ol> 3。差別化のために準備ケラチノサイト<ol><li>低い通路ケラチノサイトは約70％コンフルエントに成長する必要があります。それぞれのいかだには、1×10 6ケラチノサイトが必要になります。ケラチノサイトをトリプシン処理およびEGFのE培地で中和する。行うことができますラフトの数を決定するために細胞をカウントします。低SPEで細胞をスピンダウンED。計算されたそれぞれのラフト文化のEGFとE培地1ml中にペレットを再懸濁します。 </li><li>傾斜6ウェルプレートによるコラーゲンゲルから培地を吸引除去する。各ゲルにEGFと新鮮なE培地2 mlを追加します。それぞれのゲルには、慎重にも内にすでに存在するE培地2mlに再懸濁したケラチノサイトの1ミリリットルを追加します。ゆっくりピペットケラチノサイトに加えて、メディアの2 mlを、ゲルの上に秋の滴下戻ってみましょう。プレートを振とうまたは揺動すると、コラーゲンゲルの片側への細胞の不均一な分布になることがあります。 37℃インキュベーター内でプレートを配置します。 </li><li>細胞は、毎日のE培地を交換し、コンフルエントに成長する必要があります。細胞がコンフルエントにあるとき培地中に変更後の黄色の一日にメディア変更します。これは、通常2-4日間かかります。培地は一日4で変更されていない場合は、次のステップに進みます。 </li></ol> 4。ラフトの文化を作る<ol><li>滅菌した金属製のいかだのグリッドを配置するために滅菌ピンセットを使用して、側面が曲がっ、10cmディッシュに。コラーゲンゲルから培地を吸引除去する。井戸の両側からゲルを緩め、上下運動を用いた滅菌スパチュラを用いてゲルの周囲に移動します。コラーゲンゲルを削除するには、わずかに板を傾けて、ヘラの下に配置することによって持ち上げます。グリッドとゲルの間に気泡を発生させることなく、金属グリッド上にコラーゲンゲルを置きます。つのゲ​​ルは、各グリッドに配置することができます。 </li><li>気液界面を作るために、いかだのグリッドがメディアに触れているので、皿の底にゆっくりとEGFなしでE培地を追加しますが、コラーゲンゲルではありません。メディアは、グリッド内の穴を通って来るべきではありません。これは均一な分化を防ぐことができますので、グリッドの下に気泡が発生しないように徐々に培地を追加します。 37℃でラフトをインキュベートし、気液界面を維持し、一日おきに培地を変更します。 14日後にラフトを収穫。 </li></ol> 5。代表的な結果と、t彼プロトコルがプライマリケラチノサイトで正しく実行されている場合、この手順は、皮膚の異なる層が明白である高分化型上皮になります。これは、図1Bに示すように、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）用のいかだ文化の切片を染色して組織学的検査によって達成される。 H＆E染色では、ラフトと階層化と分化する細胞の能力にウイルスや抗ウイルス化合物の影響の形態を調べるためにも有用である。たとえば、HPV-不死化ヒト一次ケラチノサイト（HFK-31）から作られたラフトは特に厚く増殖率の増加と分化細胞をアクティブに維持するためにHPVタンパク質の能力を反映して、正常なヒト包皮角化細胞（HFK）から作られたラフトと比較されます細胞周期（図1B）10インチ上皮全体に核の保持この結果、正常なケラチノサイトの破壊、その結果、分化に細胞周期を終了するのに対し、核膜。より密接に差別化を調べるために、免疫組織化学は、サイトケラチンと同様に、インボルクリン、およびフィラグリンなど、特定の分化マーカーを調べるために行うことができます。別のサイトケラチンは、分化7の特定の段階で表現されています。図2に示すように、サイトケラチン10（K10）は、基底層で表現されていない、とだけ徐々に分化細胞で構成される基底上の層に含まれています。 HPV陽性のラフトに、K10の発現が再びケラチノサイト分化のHPVタンパク質の影響を反映して正常なケラチノサイトのそれに比べて遅れている。免疫組織化学は、ウイルス遺伝子の発現プロファイルを調べるために使用することができます。図3に示すように、式上皮の最上位層に限定されている後半のタンパク質であるHPVタンパク質E1 ^ E4の発現を調べる代表的な染色です。予想通り、全く染色が正常フーマーからいかだ培養で観察されないnは包皮ケラチノサイト。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> 図主なケラチノサイトまたは上皮細胞から器官いかだ培養を調製するための方法の1）。概要。安定したHPV-31（HFK-31）エピソーム、または正常なヒト包皮角化細胞（HFK）からを維持するヒト包皮角化細胞から生成されたカドヘリン培養のB）、ヘマトキシリン​​およびエオシン染色。個々の上皮層が識別されるだけでなく、コラーゲンプラグインされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> 図2：サイトケラチン10（K10）の発現は上皮の基底層直上の層に限定されています。免疫組織化学は、HFK-31細胞と同様に、K10に対する抗体を使用して、通常のHFKsから生成されたカドヘリンの文化の断面を行った。細胞のDNAはDAPIで対比されました。画像は、confを使用してキャプチャされましたOCAL蛍光顕微鏡。矢印は上皮の基底層を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> 図3。HPV E1 ^ E4タンパク質が遅いウイルスのライフサイクルの生産段階で生成されます。免疫組織化学は、HFK-31細胞と同様に、E1E4に対する抗体を用いて通常のHFKsから生成されたカドヘリンの文化の断面を行った。細胞のDNAはDAPIで対比されました。画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いて捕獲された。矢印は上皮の基底層を示しています。

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	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは一般的には上皮分化を研究するために使用できるメソッドを記述するだけでなく、容易にウイルスの病原性と同様に、潜在的な治療薬の有効性を研究するために適応させることができます。多くのウイルスは、ヘルペスウイルスと同様に、HPVの場合のように、またはウイルスのライフサイクルのある時点で、感染症のプライマリサイトのいずれかとして上皮細胞を標的とする。宿主細胞の相互作用：カドヘリンの文化を育てるには時間がかかるのですが、忠実に生体上皮分化に要約する能力は非常に有用なウイルスを調べるためのメソッドを提供します。確認応答が成功しなければならないいくつかの重要なステップがある完全に分化した上皮細胞を成長させる。いかだ培養で分化する能力を保持するために、1つは、ケラチノサイト単層を維持するために、コラーゲンゲル内で線維芽細胞フィーダー十分な数を持っている必要があります。いかだの文化の貧困層分化はまたケラチノサイトの密度が低すぎるのが原因である場合もありますコラーゲン上：線維芽細胞のゲル、不適切ないかだの建設、またはメディアが毎日変更に失敗した。上皮分化の品質を確保するために考慮しなければならない一つの追加パラメータが使用される線維芽細胞フィーダーのタイプです。ここで説明する手順については、マウス3T3繊維芽細胞J2を用いた。他の線維芽細胞をフィーダーとして使用することができますが、それは急速に分裂する線維芽細胞、または、潜在的に皮膚表面にできませんused7を移行することをお勧めします。このプロトコルは14日後にラフトの収穫を求めていますが、ラフトはこの時点で前と同様に、後に収穫することができます。しかし、14日後にラフトは徐々に薄くなります。免疫組織化学的分析のためのいかだの文化を切片に加えて、ラフトはまた、RNAとDNAと同様に、ウイルス産生のために採取することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ラット尾コラーゲン1型（4-5mg/ml） </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354236 </td></tr><tr><td> NaHC0 3なしのDMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td>シグマ</td><td> S5761 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>カルビオケム</td><td> 391338 </td></tr><tr><td>ステンレス鋼の金属グリッド</td><td>ウィリアムズと気概（株） </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E媒体11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

器官上皮いかだの文化の発展は、in vitroの系を忠実に繰り返すという上皮分化に効率的に研究を提供しています。このシステムには多くの用途があります。例えば、ケラチノサイトの三次元カドヘリンの文化を成長させる能力は、ヒトパピローマウイルス（HPV）1の研究において重要なマイルストーンであった。 HPVのライフサイクルは、しっかりと扁平上皮の2分化にリンクされています。器官上皮いかだ培養は、ウイルス産生3,4,5を含む全体のパピローマウイルスのライフサイクルを再現ここで示された。さらに、これらのラフト文化はHPVを用いた in vivo感染の際に観察されたものと同様の異形成病変を示す。したがって、このシステムは、上皮細胞がんと同様に、一般に上皮細胞の分化に及ぼす薬物の効果を研究するために使用することができます。もともとAsselineauとPrunierasによって開発された<sアップ&gt; 6とKopan らによって変更されます。7、器官上皮いかだ培養システムは、コラーゲンに細胞の増殖を伴う一般的な、比較的容易に培養モデル、へと成長した気液界面（図1A）を維持し接続します。 10-14日の間に、細胞が層別化と差別化、分化特異的なケラチンを生成する完全な厚さの上皮を形成する。収穫ラフトと同様に標準的な分子生物学的および生化学的手法により、組織学的に調べることができます。本稿では、初代ヒトケラチノサイトからいかだ文化の生成方法を説明します。同じ手法が確立され上皮細胞株で使用でき、かつ容易に正常または病気の生検8から上皮組織での使用に適合させることができます。その複製のライフサイクルの一環として、多くのウイルスのターゲットのいずれかの皮膚または粘膜上皮。過去数年間、カドヘリンカルトを使用しての可能性ウイルス-宿主細胞の相互作用を研究する方法としてURESは、いくつかのヘルペスウイルスと同様に、アデノウイルス、パルボウイルス、およびポックスウイルス9に示されている。カドヘリンの文化は、このようにウイルスの病原性を調べるために適応し、永続的な細胞株での耕作ではありませんこれらのウイルスのための新規な抗ウイルス剤をテストする唯一の手段であることができます。

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Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

不定冠詞<em&gt; in vitroで</em模倣する&gt;メソッド<emin vivoでの&gt;</em&gt;上皮分化が記載されている。多くのウイルスは、ウイルスのライフサイクルの一環として、上皮細胞を標的とし、この方法は、ウイルスを調べる手段を提供します。ホストの相互作用より密接に発生することに似ている<emin vivoでの&gt;</em&gt;。この技術は、主ケラチノサイト、確立された細胞株と同様に、正常なまたは病気の生検組織で使用することができます。

初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K ビュー.  University of North Carolina-Chapel Hill. 不定冠詞 in vitroでメソッド上皮分化が記載されている。多くのウイルスは、ウイルスのライフサイクルの一環として、上皮細胞を標的とし、この方法は、ウイルスを調べる手段を提供します。ホストの相互作用より密接に発生することに似ている。この技術は、主ケラチノサイト、確立された...

ビデオ: Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

発生生物学

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

がん研究

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

生物工学

Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis

Source: Jingting Li et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>, J. Vis. Exp. (2015).
This video protocol describes a cassette-based in vitro culture technique to generate&#160;human organotypic skin using epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. They mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

器官型3D皮膚培養:無細胞真皮上にヒト表皮を再生するためのカセットベースのIn Vitro培養技術

Source: Jingting Li et al.  Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis, J. Vis. Exp. (2015).
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

皮膚がん

アッセイと技術

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

Genetic Modification of Primary Human Keratinocytes: A Method for Genetically Manipulating Keratinocytes Using Recombinant Retroviruses

Source: Li, J. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>. J. Vis. Exp. (2015)
This video describes a detailed protocol for producing genetically modified primary human keratinocytes recombinant retrovirus. This method can be used to manipulate gene expression in keratinocytes.

初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

要約

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この動画の章

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

器官型3D皮膚培養:無細胞真皮上にヒト表皮を再生するためのカセットベースのIn Vitro培養技術

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変:組換えレトロウイルスを用いたケラチノサイトを遺伝子操作する方法

初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

要約

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失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

器官型3D皮膚培養:無細胞真皮上にヒト表皮を再生するためのカセットベースのIn Vitro培養技術

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変:組換えレトロウイルスを用いたケラチノサイトを遺伝子操作する方法

世代、大人の肌からプライマリヒト角化培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法