著者はのEyalレインゴールド、吉野シェン、ニールJ.コーエン、ロバートR. Althoff、デボラHannula、とデイブウォーレンに特定のおかげで、メモリの眼球運動の監視を採用する研究に協力者の認知を行う予定。この作品は、カナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）、カナダ衛生研究所（CIHR）、カナダ研究チェアプログラムとイノベーション（CFI）のためのカナダの財団によってサポートされています。

データ収集中に使用される機器アイトラッカー現在のプロトコルで使用されているアイトラッカーは、EyeLink IIシステム（;ミシサガ、オンタリオ州、カナダSRリサーチ株式会社）です。このヘッドマウントX、&lt;0.1 ​​°の空間分解能は500または250 Hzのどちらかのサンプリングレート、のY座標のフレームで、ビデオベースの目の追跡レコードを目の位置。 1台のカメラを参加者が表示されているディスプレイモニターの四隅に配置されたセンサーに赤外線マーカーを送信することにより、ヘッドの位置を監視するために使用されます。二つの追加のカメラは、眼の下にそれぞれ位置するヘッドバンドに取り付けられている、と赤外線照明は瞳孔と角膜反射を注意するために使用されます。目の位置は、瞳孔と角膜反射に基づいて、または唯一の瞳孔に基づくこ​​とができる。アイトラッカーのパッド入りのヘッドバンドが快適に成人の参加者の頭のサイズに合わせて二つの平面で調整することができます。ほとんどの眼鏡とコンタクトレンズはアイトラッカーによって対応することができます。 コンピュータ二つのPCは、眼球運動の記録をサポートするために使用されます。一つのコンピュータが参加する、キャリブレーション画面、必要なタスクの手順と実験パラダイムで使用する画像を提示するディスプレイコンピュータ、として機能します。次に2番目、ホストコンピューターによって管理されているディスプレイコンピュータの詳細データの収集パラメータ。ホストコンピュータは、リアルタイムの凝視位置を計算し、後で分析するために眼球運動データを記録するだけでなく、任意のボタンを押したり、キーボードの応答が参加しました。アイトラッカーの参加者の設定と操作は、ホストPCを介して実行されます。 ソフトウェアこのプロトコルでは、実験的な刺激があるどのタイミングと順序は、参加者に提示するために、そして目の位置は、ホストPCによって収集されることになっている方法を、実験ビルダー、特にSRリサーチ株式会社が開発したソフトウェアプログラムを介してプログラムされているアイトラッカーをホストコンピュータとのインタフェースへ。しかし、刺激提示は、他のソフトウェアプログラム（;バニー、CAなど、プレゼンテーション、神経行動学的システム）を通して行うことができる。 （または他の外部イベント）刺激提示する時にロックされている固定とサッケード一連のイベントへの眼球運動データの変換は、ホストコンピュータによって実現され、データビューワー、SRリサーチ株式会社が開発したソフトウェアプログラムによって調べることができます。ただし、再び、他のプログラムが必要な眼球運動の対策を導出するために使用することができます。ここでは、凝視とサッカードの検出には、意味のある状態（サッカード、点滅し、注視）に生の眼球運動のサンプルを分離するオンラインパーサに依存しています。二つの連続眼球運動の試料の速度は0.1 °の距離で毎秒22度を超えている場合、サンプルはサッカードとしてラベル付けされます。瞳孔が3以上のサンプルのために欠落している場合は、目の活動は、データストリーム内の点滅としてマークされます。非サッカーと非点滅の活動注視とみなされます。 アイトラッキング手順。 以下、我々は細部各参加者の眼球運動の記録を取得するための手順を。 <ol><li>同意。参加者のセットアップに先立ち、参加者は、アイトラッカーのヘッドバンドを示しています。実験者は、頭と目の位置がヘッ​​ドバンドに含ま​​れているカメラを通して監視されていることを参加者に説明しています。 </li><li>与えられた実験的なパラダイムのために、参加者は参加者間で同じ視覚的な角度を維持するために、モニターから一定の距離を装着している。 </li><li>アイトラッカーカメラのセットアップ。アイトラッカーのヘルメットは、ヘルメットがぴったりと移動するそうですが、ヘッド周りの不快でないように調整されます。ヘルメットは、さらにヘッドカメラはディスプレイモニターに外部マーカに赤外照明を送信できるように調整されます。アイカメラの各々はすべての軸で調整できるヘルメットから伸びる個々の棒に位置しています。アイカメラは、ディスプレイモニターの参加者のビュー（図1参照）を妨げることなく少し離れてそれぞれの目からわずかの下に配置しています。カメラは瞳孔と角膜反射のクリアで安定した画像を得るために重点を置いています。ホストコンピュータ上のステータスパネルには、瞳孔と角膜反射を取得されているかどうかを示します。照明のしきい値は瞳孔と角膜反射の最も安定した記録を得るために調整することができます。実験者は、適切な実験パラダイムを選択し、その後の眼球運動の記録のためのファイル名を指定します。 <img src="/files/ftp_upload/2108/2108fig1.jpg" alt="図1" /> 図1ヘッドマウントビデオベースの目の追跡（左）とディスプレイとホストPCの（右）の例。なお、一部の前のディスプレイモニタicipantは、瞳孔の位置（十字線付ブルードット）およびカメラのセットアップを支援するために角膜反射（クロスヘアと黄色のドット）を示しています。 </li><li>キャリブレーション。ディスプレイモニタ上に目の位置の正確な記録を取得するには、キャリブレーションの手順は、次のカメラのセットアップを開始されます。キャリブレーション手順の間に、参加者はディスプレイ上のさまざまな場所に現れるターゲットのシリーズを見るように指示されます。通常は、9つのターゲットの場所が使用されますが、キャリブレーションは、3つのターゲットの場所のように数回押すだけで実行できます。これらの9つの記録された場所から、画面上の任意の点で目の位置を補間することができます。 </li><li>検証。キャリブレーションに続いて、検証の手順は、眼球運動の記録の正確さを確認するために使用されます。同じ9ターゲットの場所が凝視して参加者に提供され、その差は現在の固定位置と、以前に記録された固定位置との間で計算されます。いずれか（または両方）、目の位置の記録の平均精度が許容レベルを（平均誤差&lt;0.5 °および任意の点&lt;1.0 °の最大誤差）を超える場合、キャリブレーションと検証手順が繰り返されます。眼球運動の記録は、単眼または両眼であるかどうかを精度レベルの受け入れに続いて、実験者が決定することができます。単眼録音の場合には、実験者は目のデータが記録されるから判別でき、またホストPCは自動的に低い平均誤差と低い最大誤差と目を選択することができます。キャリブレーションと検証がわずかな頭の動きで発生することができますが、それは参加者がとしても、可能な限り座っていることが有利である。参加者は、ターゲットは、それらが表示され、それが消えるまでターゲットに執着滞在するときにのみ、また、目標の今後の位置を予測しないように指示されて、むしろに移動する、との意図的に固執する。 </li><li>実験パラダイム。特定のパラダイムへの特定の命令は（例えば、&quot;以下の画像のそれぞれを表示する自由にしてください。&quot;）参加者に提示され、そしてデータ記録は、セッションが開始されます。 </li><li>ドリフト補正。各実験刺激の開始に先立ち、ドリフトの補正は、固定の位置を受け入れるようにジョイパッドやキーボードのボタンを押しながら、参加者が中央の固視標を見ることによって行うことができます。参加者が正常に中央のターゲットの2.0℃以内に中央の固定領域にfixatesまでドリフト補正が採用されている場合、裁判は開始されません。参加者が一貫して2.0 °よりも大きいfixates場合、参加者は再度キャリブレーションと検証の手続きを経る必要があります。記録された眼球位置と校正/検証の記録の間に得られた初期固定の位置間の差より小さい2.0 °は、エラーとして留意し​​、データに計上されています。 </li><li>刺激提示。固定し、眼球運動イベントを含む目の位置は、各刺激提示のためのドリフト補正の手順に従って記録されます。実験者は、ホストコンピュータの検査を介してオンラインでの録音の精度を監視することができます。 </li><li>眼球運動のレコーディングセッションに続いて、画像の種類によって（小説、繰り返し）のパターンを走査眼球運動を特徴づけるの措置は、SRリサーチ社のデータビューアなどのソフトウェアパッケージ、様々な派生させることができます。さらに、刺激の特定の領域（例えば変更されていない、操作）に表示しては、パラダイムプログラミングの段階で、またはデータ収集後のいずれかに各イメージ用に作成されている興味のある実験者 - 描画領域に対してで目の動きを分析することによって特徴づけられる。 </li><li>参加者はセッションの終了時に実験の目的についてdebriefedされています。 </li></ol>代表的な結果複数の対策は、眼球運動の全体的なイメージ（それぞれ固定/サッカードの特性を含む）に表示して記述する措置を含む録音、、そしての中で関心の特定の領域に指示された視野のパターンを説明対策から導出することができます画像3。画像の全体的な視聴の対策は、（これらに限定されない）を含むことができる：注視の数と画像に加えられたサッカードの数、各固定の平均持続期間、およびに遠ざけ費やされた視聴時間の総量をイメージ。関心の特定の領域に表示のパターンを記述する施策は、（これに限定されない）を含むことができる。関心のある領域に対して行われた注視の数、関心領域内で費やす時間の量、およびトランジションの数関心領域の/アウトになる。さらに、対策が特に眼球運動のイベントが発生した（すなわち、どのように初期の）で、タイミング、などの輪郭を眼球運動の記録に由来することができるとして刺激の発症後、目が最初のサッカードが画像上で行われている関心の特定の地域、および眼球運動のパターンのシーケンスに固有のエントロピー（制約/ランダム性）にこだわるとき、。 任意の画像を表示するには、眼球運動の措置は、目が固執されたディテール、いつ、どのくらいの期間することができます。メモリのインデックスを取得するには、我々は、画像の異なるセットに視聴者に露出の異なる種類や量を与えるし、それらのセット間で、参加者全体での表示パターンを比較することができます。例えば、画像の繰り返しのためのメモリを調べるために、スキャンパターンは、テストセッション全体を通じて複数回表示されている小説の画像と画像の間で対比することができます。画像2、4-5、8の全体的な視野の減少のテストセッションの結果全体に繰り返し画像を表示。これは、図2で見ることができます。この代表的な結果でリッグスらから11、参加者は5つのテストブロックの各々に一度の顔の斬新な写真を見て、。増加の暴露に、視聴者は顔にできるよう注視量の減少があった。画像の特定の詳細については、メモリを調べるために、スキャンパターンを繰り返し、元の、未変化体（繰り返し画像）と同様に、テストセッション全体を通じて繰り返して表示されている画像で表示されている画像との間で対比することができますが、変更がされている最終的な曝露（操作画像）中にシーンの中でいくつかの要素を導入。このようなケースでは、スキャンパターンが繰り返さ画像2-3、7-8と同じ、不変の地域に比べて操作された画像内で変更されている地域に差魅了されています。しかし、メモリのような眼球運動の指標がこのような健康な高齢者と内側側頭葉損傷による健忘症の患者が、シーン内のオブジェクト間の空間関係の彼らの記憶のために評価される場合など一定の集団で存在していない、図3で概説2、8。そのため、眼球運動の監視からの知見は、神経心理学的状況2-3、8-10異なると、参加者のグループ間のコントラストのメモリに使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2108/2108fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。目の動きは、繰り返しのためのメモリを明らかにするこの代表的な結果では我々の研究室から[11]、参加者5の研究ブロック全体で見て顔;（1-5から）増加の視聴数で、顔への注視の数が減少した。 <img src="/files/ftp_upload/2108/2108fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。目の動きは、変更の詳細についてはメモリを明らかにする。若年成人[2（実験1、2）、8（無料の表示の条件は）]から変化している操作された画像のクリティカル領域への合計の目の注視の大部分を監督地域は、小説と繰り返し画像のように、変化を経ていないときに前と比較して表示。メモリのような効果は、健康な高齢者では、と健忘の患者[2] [8（無料の表示条件]欠席した。

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利害の衝突は宣言されません。

眼球運動の監視には、集団の様々なメモリ機能を評価すると効率的な、便利なツールです。このプロトコルは、ヘッドマウントビデオベースの目の追跡の使用について説明しますが、リモートアイトラッカーは、ヘルメットの調整の必要性を削除し、カメラの調整を簡素化するようにプロトコルが簡単に、リモートアイトラッキングデバイスの使用に適応させることができる。しかし、リモートアイトラッカーで、ヘッドの移動は、目の録音の精度を維持するために制限される必要があります。眼球運動の正確なキャリブレーションは、有用な、と解釈データを取得するための最優先事項です。 眼球運動のモニタリングを通じて得られたメモリのインデックスは、標的のコミュニケーション能力を持つ集団におけるメモリの急速な調査のために有利であるかもしれないメモリの明示的な（すなわち、口頭）報告書を、取得するための必要性をなくす。アイトラッキングは、メモリ内に保持が意識イントロスペクションのために利用可能ではない情報があるかどうかを判断するための明示的なレポートと連携して使用することもできます。さらに、眼球運動のパターンは、メモリの影響がこれらのパターンの変化を誘導する時期を決定するためにプローブすることができます。すべては一緒に、明示的なレポートと比較した場合、眼球の動きの監視から派生した対策は、メモリ内に保持されているものについて、より包括的な詳細を提供する、としたとき、それが2-3をアクセスされる。 人口グループ間で眼球運動のパターンを比較すると、メモリー機能の完全性、年齢、および/または変更された神経心理学的状態に変化する可能性についての洞察を提供します。脳の特定の領域に病変を有する個体においてメモリの眼球運動の指標を尋問すると、情報2-3、9-10特定の種類を形成し、維持するために不可欠なもの神経領域を明らかにすることができます。ラボ環境外で最小の試験で、個々の参加者のためにメモリのインデックスを取得するの信頼性を検証し今後の研究で、アイトラッキングは、このような研修環境、医療現場および/または法の執行の状況でメモリを監視および検証するために有用な方法論になることがあります12目撃者の識別手順のように。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eye Tracker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SR Research Ltd.</td>
<td>Eyelink II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experimental Control Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SR Research Ltd.</td>
<td>Experiment Builder</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye Movement Analysis Program</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SR Research Ltd.</td>
<td>Data Viewer</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

eye movement monitoring of memory

明示的な（多くの場合、口頭で）レポートは一般的にメモリを（&quot;あなたは昨日銀行で見た。人物について覚えて何教えてください&quot;など）を調査するために使用される、そのようなレポートしかしながら、しばしば信頼できないまたは応答のバイアスに敏感であることができる<sup&gt; 1</sup&gt;、およびいくつかの参加者の集団で得られない場合があります。また、明示的なレポートは、関係なく情報がその後意識的にアクセスされているかどうかの、情報が意識に到達したときに明らかにすると記憶が処理中にアクセスされたときにコメントすることはできません。眼球運動の監視（アイトラッキング）は、それらのメモリの内容にコメントを参加者に要求することなくプローブすることができるメモリでツールを提供し、そのようなメモリのアクセスは、オンラインで明らかにすることができる<sup&gt; 2,3</sup&gt;。ビデオベースの目のトラッカーは、（どちらかのヘッドマウントまたはリモート）の参加者は、ディスプレイモニターを表示するように各眼の瞳孔と角膜反射を検査するカメラや赤外線マーカーのシステムを使用してください。ヘッドマウントアイトラッカーの場合は、赤外線マーカーはまた頭部運動と眼球の位置をより正確にローカライズできるようにヘッドの位置を決定するために使用されています。ここで、我々は、神経学的、無傷および神経学的障害を持つ成人のメモリの性能を調査するために頭部装着型眼球追跡システムの使用方法を示しています。眼球運動の監視の手順は、参加者の目のトラッカーの配置、および頭部と目のカメラの設定で始まります。キャリブレーションと検証の手順は、目の位置の記録の正確性を確保するために実施されています。ディスプレイモニタ上のX、Y座標位置のリアルタイムの音声ファイルはその後、変換され、眼が（すなわち注視）静的である対モーションで（すなわち、サッカード）その時間帯を記述するために使用されます。停留とサッケードは、視覚的な表示または他の外部イベント（例えばボタンを押す）の発症/オフセットを基準にして、時間ロックされます。実験操作は、いつ、どのように注視とサッカードのパターンが変更される前に経験の異なるタイプを介して調べるように構築されています。メモリの影響は、新しい画像にパターンをスキャンする以前に検討されている画像にパターンをスキャンから乖離する程度で明らかにされる<sup&gt; 2、4-5</sup&gt;。メモリはまた、その特異性のために調べることができます。例えば、同一の、以前に学んだ画像の改変されたバージョン間で異なる眼球運動パターンは、メモリ内の変更された詳細の記憶を明らかに<sup&gt; 2-3、6月8日</sup&gt;。メモリのこれらの指標は、参加者のそれによって健常人でのメモリの構成を検討するために使用される、強力なツールを提供する集団、および神経傷害または減少してメモリに発生する特定の変更を越えて比較することができます。<sup&gt; 2-3、80から10</sup&gt;。

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Eye Movement Monitoring of Memory

眼球運動の監視（またはアイトラッキングは）空間に目がいつ、どのくらいの期間、残るかがわかります。ここで、我々は、アイトラッキングは、口頭、またはその他の明示的なレポートを必要とせずに、複数の参加者の集団でのメモリの整合性を調査するために使用することができる方法を示します。

メモリの眼球運動のモニタリング

Explicit (often verbal) reports are typically used to investigate memory (e.g. "Tell me what you remember about the person you saw at the bank ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K ビュー.  Rotman Research Institute. 眼球運動の監視（またはアイトラッキングは）空間に目がいつ、どのくらいの期間、残るかがわかります。ここで、我々は、アイトラッキングは、口頭、またはその他の明示的なレポートを必要とせずに、複数の参加者の集団でのメモリの整合性を調査するために使用することができる方法を示します。

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

神経科学

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and focused on psychological aspects. Until now, objective observation of neurophysiological parameters has not been carried out - undoubtedly because the technical and methodological means have not been available -, investigations into the neurophysiological effects of weightlessness are in their infancy (Schneider et al. 2008).
While imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) would be hardly applicable in space, the non-invasive near-infrared spectroscopy (NIRS) technique represents a method of mapping hemodynamic processes in the brain in real time that is both relatively inexpensive and that can be employed even under extreme conditions. The combination with electroencephalography (EEG) opens up the possibility of following the electrocortical processes under changing gravity conditions with a finer temporal resolution as well as with deeper localization, for instance with electrotomography (LORETA).
Previous studies showed an increase of beta frequency activity under normal gravity conditions and a decrease under weightlessness conditions during a parabolic flight (Schneider et al. 2008a+b). Tilt studies revealed different changes in brain function, which let suggest, that changes in parabolic flight might reflect emotional processes rather than hemodynamic changes. However, it is still unclear whether these are effects of changed gravity or hemodynamic changes within the brain. Combining EEG/LORETA and NIRS should for the first time make it possible to map the effect of weightlessness and reduced gravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain. Initially, this is to be done as part of a feasibility study during a parabolic flight. Afterwards, it is also planned to use both techniques during medium- and long-term space flight.
It can be assumed that the long-term redistribution of the blood volume and the associated increase in the supply of oxygen to the brain will lead to changes in the central nervous system that are also responsible for anaemic processes, and which can in turn reduce performance (De Santo et al. 2005), which means that they could be crucial for the success and safety of a mission (Genik et al. 2005, Ellis 2000).
Depending on these results, it will be necessary to develop and employ extensive countermeasures. Initial results for the MARS500 study suggest that, in addition to their significance in the context of the cardiovascular and locomotor systems, sport and physical activity can play a part in improving neurocognitive parameters. Before this can be fully established, however, it seems necessary to learn more about the influence of changing gravity conditions on neurophysiological processes and associated neurocognitive impairment.

The effect of weightlessness and hypergravity on both hemodynamic and electrophysiological processes in the brain is going to be followed during parabolic flight by EEG and NIRS techniques. 
A feasibility study of a more complex experiment, which is planned to carry out during medium- and long-term space flight.

脳皮質機能および変更された重力状態の間、神経認知パフォーマンスとの間のコヒーレンス

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

蛍光イメージングのための生活絶縁脊椎動物視細胞の調製

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

ニューロンの光刺激のために手ごろな価格のLEDアレイを使用する

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

糖尿病ラットの熱侵害受容閾値の迅速定量

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

蜂蜜の蜂で触角サンプリング戦略の触覚エアコンと運動解析（<em&gt;ミツバチ</em&gt; L.）

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測<em&gt;エクスビボ</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...