パート1：TRIzol試薬を用いてトータルRNAの抽出 RNAを扱うときには、RNaseのない環境で動作するように非常に重要です。このようなRNAの手順でのみ使用するために予約されたピペットを持つと手順を開始する前に除染装置試薬（例えば、RNアーゼアウェイ）で作業領域をスプレーのような単純な予防策は非常に有用です。 <ol><li> 1.5mlマイクロチューブにRNAプール50ゼブラフィッシュの胚の十分な量を達成し、ピペットでできるだけ多くの水として削除する。 </li><li>すぐに胚を含んだマイクロ遠心チューブにTRIzol試薬1の250μlを加える。 TRIzol試薬はフェノールが含まれており、唯一のヒュームフードの下で使用する必要があります。 </li><li>組織が十分に中断されるまで、ペレット乳棒（約20ストローク）で胚を溶解し、ホモジナイズする。 </li><li>細胞が十分に均質化されている場合、1mlの総体積と等しくなるように750μlのTRIzol試薬を加える。 </li><li>核タンパク質複合体の完全な解離を許可するには、室温で5分間均質化した試料をインキュベートする。この段階では、サンプルはフラッシュが液体窒素で凍結し、-80℃またはプロトコルを継続することができます保存することもできます。 </li><li>クロロホルム0.2 mlを追加し続けると混合するために15秒間チューブをロックする。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで遠心分離後、室温で2分間サンプルをインキュベートし、℃の</li><li>混合物は、下の赤色のフェノールクロロホルム相、中間相、そして無色の上部の水相に分離します。上部の水相は、RNAが含まれています。最上層は、TRIZOLの初期体積の約60％（約0.6 ml）を含むべきである。相間の層のいずれかを転送しないように注意しながら1 mlのピ​​ペットを使用して新しい微量遠心管に上部の水層を移す。 </li><li> RNAは0.5 mlのイソプロパノールを加える沈殿する。 </li><li>サンプルは室温で10分間座って、その後4℃で10分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離することができます℃をRNAは、チューブの底にゲル状のペレットを形成します。 </li><li>ペレットが剥がれないように、ピペットで上清を除去し、1mlの75％エタノールでペレットを洗浄する。 4℃で5分間7,500 × gで穏やかに転倒し、遠心して、サンプルを混ぜる℃に</li><li>遠心分離後、ピペットでエタノールを除去し、10分間反転しながら、サンプルが乾燥することができます。 </li><li> RNaseフリー水100μlを添加してペレットを再懸濁し、10分間55℃でサンプルをインキュベートする。それは、RNAの水分補給を支援するためにインキュベーション中に頻繁に渦を指することをお勧めします。必要に応じて、ナノドロップND - 1000分光光度計を使用して、サンプルの質と量を確認することができますか、直接次の手順に進みます。 </li></ol>パート2：キアゲンRNeasyミニキットを使用してRNAクリーンアップキアゲン社RNeasyミニキット2は、他のメソッドから単離したRNAサンプルから汚染物質や不純物を除去するのに便利です。この手順では、β-メルカプトエタノール、エタノール、およびヌクレアーゼフリー水はキットに含まれるコンポーネントに加えて必要とされる。オプションのDNase処理は、この手順の実行中に推奨されます。 <ol><li>キットの初回使用時に、バッファのRPEは、Buffer RPEの1ボリュームに100％エタノールの4倍量を加えて調製する必要があります。 </li><li>手続きの日に、のBuffer RLTは新鮮に準備する必要があります。必要とされるのBuffer RLTの合計金額を計算する。 350μlの量は、サンプルごとに必要とされる。のBuffer RLTを準備するには、バッファの各1 mlのβ-メルカプトエタノール10μlを加える。これは、ヒュームフードの下で行われる必要があります。 </li><li>各サンプルにのBuffer RLTおよび100％エタノール250μlの350μlを加える。数回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li>室温で1分間、8,000 xgで2 mlのコレクションチューブと遠心分離機内に配置されRNeasyカラムに、約700μlのあるべきサンプルを、転送する。 </li><li>遠心分離した後、フロースルーを捨てて、RNeasyスピンカラムにBuffer RW1 700μlを加える。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>キアゲンのRNaseフリーDNaseキットによるDNase処理：DNase処理はオプションですが強く、最高品質のサンプルをお勧めします。 <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li>最初にDNase処理のキットを受け取るときには、DNアーゼは550μlヌクレアーゼフリー水を添加してのDNase Iストック溶液を準備しておく必要があります。反転によって静かに混和し、ボルテックスしないでください。ストック溶液の10μlを含む単回使用のバイアルに分注し。は、最大9ヶ月まで-20℃でストック溶液を保存することができます。融解したアリコートを必要に応じて6週間に4℃で保存することができますが、解凍後にアリコートを再凍結しないでください。 </li><li>のDNase Iインキュベーションミックスを準備するには10μlのDNase IをsにRDD 70μlのBufferを加えるサンプルあたりトクソリューション。静かに転倒し、遠心簡単にチューブ残液の形態チューブの側面を収集することによりミックス。直接RNeasyスピンカラムに80μlののDNase Iインキュベーションミックスを追加。室温で30分間DNase処理をインキュベートする。 </li></ol></li><li> DNase処理後に室温で1分間8000 × gでスピンカラムや遠心に350μlのBuffer RW1を追加します。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、スピンカラムに500μlのBuffer RPEを追加。室温で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>室温で1分間、8,000 × gでサンプルを遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムに500μlの75％エタノールを加える。 </li><li> 8000 × gで遠心操作を繰り返しますが、室温で2分間。 </li><li>遠心分離後にフロースルーを捨てて、列が5分間乾燥させます。 </li><li>すぐにエタノールの痕跡を介して任意の左を削除するには、室温で5分間8000 × gで遠心。 </li><li>遠心分離が完了したら新しい1.5 mlのコレクションチューブにスピンカラムを移し、10μlのヌクレアーゼフリー水を加える。 1分間インキュベートし、次いで室温で1分間10,000 × gで遠心。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>スピンカラムにヌクレアーゼフリー水のさらに10μlを加え、室温で1分間インキュベートする。室温で1分間、10,000 × gでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にスピンカラムを削除し、破棄する。 RNAはフロースルーになります。 </li><li>製造元の指示に従って光度計ND - 1000分光光度計を用いてRNAの質と量を確認してください。 </li><li>さらに、変性ゲルを実行するか、RNAの完全性をチェックするためにAgilent 2100バイオアナライザを使用してください。 </li><li> cDNA合成を行うことができるようになるまでサンプルを-80℃で保存してください。 </li></ol>パート3：インビトロジェンのSuperScriptファーストストランドシステムを使用してcDNAを合成 RNAが分解につながるアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。その結果、多くの遺伝子発現のプロトコルは、直接RNAから合成され、より安定したcDNA産物を使用するために開発されている。ここでは詳細インビトロジェンのSuperScriptファーストストランド合成システム3を使用して第一鎖cDNAの合成を。それぞれのcDNA合成反応は、5μgのRNAを収容することができます。 <ol><li>手続きのミックスを開始する前に、手短に各コンポーネントを遠心してください。 </li><li>表1に示すように滅菌0.5 mlのマイクロ遠心チューブにRNA /プライマー混合物を準備します。 </li><li> ℃で5分間65℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li>直ちに10分間氷スラリーにサンプルを移す。 </li><li>サンプルは、表2に示す成分とマスターミックスを調製冷却されている間。ボリュームは、1反応あたりに表示されます。反応の合計数に応じてボリュームを調整します。 </li><li>冷却後、各RNA /プライマー混合物に、手順5で調製したマスターミックスの9μlを加える。穏やかに混合し、短時間の遠心分離によって収集。各サンプルの合計量は19μLにする必要があります。 </li><li>サーマルサイクラーで2分間42℃でサンプルをインキュベートする。 </li><li> 、各チューブにのSuperScript II RTを1μl（50ユニット）を追加ミックス、および42℃でインキュベートサーマルサイクラーで60分間。 </li><li> 70で反応を終了して℃で15分間、4℃の寒さのサンプルクラーは、手順8および9のためにプログラムすることができます。 </li><li>サンプルは4 ° Cに達した後、氷浴に反応を転送する。 </li><li>氷の上で各試験管にRNase Hを1μlを追加し、37℃で20分間インキュベート℃に総量は、現在21μlです。あなたのサンプルにRNase Hの加算は、RNAテンプレートを低下させ、唯一の一本鎖cDNA産物を残す。 </li></ol>パート4：cDNAの単離と降水量<ol><li> 1.5 mlの位相ロックゲルチューブは、cDNA産物の単離に使用されます。 2分間、12,000 xgで遠心分離によって1.5 mlの位相ロックゲルチューブを準備します。ゲルは、すべてのチューブの底になっているはず。 </li><li> 、（トリス飽和、pHを8.0にバッファリング）81.5μlのフェノール24:1クロロホルムイソアミルアルコールの81.5μL、および位相ロックゲルチューブにサンプル（21μl）を追加します。穏やかに転倒を数回混ぜる。 </li><li>室温で5分間、12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li> cDNAは、上部の水相にする必要があります。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上層を移す。総量は20μlの前後となるはずです。 </li><li> 3 M NaOAc、pHが5.2の1X量を加え、穏やかに混ぜる。上部の水相の体積は20μlに等しいだった場合例えば、、あなたは3 M NaOAc、pHが5.2の2μlを追加する必要があります。 </li><li> 5 mg / mlのグリコーゲンの7μlを加え、穏やかに混合する。 </li><li>イソプロパノールの1X量を加え、穏やかに混ぜる。一般的にこれは、イソプロパノールの約30μlです。 </li><li>サンプルは、部屋のtemperaturでインキュベートすることができますその後10分間eとは、室温で20分間12,000 xgで遠心。 </li><li>小さなcDNAのペレットは、チューブの底に形成すべきである。注意深くピペットで上清を取り除く。 </li><li> 70％エタノールと反転して混合液500μlを追加。 </li><li> 5分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を除去し、70％エタノールで洗浄し、遠心分離を（ステップ10と11）を繰り返します。 </li><li>遠心分離後にピペットで上清を取り除く。管の両側に残っている液体がある場合、それは簡単にチューブを回転させて収集することができます。余剰な溶液を取り除き、ペレットを室温で5分間乾燥させます。 </li><li>ペレットを溶解するヌクレアーゼフリー水20μlを添加する。ペレットの水分補給のための5分間55℃でサンプルを置きます。 </li><li> cDNA産物の量と質は、製造元の指示に従って、光度計ND - 1000分光光度計を用いてチェックされます。 cDNAは-20℃で保存することができます</li></ol>代表的な結果 RNAのクリーンアップの後、高品質のトータルRNAの約15μgのは50ゼブラフィッシュの胚から期待できる。トータルRNAの品質、分光光度計、ゲル電気泳動、およびAgilent 2100バイオアナライザを評価するために使用することができます。光度計ND - 1000分光光度計は280nm（図1）の吸光度と比較して260nmの吸光度を評価するために使用することができます。 280分の260の比率は、汚染物質の存在を明らかにし、可能な限り劣化の証拠を与えることができます。 260 / 1.9から2.0までの280比率は許容範囲とみなされます。さらに、それは非常にRNAの変性ゲルはRNAの完全性を評価するために実行することをお勧めします。 RNA鎖は小さい鎖はゲルさらに下に移行して、そのサイズに基づいて分離します。非分解サンプルでは、​​2つの強力なバンドとの塗抹標本として表示されます。塗抹標本は、サイズの異なるmRNAの鎖と​​28Sと18SのrRNAのに対応するバンドの人口の結果である。 28Sのバンドは、18Sのバンド（図2）などの約二倍強にする必要があります。また、トータルRNAの完全性は、Agilent 2100バイオアナライザを用いて評価することができる。 28Sと18SのrRNAを表す2つの明確なピークは（図3）期待されています。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。二つの異なるピークが低下した試料では観察されません。劣化を示すRNAサンプルは、その後の実験的な手続きを経て実施されるべきではない。 分光光度分析は、cDNA産物の品質（図4）を評価するために使用することができます。 280分の260は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5μgの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室ではcDNA産物の1〜2μgのをもたらす。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 RNAサンプルの光度計のスペクトル。RNAのクリーンアップの後、RNAの量と質は、光度計ND - 1000分光光度計を用いて評価することができる。高品質のトータルRNAの約15μgのは、日常的に1.9から2.0前後280分の260比で50ゼブラフィッシュ胚から得られたれる。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 RNAの変性ゲル。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、RNAの変性ゲルを実行することができます。 28Sと18SのrRNAに対応する2つの明るいバンドとスミアが期待されている。 28Sのバンドは、18Sのバンドの約2倍強にする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。バイオアナライザによるRNAサンプルのトレース。トータルRNAの分離の整合性を評価するために、サンプルも、Agilent 2100バイオアナライザで分析することができる。 28Sと18SのrRNAのに対応する2つのシャープなピークが、、目に見えるはずです。 28Sのピークはそれぞれ、約2:1のピーク下の面積と18Sのピークよりも大きくする必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 cDNAサンプルの光度計のスペクトル。光度分析光度計ND - 1000とは、cDNA産物の量と質を評価するために使用することができます。 280分の260の比は、1.8前後となるはずです。トータルRNAの5 UGの入力を有するcDNA反応が日常的に我々の研究室のcDNA 1-2 UGをもたらす。 表1は、。部品cDNA合成のステップ2でRNA /プライマー混合物について追加する。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>トータルRNA（最大5μgの） </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>の10mM dNTPミックス</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>オリゴ（dT）12-18（0.5μg/μLの） </td><td> 1μL </td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> μL のn </td></tr><tr><td>合計ボリューム</td><td> 10μlの</td></tr></tbody></table> cDNA合成のステップ5の表2。反応混合物。記載されているボリュームは、反応毎にあります。反応の総数については、各成分の量を増やします。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> 25 mMのMgCl2を</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 0.1 mMのDTT </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1μL </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RNA分子の脆弱性は、このプロトコルを通じて忘れてはならない最も重要な考慮事項です。 RNaseフリーである滅菌装置は、常に研究室のRNaseフリーゾーンで使用する必要があります。 RNAのみの手続きに使用する実験室の一部を確保しておくと便利です。この領域は頻繁にアウェイなどRNaseなどRNアーゼ除去製品、を散布してください。 RNAサンプルは常に手袋を使用して処理し、劣化を防ぐために、氷上で保存する。 このプロトコルは、市販の試薬やキットを利用しました。また、多数の追加の試薬およびトータルRNAアイソレーションのための市場で入手可能なRNA分離キットがあります。このプロトコルに含まれる試薬及びキットは、うまく機能し、日常的に我々の研究室で高品質のRNAが得られている。 別の方法として、二本鎖cDNA合成は、代わりに、このプロトコルで実証第一鎖合成の、実行することができます。それは安定性の向上を提供するので、二本鎖cDNAは、時々望まれて​​いる。さらに、一部のプロトコルは、入力として二本鎖cDNA産物を必要とする。しかし、サンプルはダウンストリームアプリケーションのために社内に保持しようとしている場合、第一鎖合成が十分であり、はるかに経済的です。

<table><tbody><tr><td>Glycogen (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, Tris-saturated</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

多くの重要かつ複雑な実験手順は、高品質でインタクトなRNAの入力が必要です。劣化したサンプルや不純物の存在は、下流の実験的なアプリケーションでは悲惨な結果につながることができます。それは、優れたサンプルを確保するために多数の保護及び品質管理チェックと固体のテクニックを使用するために最も重要なこと、それゆえです。ここで、我々詳細商用RNA単離キットを用いてDNAと不純物の痕跡を除去するために市販の化学変性剤とそれに続くクリーンアップを使用して全体のゼブラフィッシュの胚からトータルRNAを分離するためのプロトコル。としてRNAは、直接RNA鋳型から合成されたcDNA産物を使用するほとんどのプロトコルはアッセイの遺伝子の発現は比較的不安定で、RNアーゼによる切断を容易に発生しやすくなります。我々は、詳細手順を市販のキットを使用して、より安定したcDNA産物にRNAに変換する。これらの手順を通して、サンプルは劣化や汚染がないことを保証するために数多くの品質管理チェックがあります。これらのプロトコルの最終製品は、マイクロアレイ解析、RT - PCRまたは長期保存に適しているcDNAである。

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

37.9K ビュー.  Purdue University. 高品質の単離は、インタクトなRNAは、多くの実験室のプロトコルで必須の工程である。ここで、我々は全体のゼブラフィッシュの胚と遺伝子発現のマイクロアレイ解析を含む様々な実験手順で、後続のアプリケーションのためのcDNA合成からのRNA抽出を示しています。

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

発生生物学

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

遺伝学

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

神経科学

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...