この作品は、健康グラントR01 EB - 008836とR01 HL083895（LENの両方）の国民の協会によって資金を供給される。我々は研究のためのバイオリアクターを作るためにダリルスミス、大学のガラス吹き工を、感謝することができます。

オートクレーブ図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分（バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋）のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。 1。縫製PGAメッシュ<ol><li> 1.1センチメートルX〜8cmのシート（バイオリアクターのサイズに依存）にPGAメッシュを切る。 </li><li>蒸留水（・ Alarm_D）および使用する前に、乾いた空気ときれいなシリコンチューブ（3ミリメートル内径）。 </li><li>シングルステッチに続く3つの手術のノット​​で始まるクリーンなシリコンチューブの周りにPGAメッシュを縫うためにDexon 6.0縫合糸を使用してください。 </li></ol> 2。 PGA足場表面処理<ol><li> 1 - 2分、処理時間を記録し、すべてのPGA足場に同じ時間を使うための1MのNaOHのディップPGA足場。 </li><li> 2分間3回dH2O風呂でPGA足場をすすぐ。 </li><li>パットPGAはのdH 2 Oバスの各ディップの間にキムワイプで乾燥した足場。 </li><li>組織培養フードの下で乾燥したPGAは、足場上に送風機で15分間風乾する。 </li></ol> 3。ミシンダクロンアーム<ol><li> 2〜3ミリメートルのオーバーラップのPGAメッシュの各端にダクロンの袖口（1CM）の小片を縫うためにProlene 4.0の縫合糸を使用してください。注：ない穿刺のシリコンチューブ（図3）に注意してください。 </li><li>ダクロンの袖口の自由端3周ステッチを縫うために、同じ糸を使用してください。ステップ5.1のProlene縫合（図3）の自由端で十分な縫合糸を残していることを確認します。 </li></ol> 4。バイオリアクターのアセンブリ（バイオリアクターの培養開始前日） <ol><li>縫製メッシュとシリコンチューブ、手術器具、20〜30分間70％エタノール浴中の細い線を浸す。 </li><li>前の組み立てに少なくとも30分間70％エタノール浴中のバイオリアクターと浸し、それを含むオートクレーブ袋を開きます。エタノールで徹底的にバイオリアクターをフラッシュすることを確認してください。 70％エタノールへのすべてのバイオリアクターのコンポーネントの曝露は、加算の滅菌工程です。このステップでは、オートクレーブで除去されていないエンドトキシンを、削除して、血管細胞に有害です。 </li><li>それを介してプルに細いワイヤーを使用して、サイ​​ドのアームを介してシリコンチューブを引き出します。 </li><li> （エタノールに浸けメッシュを保つ）エタノール浴からバイオリアクターを取る。 Prolene縫合（図3）締めと上下連結して、フレアガラスの唇上のダクロンの袖口を締め込んで、バイオリアクター内のPGA足場を修正。 </li><li>シリコンチューブを介してコネクタにバイオリアクターのサイドアームの片側を接続します。 </li><li>十分なテンションでシリコンチューブの反対側を引っ張るとシリコンチューブに残りの二つのコネクタを挿入します。コネクタを挿入するときにしっかりとシリコンチューブにホールド！ </li><li>再び挿入のエタノール浴にバイオリアクターと静かにサイドアームのコネクタを引き抜き、エタノールで洗い流してください。 </li><li>バイオリアクターを裏返し、10分間浸すことができます。 </li><li>フリップバイオリアクターは、右サイドアップしてさらに10分間浸す。 </li><li>すべてのエタノールを排出します。 </li><li>チューブの端部から滴下過剰のエタノールを保持するために中央の皿の中でシリーズと場所バイオリアクターに3つの大きなペトリ皿を（10cm）に設定します。 </li><li> 5ミリリットルまたは10mlのピペットを用いて組織培養水をバイオリアクターとPGAメッシュをフラッシュします。シリコンチューブにもフラッシュの組織培養水。 </li><li>徹底的にバイオリアクターのいずれかの側にペトリ皿にすべての余分な水を抜く。 </li><li>上に送風機付きフードとUVのOFFで一晩乾燥したバイオリアクター。 </li><li>追加メモ：滅菌攪拌棒がバイオリアクターになっていることを確認。汚染を避けるために、前方にこの点から、バイオリアクターの上に&quot;置く&quot;にしないようにしてください。パラフィルムのストリップの多くをカットし、小70％エタノールのバス（大型のペトリ皿がうまくいく）でそれらを浸す。 </li></ol> 5。 1日目：バイオリアクターのセットアップ<ol><li>汚染物質からPGA足場の内側を保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌ペトリ皿を置きます。 </li><li>図4およびパラフィルム、すべての接続の関節に示すようにバイオリアクターへのフローシステムを組み立てます。 <ol><li>アルコール綿で最初のコネクタを拭きます。 </li><li>バイオリアクターの第三の、未使用の腕に注入口を取り付けます。 </li><li>セイウチのチューブを外し、できるだけY -ジャンクショ​​ンの近くに設定された生理食塩水希釈の青い端を結紮する。チューブのこの部分には液体の転送のないことを確認するために設けられている、チューブクランプを引いて</li><li> IVの袋を取り外し、及びIVの袋の遠端にセイウチのチューブ（赤）を接続します。アルコールが最初にワイプで挿入口を拭くようにしてください。 </li><li>フローシステムの一方の側（白端チューブを介して）にセイウチを取り付けます。 </li><li>フローシステムに3方活栓を挿入します。 </li><li>圧力トランスデューサを取り外します＆三方活栓に接続します。 </li><li>袋の中央の開口部に圧力変換器のもう一方の端を取り付けます。 </li></ol></li><li>接続Y -ジャンクショ​​ンを経由して流れのシステムへのバイオリアクター。 IVの袋に1％fungizone（PBSの495ミリリットルとミックス5ミリリットルのfungizone）の350ミリリットルを追加するには、60ミリリットル注射器を使用してください。 </li><li> PBSの流れを可能にするためにストップコックを調整して流れるシステムをフラッシュするためにIVの袋を絞る。注：そこに漏れていることを確認しないためにバイオリアクターの中身をチェック。 </li><li>各PGA scafffold上に培地と種子の1.25ミリリットルで再懸8 × 10 6平滑筋細胞（約コンフルエントT75）。細胞懸濁液が均一にPGAメッシュの底面側にだけでなく、PGAメッシュダクロンのジャンクショ​​ン上に滴下されていることを確認します。 </li><li>アルコールは、バイオリアクターは、横向きにホバリングを避けるために回転を経由してワイプでバイオリアクターのリムを拭いてください。 </li><li>シリコンストッパーの蓋のアセンブリ（図2） <ol><li>オートクレーブ袋ピールバック慎重に、蓋の底部を露出しないようにして作る。 </li><li>オスコネクタで栄養チューブに注入口を取り付けます。 </li><li> three空気ポートのそれぞれにPTFE 0.20μmのフィルターを取り付けます。 </li><li>このプロセス中に公開する/蓋の底面に触れないように注意してください。 </li><li>パラフィルム注入口。 </li></ol></li><li>ガラスのバイオリアクターにシリコンストッパーの蓋を挿入し、バイオリアクター内の栄養チューブがシードPGAの足場に接触しないことを確認してください。蓋の周りパラフィルム。 </li><li>インキュベーター内部の流れのシステム（その側）とバイオリアクターを配置し、バイオリアクターの25〜30分が5分おきに回転させる。 </li><li>で説明されているように私たちの40から10培養培地の400ミリリットル（表1）とバイオリアクターチャンバーを埋める。この培地は、ブタ工学動脈のために&quot;最適化&quot;されています。 </li></ol> 6。日6-7：ポンプをオンにし、まず食べさせる<ol><li> 6-7日のためのシリコンチューブを介してポンピングどんな拍動することなく、静的に生成済の足場を拡大。この時間の間に培地交換やビタミンCの補充は必要ありません。 </li><li>ポンプの電源を入れる前にPBSまたはフローシステムのチューブのよじれの漏れがないことを確認してください。 </li><li>フローシステムのポンプの電源をオンにし、圧力が約270/-30mmHg読み取るようにポンプの設定を調整することを確認してください。 </li><li>レコード文化を通じて日々プレッシャーと270/-30mmHgの圧力を維持する。圧力トランスデューサーは、圧力を読んで、監視するコンピュータに接続することができます。 </li></ol>最初の給餌<ol start="5"><li>培地交換や培地廃棄物廃位両方の目的のために蓋を餌に注入ポート＆PTFEフィルターを組み立てます。 </li><li>ポンプにしっかりと栄養チューブを置き、餌蓋にバイオリアクターのポート、もう一方の端を供給する一方の端を差し込みます。エタノールのワイプで注入ポートを拭いていることを確認してください。 </li><li>培地の200ミリリットルを汲み出すために双方向のMasterflexポンプを使用してください。その後、バイオリアクターに戻って新鮮な培地の200ミリリットルをポンプするための新しい栄養チューブを使用してください。常にバイオリアクターに戻って培地をポンプ場合は特に、非常に遅い速度で始まります。 </li><li>培地とサプリメントのアスコルビン酸の2x/weekを変更します。アスコルビン酸を追加するには、培地の25ミリリットルを取り出し、組織のボンネットに置いて置くために30ミリリットル注射器を使用してください。 PBS 5mlのでアスコルビン酸の25mgを溶解し、0.22μmフィルターを通してそれをフィルタリングする。最初の栄養チューブに無菌のアスコルビン酸を注入し、それ以前の取り出し25ミリリットル培地を再度追加します。培地レシピを表1に示されている。 </li></ol> 7。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。フローシステムのアセンブリのためのチューブとコネクタを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。シリコンストッパーの蓋のアセンブリを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。バイオリアクターアセンブリの回路図は、上記示されています。バイオリアクターのダクロンの袖口が青縫合の結び目を持つガラスの腕に固定されている内側。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。チューブとバイオリアクターに接続されているフローシステムは、上記の通りです。L/S18チューブがMasterflexポンプで汲み上げ、したがって流れを駆動されます。圧力トランスデューサは、上流でのバイオリアクターに入る前に圧力を測定します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。収穫された人工血管の画像。エンジニア船舶が不透明であることが表示され、拍動性の条件下で8週間の培養後、約250μmの壁の厚さを実現します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。人工血管のヘマトキシリンおよびエオシン染色したクロスセクションでは、。とBはそれぞれ、容器の8週間の非パルスとパルスです。CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 Lは、血管の内腔側を示している。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="図7"/> 図7。人工血管の断面のためのコラーゲン（青）のためのマッソントリクローム染色。AとBはそれぞれ、8週間の非パルスとパルスの船舶です。 CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 4週間のパルス船舶がその非パルスのものよりコラーゲンを示していることに注意してください。白い矢印は血管内の残りのPGAのフラグメントを指す。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="図8"/> 図8。ウシ人工動脈におけるSMCのマーカーの免疫染色。平滑筋α-アクチン、カルポニン- 1、および平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）はそれぞれ、、初期の中間、そして後半SMC収縮マーカーです。 12週間の文化の終わりまでに、容器内の細胞壁に発現するSMα-アクチンとカルポニン- 1とSMMHCの適量。スケールバーは20μmのです。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 量は </td></tr><tr><td> DMEM（DME /低に変更） </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活性化</td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> HEPES、1.0 M </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ビタミンC（PBSまたはDMEMに溶解） </td><td> 25mgの</td></tr><tr><td>プロリン/グリシン/アラニン25 mg/25 mg/10ミリグラム（PBS 5mlの溶解） </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>のCuSO 4は1.5μg（PBSのIN1 mlを溶解） </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン10,000台で、G / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 10ng/mlでのPDGF - BB（血小板由来成長因子- BB） </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10ng/mlでのbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子） </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> 表1。 &quot;40〜10&quot;培地の成分は、上記の表に示します。PDGF - BBとbFGFの例外を除き、他のすべてのコンポーネントは使用前に0.2μmのフィルターでろ過することです。

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	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々はマイコプラズマで汚染された細胞はバイオリアクターの培養中の細胞増殖およびコラーゲンマトリックスの沈着を大幅に減少につながることを観察した。 40万人以上の冠動脈グラフトは小径（&lt;6mm）の人工血管12の需要が高い、その結果、毎年のバイパス操作のために必要です。究極の目標は、ネイティブ組織の生理的機能を模倣する機能小径血管を設計することです。私たちの拍動性のバイオリアクターシステムは、病気の動脈を復元し、置き換えることができる機能的な動脈グラフトを構成するための有望な平均値です。化学的および機械的に制御された環境では、バイオリアクターは、私たちは強力な縫合糸の保持と優れた機械的性質を示す埋め込み型細径船を設計することができます。拍動性のバイオリアクターシステムは、このように、このシステムの一般化と汎用性を作り、様々なサイズと寸法にウシ3、ブタ6,7、およびヒト細胞9から動脈を再構築するために使用することができます。さらに、我々は非侵襲的に血管の細胞外マトリックス、8のリアルタイム撮像を可能にするために私たちのバイオリアクターを変更しました。私たちのバイオリアクター、非侵襲的な顕微鏡イメージング技術、および高度な生体力学的評価の組み合わせアプローチは、私たちは時間をかけてECMの沈着と血管の機械的特性の変化を理解し、評価するのに役立ちます。 したがって、このバイオリアクターシステムは、将来の臨床応用10,11で自家血管移植片の再生に重要な役割を果たしている可能性生物学ベースの人工血管を設計するためにユニークなアプローチを提供しています。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/材料の名称</th><th>サプライヤー</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活化</td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF -基本</td><td> R＆B </td><td> 234 - FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF - BB </td><td> R＆B </td><td> 520 - BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td>シグマ</td><td>ペンナ</td></tr><tr><td>硫酸銅（II） </td><td>シグマ</td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td>シグマ</td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L -アラニン</td><td>シグマ</td><td> A7469 - 25G </td></tr><tr><td> L -プロリン</td><td>シグマ</td><td> P5607 - 25G </td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4544 - 25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 - 100G </td></tr><tr><td>シリコンストッパー</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06298〜24 </td></tr><tr><td> MasterflexチューブL / S </td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06508〜16、06508〜18 </td></tr><tr><td> Masterflexポンプ</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 7553〜80 </td></tr><tr><td>ダクロンのカフ</td><td> MAQUET </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGAフェルト</td><td>コンコルディア</td><td> MO000877 - 01 </td></tr><tr><td> 4から0まで1.5メートルSurgipro II縫合</td><td> Syneture </td><td> VP - 557 - X </td></tr><tr><td> 6から0 0.7メトリックDexonの縫合</td><td> Syneture </td><td> 7538〜11 </td></tr><tr><td> 0.22μmのPTFEフィルター</td><td>ワットマン紙</td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td>スリーウェイストップコック</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> 593WSC </td></tr><tr><td>圧力トランスデューサー</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IVバッグ</td><td>バクスター</td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td>生理食塩水希釈セット</td><td>矢印</td><td> W20030 </td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>サンゴバン</td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。 私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と3,4 -再現性の高いです。平滑筋細胞（平滑筋細胞）に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸（PGA）のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1）唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2）複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3）バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層（EC）が可能になります。 4）私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。 私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管5の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈6と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡（NLOM）8を使用して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.0K ビュー.  Yale University. 当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

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Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

動脈組織工学におけるエラストマーのPGSの足場

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

生物工学

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

工学

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

灌流中の血管のex vivo培養のための新しい3Dプリントバイオリアクター

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

著者スポットライト:EasyFlow - 大血管培養のための経済的で適応性の高い灌流バイオリアクター 

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

要約

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