この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。

1。フローセルの準備<ol><li>カバーガラス（＃1.5、22x22 mmと22x40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。 <ol><li>カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。 </li><li>イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。 </li><li>イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または類似のデバイスによって生成された脱イオン水のおびただしい量でカバースリップをすすいでください。水で容器を満たし、20分間超音波洗浄します。 </li><li>超音波処理した後、濾過し、埃のない空気の流れにカバースリップを乾燥させます。 （すなわち、汚れ）きれいに見える唯一のカバースリップを使用しています。 </li><li>静かに炎が数秒間カバースリップは、残っているほこりや湿気からそれらをきれいにする：過剰な熱のためにカバースリップをワープしないように注意しながら、ブンゼンバーナーで生成ガスの炎を介してカバースリップを渡します。このステップでは、残留表面を削除します汚染物質。 </li></ol></li><li>両面スコッチテープを使用して、2つのカバースリップを添付してください。テープカット〜長さ3センチ、幅0.3センチメートル。真ん中の1.6 cmのチャネルを残して22x40 mmのカバースリップ上のテープを取り付けます。穏やかにテープが正しく付いていることを確認するためにカバースリップを下に押すようにピペットチップを使用しています。 </li></ol> 2。磁気ピンセットのセットアップとキャリブレーション<ol><li>磁気ピンセットは、以前に10,12説明したように永久的な希土類磁石を使用してセットアップした。アルミL型ブラケットは1 mm径のピンホールを使って構築および垂直方向のz変換（Thorlabs）ピンセットの高さを調節するために装着した。 2つの永久希土類磁石は、磁気トラップ（ 図1）を作成するためのピンホールの両側にブラケットに取り付けた。 </li><li> DNAの調製：その5 &#39;および3&#39;末端標識したラムダファージからのDNAをビオチンとジゴキシゲニン（IDT DNA、サンディエゴ、CA）の端部が眼のキャリブレーションをするために使用されたneticピンセット。 <ol><li> 60〜40 nMのビオチンコンジュゲートオリゴヌクレオチドと熱の2μL℃で10分間で4 nMでλ-DNA50μLを混合します。 1時間かけて室温でゆっくりとクール。 </li><li>製造元の仕様に従って、DNAリガーゼを追加し、3時間室温でライゲーション。 </li><li> 45分間室温で400nmのジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドとインキュベート2μLを追加します。 </li><li> 10mMのATPの1.5μLを追加し、3時間λ-DNAをジゴキシゲニン共役オリゴヌクレオチドのライゲーションを続行します。 </li><li> 100 kDaのスピンフィルタ（マイクロコンUltraCellはYM-100）を使用して、過剰なオリゴヌクレオチドおよびDNAリガーゼを削除します。 TEバッファーで1000倍のバッファー交換の合計は、過剰なオリゴヌクレオチドを​​除去するために十分である。注：DNAの剪断につながるので、スピン速度&gt; 500xGを使用しないことが重要です。 </li><li>そのDNA I確保するために0.7％アガロースゲル上で電気泳動によるDNAのサンプルを調べるsは変性またはせん断はありません。 </li><li> DNAの濃度を測定します。使用可能なサンプル量が非常に小さい可能性があるため、光度計紫外 - 可視分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）の使用が推奨されます。 </li></ol></li><li>セクション1で説明したようにフローセルを準備します。 </li><li>フローセルへのDNAの結合のための、抗ジゴキシゲニン抗体（ヒツジIgG、1μgの添加-1;バイオロシュ、マンハイム、ドイツ）を追加し、それが15分間ガラス表面に付着することができます。 </li><li> 1X PBSで2ミリグラムmL -1の BSA、0.1％Tween-20を追加することにより、DNAの非特異的付着を防止するために、フローセルの表面を不動態化。 45分間室温でインキュベートします。 </li><li>手順2.5を繰り返します。 </li><li> fuctionalizedλ-DNAの50 pmを追加し、15分間カバースリップにアタッチすることができます。 </li><li> 1X PBSで過剰なDNAを洗い流す。 </li><li> = 20μgのmL -1のは 2.8μmのビーズを、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の追加</s&gt;アップ）し、それらを15分間固定化DNAにアタッチすることができます。 </li><li> 1X PBSで過剰なビーズを洗い流す。 </li><li>磁気ピンセットのキャリブレーション<ol><li>遠く離れて試料表面から（&gt; 15 mm）である位置に永久磁石を移動します。 </li><li>顕微鏡で準備されたフローセルを配置します。 </li><li>フローセル上の位置に永久磁石を移動します。 </li><li>離れてガラス面の両方からビーズに焦点を当ててλ-DNAの官能ビーズの焦点面を選択します。正しい焦点面は、所望のビーズが明るい中心を持っているものである。 </li><li> 500フレームの場合、80 Hz以上ではビーズの動きのビデオを取る。 </li><li>近い試料表面に磁石を移動します。 5ミリメートルを超えた距離については、1ミリメートル単位で移動します。 1〜5ミリメ​​ートルの間の距離については、0.5ミリメートル単位で移動します。 1ミリメートル未満の距離で、0.25ミリメートル単位で移動します。 </li><li>それぞれの新しい磁石の位置にステップ2.11.5と2.11.6を繰り返します。 </li><li>各データの2Dガウスフィットを用いてビーズの中心を追跡し、設定します。 </li><li>を使用してブラウンの変動を介して力を計算します。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" /> K B Tはボルツマンの熱エネルギーである、Lは λ-DNAの長さであり、&lt;x 2&gt;重心位置の分散である。 <ol start="10"><li>ロールオフ周波数を見つけるために、パワースペクトルローレンツフィットを介して力の計算をチェックすることによって、力の精度を確認してください。応用力の関係でロールオフ周波数に関連しています。 </li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" /> ƒ0がロールオフ周波数である、ビーズの半径であり、μは流体の粘度は12です。 </li></ol> 3。フローセルにコラーゲンペプチドアタッチメント私たちの方法論を適用するための具体的な例を提供するために、我々は三量体コラーゲンモデルペプチドのタンパク質分解の特徴を我々の研究室における最近の研究について説明します。我々は、この一般的なアプローチが広く、他のタンパク質およびポリヌクレオチドに適用することができることを期待しています。 <ol><li>コラーゲンモデルペプチド三重らせん形成を強制するために5倍のmycタグ、（GPP）10、続いて精製するためのN末端​​6X Hisタグ、フォームコラーゲンα1残基772から786（GPQGIAGQRGVVGL）、MMPを構成されてい1認識部位、foldonシーケンス（GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）、およびビオチン-マレイミドでラベルを容易にするために、C末端KKCK。 Foldonは、T4ファージのタンパク質fibritinから派生し、Nのいずれかで融合させたときにコラーゲンモデルトリマーを安定化させる-またはC末端13,14。 </li><li>以前は4,15説明したようにコラーゲンペプチドおよびMMP-1蛋白質を発現させ、精製した。&lt;/ LI&gt; <li>抗-mycフローセルの表面にアタッチできるように室温で20分間フローセルとインキュベートする（15μgのmL -1）を抗-mycを追加します。 </li><li>ステップ2.5で説明したのと同じ方法で、5 mgのmL -1の BSAを用いたタンパク質の非特異的付着を防ぐために、フローセルを不動態化する。 </li><li> 150 PMのコラーゲンペプチドを追加し、45分間mycタグを介して抗体に添付することができます。 </li><li> PBS緩衝液を用いて過剰なコラーゲンを洗い流す。 </li><li>ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1μmのビーズ=2μgのmL -1の 2.8μmのビーズ= 20μgのmL -1）を追加し、それらを45分間コラーゲン分子にアタッチすることができます。 1μmのビーズをPBSで所望の濃度に希釈する必要があります。 3μmのビーズをPBSでresolubilized強力な磁石を使用して、溶液から分離する必要があります。このプロセスを3回繰り返す必要があります。我々は、このステップは、GEにとって不可欠であることに気づいたT 3μmのビーズは、表面固定化コラーゲンペプチドに結合する。 </li></ol> 4。力のタンパク質分解アッセイ<ol><li>一度フローセルは、低〜1 pNの力の下で磁気トラップ内のイメージフローセルは、コラーゲンペプチド、磁気ビーズで組み立てられています。我々の経験では、ビーズの集団は、しばしば弱く、非特定の方法で表面に付着されています。ささやかな力のアプリケーションは、これらのビーズは解放であることを保証します。 </li><li>フローセルに活性化酵素を追加します。このケースではMMP-1は3.5 mMのAPMA（4 - aminophenylmercuricアセテート）を追加することによって、事前に活性化され、3時間37℃でインキュベートした。活性化は、SDS-PAGEを用いて検証した。 </li><li>フローセルは、磁気ピンセット装置に再導入されているとすぐに、通常は数百添付のビーズをもたらして、ビューのいくつかのフィールドにまたがるビデオを記録します。これは 、t = 0になります。 </li><li> tを返すときにビュー（のいくつかのフィールドを記録するのと同じプロセスを繰り返します。、定期的な時点で）ビューの同じフィールドをoすべてのビーズは切り離すまでまたはそれ以上のタンパク質分解は、識別可能ではありません。 </li><li>キネティック·データ解析<ol><li>異なる時点でのビューの様々な分野でビーズをカウントし、それらを平均。 t = 0でのビーズの数によって各時点でビーズの平均数を割ることによってビーズの数を正規化します。ビーズの絶対数は、実験に実験とは異なりますので、これは、我々は別の実験からタンパク質分解の速度を比較することができるようになります。 </li><li>時間の関数としての比をプロットします。このケースでは、指数関数的減衰に加えて定数にそれを装着。 </li></ol><img alt="式（3）" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" /> f（t）は （またはコラーゲン分子がunproteolyzed）を添付したビーズの比であるここで、tは時間であり、コラーゲンのテザーによって結合ビーズの割合で、bは減衰率は一定であり、c非特異的に接続されているビーズの割合です。 <ol start="3"><li>同じ実験はMMP-1によるコラーゲンのタンパク質分解に力の効果を明らかにする力とMMP-1濃度を変化させることで繰り返されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果上記のプロトコルは、酵素のタンパク質分解に力の効果を研究するための磁気ピンセット（ 図1）の新たな使用方法について説明します。我々は、観測されたブラウン運動の変動の大きさと様々な磁石の位置（ 図2）でロールオフ周波数の計算の両方を使用して、1μmと3μmのビーズ用ピンセットを校正されています。力のタンパク質分解実験では、セットアップでは、DNAはコラーゲン（ 図3、図4）に置き換えられていることを除いて似ています。残りのビーズの正規化数は、タンパク質分解率（ 図5）を見つけるために時間の関数としてプロットすることができ、このプロセスはすることができます酵素濃度と力を変化させるために繰り返されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" /> 図1磁気トラップのキャリブレーションプロセスの模式図（スケールしないように）。 2つの永​​久希土類磁石は、超常磁性ビーズを引っ張る磁場を作成します。上下に磁石を翻訳することに加わる力を調整します。ビーズは、二つの磁石の間にピンホールを通過した光で、従来の明視野顕微鏡を用いて画像化されている挿入図 ：40倍空気の目的で撮影した画像。シャープ、丸いスポットはカバースリップの表面に付着したビーズに対応しています。アウト·オブ·フォーカスオブジェクトがデタッチされたビーズです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" /> 図2は1μm（ 左 ）および2.8ミクロン（ 右 ）ビーズのために試料表面から磁石の距離の関数としてのキャリブレーション力のプロットだ。データは、経験的関数に適合させた<img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" /> ここで、x は、磁石からの距離です。= 31.8、B = 5.61、cは1μmのビーズとのために= 4.39 = 140、B 3μmのビーズ= 3.10とc = 1.86。これらの値は、私たちの特定の測定器と実験的幾何学に固有であり、各楽器を個別に校正する必要があります。各ポイントでのエラーバーは、ビーズの大きさのばらつきに起因するビーズ基礎にビーズ上に印加される力の約10％の変動を表しています。加えられた力は、ビーズの体積に比例し、ビーズ量は（メーカーの仕様に応じて）平均以上〜9％に変化します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" /> 図3。フォースタンパク質分解アッセイのセットアップ（実寸ではありません ）。コラーゲンモデル三量体は 、mを介してカバースリップの表面に取り付けられているYC /抗-myc共役。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、ビオチン - ストレプトアビジン結合を介してコラーゲントリマーに取り付けられている。活性化MMP-1カット時間の経過とともにコラーゲン、ビーズ表面からデタッチし、焦点面から離れて移動させる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" /> 図4：時間の関数としてのタンパク質分解の模式図漫画。タンパク質分解が発生すると漫画は、時間の経過ビューのサンプルフィールドを示しています。時間が経つにつれて、MMP-1カットコラーゲンとビーズがデタッチと磁場の影響下で焦点面から離れて移動します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" /> 図5。タンパク質分解率が適用された力16に依存しています。 6.2 PN（3μMのMMP-1、 赤 ）および13 PN（0.2μMのMMP-1、 メイジ 、1.0 PN（ ブラック 3μMのMMP-1）で収集したデータも示されNTA）。タンパク質分解の速度（フィットパラメータ）は次のとおりです。0.22±0.02分-1（1 PN）、0.46±0.09分-1（6.2 PN）、および2.08±0.18分-1（13 PN）。長い時間のポイント（&gt; 15分）unproteolyzedビーズの割合は、異なる実験間で〜0.25でほぼ一定のままです。エラーバーは、各時点で観測値の数を反映したポアソン統計に対応しています。 n個のビーズの各時点でのエラーは 、n 1/2である。接続されているビーズの割合で発生したエラーは、エラーpropagation.1μmのビーズが1.0 pNで、6.2 pNの実験に使用した、2.8μmのビーズが13 pNの実験に用いたことにより算出した。

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U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li><li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding.">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。 磁気ピンセットの制限事項光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、ここで説明したシンプルなMTによって生成された力は、日常的にAFM実験でアクセスの力を大幅に下回る30 PNまたは以下である。この制限は、美徳であることができます：MTはよく、サブpNの力を適用するために適しています。 そのようなここ装置などの光学トラップやAFM、従来のMTとは異なり、個々の粒子の操作を許可されていません。光トラップは通常、MTは垂直引っ張り実験のために最高に適している一方で、カバースリップに平行に力を適用するために使用されています。 ElectromagneチックMTが増加し複雑さのコストであるが、これらの制限に対処します。 ピンセットキャリブレーション力校正のためのブラウンの変動とパワースペクトル解析の両方がそれらの制限があります。私たちは、ブラウン変動法はカメラブラーに特に敏感であることがわかった。フレームレートが増加するにつれて（露光時間は減少）を計算力が減少した。ブラウンの変動から計算力が10％以内にパワースペクトルを用いて算出勢力と合意するまで、実際には、我々は、フレームレートを増加させた。逆に、パワースペクトル解析は、カメラのブレに対してより堅牢ですが、実装することが少し難しくなります。我々は、結果の頑健性を確認するために、両方の計算を実行することをお勧めします。 我々は、ビーズのサイズと約10％の適用力の変化で磁性粒子含有量の結果でその変化を注意してください。この効果は、我々の最近の実験である重要ではありませんでした各測定のビーズの数百以上我々は平均的な原因となります。ただし、各係留ビーズからユニークな情報を抽出する実験では、潜在的に、より正確なキャリブレーションの方法が必要となります。 一点の添付ファイルを確保するためのコントロール特定の、指向、シングルポイントの添付ファイルを達成することはしばしば単一分子の研究で実用的な課題となっています。以下のコントロールは、抗体へのコラーゲンの特定の添付ファイルを確認し、コラーゲンのビーズ： <ol><li> BSAで不動態化フローセルにのみビーズを追加しました。 </li><li>抗-myc、BSAで不動態化して、追加されたビーズを追加しました。 </li><li> BSAで不動態化、 抗 myc追加された、非ビオチン化コラーゲン、その後追加されたビーズを追加しました。 </li><li> BSAで不動態化、非ビオチン化コラーゲン、その後追加されたビーズを追加しました。 </li><li> BSAで不動態化、ビオチン化したコラーゲンとを添加し、ビーズを追加しました。 </li><li> BSAで不動態化、 抗 myc追加された、ビオチンが追加されましたylatedコラーゲン、その後追加されたビーズ。 </li></ol>のケースでは0から4ビーズのどこからでも添付ファイルシリーズの一部のコンポーネントが故意に省略された1-5、ビューのフィールドごとにフローセル（80,000μmの2）に接続されている見られた。のみすべての添付ファイル部分が存在する場合は6に、我々は30から60〜2.8μmのビーズと表面に付着した80から2001μmのビーズを見た。タンパク質分解の速度は十分に単一の指数関数に加えて強くステップを制限する唯一の速度、したがって、単一のテザーがあることを示唆している定数項によって、適している観察した。定数項は、おそらく非特異的にカバースリップに接続されているビーズを反映しています。 我々は実験のために働いた抗体やタンパク質の濃度を報告します。新しいアッセイを開発する際に、各成分の濃度の広い範囲を検討する必要があります。 BSAは、我々の実験では表面パッシベーション剤としてうまくいった。しかし、これが満たされHODは、すべての状況では動作しない場合があります。表面パッシベーションのための他のプロトコルも成功を収めて使用されている。例としては、ポリエチレングリコール官能スライドガラス17、ブロッキング剤などのサポートされている脂質二重膜18、またはカゼインが含まれています。 データ分析上の注意相互作用-力タンパク質分解実験では、非共有結合（ストレプトアビジンなどのビオチン）の解離に起因するいくつかの非特異的な剥離（特により高い力19で）常にある。我々はAdhikariらに記載されませんMMP-1、含まない様々なMMP-1濃度でタンパク質分解を測定することにより、この現象を占めています。らすべての力のための様々なMMP-1濃度でタンパク質分解を測定する私たちは、酵素の猫 / K M K触媒効率を計算するために使用されるミカエリス-メンテンの曲線を生成することができます。酵素の種々の濃度が使用されていない場合、代わりにことをお勧めしコントロールの測定は、非特定の剥離率をオフに減算する与えられた力で、酵素なしで行われる。 潜在的なアプリケーション磁気ピンセットは、広い荷重範囲をカバーしています。発揮することができる力は、ビーズの大きさに依存します。 1μmと2.8μmのビーズは、中間の力でビーズのいずれかを使用して、アクセス可能な力で、我々の経験に重なってうまく動作します。 我々は、同様の実験的アプローチが21との結合相互作用22を展開、力依存性タンパク質分解4,20を研究する上で広範囲に適用できる可能性があることを期待しています。我々や他の23は、フォーカスのビーズのうちの回折リングの半径はカバースリップ23にビーズの相対的な位置を追跡するための敏感な手段を提供することを指摘している。一般的にこのような方法で使用されていないが、我々はMTアッセイは、ナノメートル精度の測定を提供する能力を持っていると信じているタンパク質構造力学のurements。この追加情報は力依存性蛋白質分解または結合の測定値のコンテキストで特に有用かもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x22） </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス＃1.5（22x40） </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td>ラムダDNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td>マイクロコンウルトラYM-100 </td><td>ミリポア</td><td> 42413 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20を</td><td>シグマ</td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> 抗 Myc抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 46から0603 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td>ダイナビーズM-280ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td>ダイナMyOne T1ストレプトアビジン</td><td>インビトロジェン</td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> P-Aminophenylmercuric酢酸</td><td>カルビオケム</td><td> 164610 </td></tr><tr><td>ビオチン - マレイミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1267 </td></tr><tr><td>ビオチンは、オリゴを標識した</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>オリゴ標識したジゴキシゲニン</td><td> IDT DNA </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>コラーゲンペプチド遺伝子</td><td> DNA 2.0 </td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td> MMP-1のcDNA </td><td>ハーバードプラスミドデータベース</td><td></td></tr><tr><td> Z-変換</td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td>翻訳者のためのサーボコントローラ</td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolysis measurements using magnetic tweezers

機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。 このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K ビュー.  Stanford University. この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

生物工学

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

要約

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コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

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コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡