我々は、ビデオに示されている自動、電動テトロードツイスター装置の彼の設計と建設じゅんfor山本に感謝します。さらに、我々はマイクロドライブやラボでのテトロードの技術開発への貢献のためにすべての過去および現在のウィルソンの研究室のメンバーに感謝します。

1。 tetrodesの作製<ol><li>長さ50センチメートルを取得して、1つ四極管の建設を開始、12.5ミクロンの直径のコアと絶縁、NI -クロム線をポリイミド。半分に線を折る。それらがくっつきようにペアに沿って指を実行します。ワイヤのペアがその全長にわたって良好な接触を持っていることを確認してください。 </li><li>一緒に両端を保持することによって再びペアを折る。一端に形成されるループがねじれていないことを確認してください。 4つのヒントが合うように非ループの端の4本の線をカット。 </li><li>次のステップでは、修正されたワニ口クリップ、電動回転装置、旋回装置上の水平バーが必要になります。ワニ口クリップを接着することにより、クリップのベースにプラスチック製のバーが変更されます。ワイヤの先端が露出している場合には、修正されたワニ口クリップと一緒に4本の線をクランプする。水平バーの上にワイヤーのループをハングアップする。電動ステージにワニ口クリップを置きます。 </li><li>約3分かけてワイヤの束〜40カウンタークロックワイズねじれが続く80クロック単位でひねりを適用します。これらのパラメータは、必要に応じて変化させることができる。 </li><li>テトロードのねじれが完了すると、中低フローを使用して、ヒートガン（420 ° Cまたは790 ° F）で3つの異なる形から加熱して一緒にワイヤーを融合する。それぞれの角度の場合、約5秒間の配線から2cmの距離で、電線束が分割下記1〜2センチメートルを始めるヒートガンを駆け降りるとまで。高温で完全に断熱材を溶融し、短絡につながるとして、十分に注意してください。 </li><li>今すぐワイヤが一緒に融合していることを、そっと四極管の緊張を緩和するために、ワニ口クリップを持ち上げて、ねじれ装置からテトロードを削除し、ワニ口クリップの近くに四極管をカット。もう一方の端で、同じ長さのワイヤの4つの非結合ストランドが存在するようなループをカット。 </li><li>次に、柔らかい先端がピンセットで線を曲げることにより上部の個々のストランドを分離する。 </li><li>テトロードは現在のマイクロドライブの配列にロードするための準備ができています。 21から25以上のtetrodesを作成し、それがテトロードのロードプロセスのための時間になるまで、埃のないボックスに格納します。 </li></ol> 2。マイクロドライブアレイにtetrodesとアース線をロード<ol><li>続行するには、完全なマイクロドライブアレイが必要になります。あなたがまだ一つを構築していない場合、ビデオを参照してください&quot;慢性的なin vivoでの録音のためのマイクロドライブアレイ：。ドライブの製造&quot;私たちの設計計画では、四極管は、コネクタハードウェアの一端に装着され、電極チップは、マイクロドライブアレイのベースの下に延びるように、マイクロドライブにポリイミドキャリアの管を通って実行されます。 </li><li>開始する前に、一端にコネクタボードに取り付けることができる、そしてもう一方の端に、panaviseによってクランプすることができるドライブのホルダーを構築する。この例では、ドライブのホルダーは、X - ACTOのナイフのハンドル（図1c）の一方の端に接着ミル- maxのコネクタです。 </li><li>マイクロドライブのいずれかのキャリアのチューブをポリイミドに柔らかい先端がピンセットで四極管を保持し、ステレオスコープを用いて、四極管の先端を押してください。個々の電極ワイヤは、ドライブアレイの最上部にあるコネクタボードに近いようになるまでチューブに四極管を押し込みます。キンクたり、曲げたり電線を、それが四極管の角度で、脳ではなく、垂直に入るの原因となります、と四極管の整合性を弱体化するように注意してください。 </li><li>柔らかい先端がピンセットを用いて電極のインタフェースボードのそれぞれの穴に4本のワイヤーのもう一方の端をフィード。もう一度、配線をよじれたり、曲げないように。場所内のすべての4本のワイヤで、短縮下顎を持っているプラ​​イヤーでその穴に金色のピンを押してください。ピンが穴に押し込まれている場合、彼らは、銅線の絶縁被覆と電気的に接続を作成します。 </li><li>後で参照するために、マイクロドライブ、電極インタフェースボード上のピン位置との間のマッピングを追跡します。 </li><li> 18 tetrodesの合計のロードを続行。アレイ上の残りの3つのマイクロドライブは、参照電極を収容するために使用されます。各参照電極は、4つのアンボンドワイヤの端の一方のみを使用する四極管で作られています。参照電極を取り付けるために、ローディングの手順に従いますが、コネクタの基板上のそれぞれの参照電極のピンに4つの電極の一方のみを添付する。 </li><li>あなたがマルチサイト録音を計画している場合、それはtetrodesから事前にコネクタボードへの接続を計画する価値があるかもしれない。これは、実験中に間違って四極管の調整の可能性を最小限にする必要があります。 </li><li>テトロードのローディングが完了すると、2つの接地線、動物用と保護コーンのための1つを行います。 1つの6&quot;長い絶縁鋼線（テキスト：0.005&quot;直径）をカットし、ワイヤの両端から、金属製のピンセットを使用して、絶縁体の周囲3mmを削除します。次に4をカット&quot;長い間絶縁鋼線（テキスト：0.005&quot;直径）。一端と反対側で1 cmの絶縁体の周囲3mmを削除します。 </li><li>インタフェースボードに向かってマイクロドライブアレイと、最大の側面の穴に通します6&#39;アース線を。指定された地面の穴でゴールドピンと電極界面のボードへの導線が接続してください。この線は、動物の頭蓋骨に接続します。 </li><li>以前にインストールされているアース線への経路4&#39;アース線に平行。別の指定された地面の穴に金のピンを使用して電極のインタフェースボードから3mm被覆をはぎとった端を接続します。この線は、後でノイズのピックアップを減らすために小さなファラデーケージとして機能する保護コーン、に接続されます。我々は現在、接続ワイヤを終了していると私たちのtetrodesを精製に進むことができます。 </li></ol> 3。 tetrodesの長さを設定する<ol><li>この過程で私たちの目標は、彼らが少し長くターゲットの脳の構造の深さよりもされるように、すべてのtetrodesをカットすることです。この例では、マイクロドライブは、多くの新皮質の領域と成体ラットの背側海馬に到達するのに十分な5〜6ミリメートル、最大旅行のために設計されています。最初に、tetrodesが最大限に露出するようにすべてのマイクロドライブを下げる。同時に鋭い細かいハサミを用いて所望の最終的な長さより約5mm長い長さにすべてのtetrodesをカット。 </li><li>最後のカット​​の場合は、panaviseで鋸歯はさみのペアを用意。わずかな角度の下方で、ダングリング他のハンドルを残したまま、上向きセレーション付つのハンドルをクランプする。 </li><li>今すぐ完全にマイクロドライブを上向きにすることで、彼らのガイドカニューレにすべてtetrodesを撤回。 </li><li>ステレオスコープを使用して、完全にそのカニューレから一テトロードを引き出さない。ガイドカニューレから所望の距離で定規、位置ギザギザハサミを使用する。ゆっくりとゆっくりとの滑らかな動きとの四極管をカット。この四極管が切断された後、3〜4ミリメートルで、最大のマイクロドライブ撤回。すべてが切断されるまで、各テトロードに、このプロセスを繰り返します。この時点で、金めっきのための準備が整いました。 </li></ol> 4。 tetrodesと品質チェックの金めっきニクロムテトロード線をメッキゴールドは、長期安定的な録音のための非常に重要です。それは腐食し、改善する生体適合性を防ぎます。 <ol><li>外部モードでのインピーダンスメータとオーディオ出力（図1d）とDCのチェックモードでの電流発生器をセットアップします。各四極管内のチャネルの6つのペアに現在の発電機の2本のリード線をタッチし、ショートパンツがペア間に存在するかどうかを判断するために、オーディオフィードバックを使用してください。短絡が存在する場合は、もう一度鋸歯状のはさみとテストと四極管を再カット。問題が解決しない場合は、四極管を破棄し、それを交換してください。 </li><li>ショートパンツはすべてtetrodes内に存在しない場合、のような遠いできるだけすべてtetrodesを拡張し、すべてのマイクロドライブを下に移動。 </li><li>電極のインピーダンス（図1e）チェックするための機器構成を変更します。今すぐすべてのtetrodesのヒントは、標準の金めっき液の浴に手をつける。金浴を電気的インピーダンスの電圧計の正側に接続されている。コネクタボード上の対応する端子にインピーダンスメーターの負のリード線に触れることにより、電極のインピーダンスを確認してください。 </li><li>マイクロドライブのアレイ上のすべてのワイヤのインピーダンスを測定し記録する。正常値は1-3 Mohmをからの範囲。 </li><li>現在の発電機では、1〜3μAの間に電流を設定します。次に、しっかりとコネクタ基板上の端子にインピーダンスメーターの負のリード線を取り付けます。電気めっきの構成（図1F）に機器を置きます。インピーダンスメータでは、すぐにバックモードをバイパスするために、通常モードから切り替えて、と。バイパスモードでは、現在では、四極管と金溶液を通過する、とゴールドは、電極の先端上にプレーティングされます。メッキの各ラウンド後のインピーダンスは、以前よりも小さくする必要があります。インピーダンスは1MΩを上回るの下にドロップしなかった場合の電流パルスを繰り返します。許容インピーダンスの保守的な範囲は350キロオームに250kOhmです。インピーダンスが200キロオームを下回った場合、これは短絡している可能性があります。 </li><li>繰り返しパルスの後のインピーダンスが十分に低下しない場合、電極の先端が詰まっされることがあります。テトロードを再カット、ショートパンツをチェックし、金メッキ処理を繰り返します。再加工で効果がない場合は、四極管を交換し、再度起動してください。 </li><li>すべてtetrodesをメッキした後、エタノールで簡単にテトロードのヒントを浸し、そして、それらが3〜5分間乾燥させます。 </li><li>空気にさらさテトロードのヒントを、現在のジェネレータを使用してtetrodes内で短絡回路のテスト。 DC接続は、四極管の二つ以上の電極の間に存在する場合は、再び金で四極管、そしてプレートを再カット。 </li><li>すべてtetrodesの金メッキが完了したら、各tetrod間のインタフェースに中厚シアノアクリレート接着剤のドロップを追加eとそのはチューブポリイミド。これは、マイクロドライブに四極管を固定し、四極管の長さを維持します。 </li><li>最後のステップとして、すべてのネジを回して、ドライブにすべてのtetrodesを移動する。 </li></ol> 5。保護コーンの取り付け保護コーンの目的は、環境からのマイクロドライブと露出テトロードのワイヤーを保護することです。また、実験中に処理するためのサポートを提供し、電気的なノイズを低減します。我々は3次元印刷プラスチックコーン（：ドライブの製造リファレンスパートI）を使用してください。しかし、それは缶ソーダの曲がった部分のように、他の材料から円錐を作ることは可能です。 <ol><li>プラスチック製のコーンに乗り、内側または外側の表面にいくつかのアルミ箔テープを修正。 </li><li>次に、コーンを通して小さな穴（直径1.5 mm）をドリルダウンして、ゆるく円錐内部にワッシャーとナットでネジを取り付けます。これは、アース線の電気の通路として機能します。我々は00から80サイズのネジとワッシャーの組み合わせを使用することをお勧めします。 </li><li>最初に、挿入と部分的に円錐の側面に3つ1〜72サイズのネジを（長さの3 / 16インチ）にします。ドライブアレイは一時停止して、ドライブ上のコーンを挿入します。両方のアース線は、ドライブアレイの底から伸びることを確認してください。何回か1から72のネジを1本の周りに4&#39;アース線の露出部分をラップし、しっかりとネジを締めます。残りの二つの円錐のネジを締めて、ドライブのベースにコーンを固定します。 </li><li>最後に、1cmの短いアース線の被覆のない部分を取ると箔テープと座金との間で、ネジの周りにそれを巻き。ネジを締めて、地面を固定します。今、私たちは最後に外科的移植の準備ができているマイクロドライブアレイを持っている。 </li></ol> 6。代表的な結果<ol><li>マイクロドライブアレイの生産はこれで完了です。あなたのマイクロドライブアレイは、18 tetrodesと3つの参照チャネルがロードされます。それは耐久性の保護コーンとキャップに収められています。保護コーンと終了のマイクロドライブアレイは、平均で25gまで20グラム重量を量る。 </li><li>終了ドライブアレイは、標準的な外科的処置を用いて注入される。ご覧のように、ドライブはプリアンプのチップとデータ集録ハードウェアとソフトウェアに信号を伝送する線の束に取り付けられています。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="図1" /> 図1：テトロードねじれ設定の）回路図。水平バーは自動化されたテトロード式ツイスト装置上記の四極管の未結合電極ワイヤを中断。テトロードのインピーダンスの測定と電極メッキ用B）のセットアップ。短絡をチェックするときに、回路が異なっている：。黒いワイヤがコネクタの基板上の別の電極のチャネルに接続されているC）クローズアップカスタムのマイクロドライブアレイホルダーのツールが作ら。円筒形のバーは、X - Actoのナイフの柄です。コネクタは26ピン、二列、ミル- maxのコネクタです。短いチェックのための2つの部分が歯のアクリルを使用して互いに結合している。D）の構成。チャンネルXとチャンネルYは4テトロードチャネルの任意の2つの異なったチャネルである。E）電極インピーダンスを測定するための構成。電流源は、&#39;off&#39;です。インピーダンスメーターが&#39;on&#39;と&#39;試験&#39;に設定されています。F）は、電極チップの金めっきの構成は、。電流源が&#39;on&#39;の場合、オーディオが&#39;on&#39;であるために設定され、モードは&quot;ユニポーラ&quot;であり、DCテストが&#39;on&#39;である、現在は2マイクロアンペアに設定されています。

<ol>
	<li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex.">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li></ol>

このプロトコルは、2つの部分のプロトコルの第2回目です：&quot;​​in vivoで録音慢性用マイクロドライブアレイ。&quot;マイクロドライブアレイと四極管の組み合わせが目を覚ましに多くのニューロンの同時録画を取得するための強力なツールである、動物の準備を振る舞っ。うまくいけば、我々はあなたがあなた自身の研究室で電気生理学的記録を開始または改善するために必要となるために必要なすべての情報を提供している。 電動テトロードツイスターのデバイスは、カスタム設計と作製した。我々はあなたが同様の機能を持つデバイスを注文できるようになりますベンダーと部品番号を提供している。また、電動旋回装置は、単にワニ口クリップに接続されている磁化攪拌棒を電動回転棒磁石を組み合わせることにより、社内で構築することができ、この構成は、ほとんどの回転、回転方向の手動反転のカウントマニュアルが必要になります、と開始/停止マニュアル。 いくつかの電極のインタフェースボードは、電極のワイヤを接続するためのピンとホールのメカニズムを持っていない。代わりに、コネクタボードから拡張金属ピンを持っているインタフェースボードを取得した可能性があります。このような金属製のピンは、多くの場合、標準的な電子部品に見られるものと類似しています。我々は、簡単に金属ピンにテトロードチャネルを接続するための方法論を概説しています。最初に、各四極管の4つの電極ワイヤの先端に絶縁体を取り除く。これは、ハンドヘルドブタンのトーチを使用して、できるだけ簡潔に、各電極の先端に炎を適用することによって達成されます。金属製のピンを介して簡単にフィットするシュリンク取得し、シュリンクラップが加熱された後にしっかりとピンを絞る予定。金属のピンの長さにシュリンクラップチューブをカット。銀の塗料でシュリンクラップを埋めるために毛細管現象を使います。シュリンクラップに1つの電極のワイヤの露出先端を挿入します。ゆっくりと電極ワイヤは、ピンとシュリンクラップの壁との間になるように金属製のピンを介して収縮ラップをスライドさせます。テトロードの残りの3つの電極のチャネルに対して、これらの手順を繰り返します。最後に、ヒートガンの横方向の動きと、（シュリンクラップ内部電極ワイヤ付き）シュリンクラップで覆われた4本のピンを加熱する。この時点で、テトロードとコネクタボード間の安定性と信頼性の高い接続が必要です。 ほとんど力がそれらを傷つけないように必要とされるこれらの製造全体の手順は慎重に電極ワイヤを扱う。そこに四極管とマイクロドライブアレイの手順の多くのステップがあり、各ステップでは、高品質なデータを得るために他の人と同じくらい重要です。ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室が利用できる機器を考慮するためによく働いています。あなた自身の研究室でリソースが異なる場合があります、したがって、慎重に各ステップを検討し、最適なパフォーマンスを達成するために、独自の要件と制約を満たすためにプロトコルを変更することを躊躇しない。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Panavise</td>
<td>Tool</td>
<td>Panavise</td>
<td>Model 301</td>
<td>Holds either micro-drive array or serrated scissors</td>
</tr>
<tr>
<td>Modified Xcelite 378M Pliers</td>
<td>Tool</td>
<td>Newark</td>
<td>96F8903</td>
<td>For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.</td>
</tr>
<tr>
<td>Slow Cure Glue</td>
<td>Material</td>
<td>Great Planes (Champaign, IL)</td>
<td>GPMR6015</td>
<td>To glue the tetrode to the micro-drive</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold Plating Solution</td>
<td>Material</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Sifco Selectron Gold NC</td>
<td>Contains gold particles for electroplating</td>
</tr>
<tr>
<td>Current Generator</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>A365D-B</td>
<td>A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.</td>
</tr>
<tr>
<td>Impedance Meter</td>
<td>Tool</td>
<td>BAK Electronics</td>
<td>IMP-1 / 6662 / 2788</td>
<td>To check impedance of electrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Hot Air Gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Steinel (Germany)</td>
<td>HG 3002 LCD</td>
<td>To fuse electrodes together to make tetrode</td>
</tr>
<tr>
<td>Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Aven (Ann Arbor, MI)</td>
<td>18768 (Pattern 304)</td>
<td>For handling tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Alligator Clip</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18050-35</td>
<td>A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Biomedical Research Instruments</td>
<td>25-1000</td>
<td>For general cutting of tetrode/electrode wire</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris Toughcut Serrated Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>For final cut of tetrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>Teflon Coated Stainless Steel Wire</td>
<td>Material</td>
<td>A-M Systems (Carlsborg, WA)</td>
<td>790500</td>
<td>Ground wire</td>
</tr>
<tr>
<td>12.5 micron nichrome wire</td>
<td>Material</td>
<td>Kanthal Palm Coast</td>
<td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td>
<td>Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tetrode Twister</td>
<td>Tool</td>
<td>Neuralynx</td>
<td>Tetrode Assembly Station</td>
<td>Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.

</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver Paint</td>
<td>Material</td>
<td>GC Electronics</td>
<td>22-023</td>
<td>For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)</td>
</tr>
<tr>
<td>X-Acto Knife Handle</td>
<td>Material</td>
<td>MSC Direct</td>
<td>X3001</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>
<tr>
<td>26 Pin, 2 Row Connector</td>
<td>Material</td>
<td>Mill-max</td>
<td>852-10-026-30-001000</td>
<td>For constructing a micro-drive holding device.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly

テトロード、4つの電極の束は、生体内で複数のニューロンの同時記録のための貴重なツールであることが実証されています。テトロードのチャネルを介した活動電位署名の差動振幅は、マルチユニットの信号から単一ユニットの活性を分離することができます。正確に四極管の定位位置と深さを制御する能力は、脳の領域全体で整合性のとれた神経活動を研究するために重要です。マイクロドライブアレイと組み合わせることで、それは数日から数週間の経過を正確に配置し、多くのtetrodesの安定した制御を達成することが可能である。このプロトコルでは、我々は、ラットにおける慢性的なin vivoでの録音のためのマルチドライブテトロード配列にtetrodesをインストール、基本的なツールや材料を使用してtetrodesを作製し、条件にする方法、マイクロドライブのアレイへのアース線の接続を確立し実証する、と環境との物理的な接触からtetrodesを保護するために、マイクロドライブのアレイ上に保護用のコーンを取り付けます。

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Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

このプロトコルでは、ラットの慢性的な電気生理学的記録のために設計されたマイクロドライブアレイで使用するためのtetrodesを作製し、条件する方法を示しています。さらに、我々は、インストールのアース線と保護円錐を含むマイクロドライブアレイの建設、最終段階を示しています。

慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：四極管アセンブリ

The tetrode, a bundle of four electrodes, has proven to be a valuable tool for the simultaneous recording of multiple neurons in-vivo.  The differential ...

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

33.1K ビュー.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. このプロトコルでは、ラットの慢性的な電気生理学的記録のために設計されたマイクロドライブアレイで使用するためのtetrodesを作製し、条件する方法を示しています。さらに、我々は、インストールのアース線と保護円錐を含むマイクロドライブアレイの建設、最終段階を示しています。

ビデオ: Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

慢性実験における実装電極やマイクロダイアリシスプローブ用光重合型歯科用接着性レジンの応用

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

生物学

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

慢性脳イメージングのための開頭手術の手順

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. Lightweight recording devices carrying a high density array of tetrodes allow for the simultaneous monitoring of the activity of tens to hundreds of individual neurons. Here we describe a protocol for the fabrication of a micro-drive array with twenty one independently movable micro-drives. This device has been used successfully to record from hippocampal and cortical neurons in our lab. We show how to prepare a custom designed, 3-D printed plastic base that will hold the micro-drives. We demonstrate how to construct the individual micro-drives and how to assemble the complete micro-drive array. Further preparation of the drive array for surgical implantation, such as the fabrication of tetrodes, loading of tetrodes into the drive array and gold-plating, is covered in a subsequent video article.

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

In this protocol we demonstrate how to fabricate a micro-drive array for chronic electrophysiological recordings in rats.

慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：ドラ​​イブの作製

Chronic recording of large populations of neurons is a valuable technique for studying the function of neuronal circuits in awake behaving rats. ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...