純粋な培養物と縞めっき:混合サンプルからの単一細菌コロニーの単一の分離

ソース: ティルデ・アンダーソン¹, ロルフ・ルード^1
1臨床科学ルンド, 感染医学の部門, ルンド大学生物医学センター, 221 00 ルンド, スウェーデン

微生物の生物多様性を特定することは不可能に見えるが、推定1兆種の共存種(1,2)と本当に驚異的である。特に過酷な気候は、ヒト胃の酸性環境(3)または南極の氷河湖(4)のような、特定の種によって支配されてもよいが、細菌は典型的に混合培養に見出される。各株は、別の(5)の成長に影響を与える可能性があるため、コロニーを分離し、栽培する能力(1つのタイプのみで構成される)コロニーは、同様に臨床および学術的な設定で不可欠となっています。純粋な培養は、さらなる遺伝的(6)およびプロテオミクス検査(7)、サンプル純度の分析、およびおそらくより注目すべき、臨床サンプルからの感染剤の同定および特徴付けを可能にする。

細菌は、成長要件の広い範囲を持っており、要求の厳しい種と断固たる種(8)の両方を維持するように設計された栄養培地の多くの種類があります。成長培地は、液体形態(スープとして)または典型的な寒天系(赤藻類由来のゲル化剤)固体形態のいずれかで調製することができる。スープへの直接接種は、遺伝的に多様な、あるいは混合細菌集団を生成するリスクを伴うのに対し、めっきと再ストリークは、各細胞が非常に類似した遺伝的構成を有する純粋な文化を作成します。ストリークプレート技術は、サンプルの進行性希釈に基づいており(図1)、個々の細胞を互いに分離することを目的としています。培養物および指定環境によって持続される任意の生存細胞(以下、コロニー形成部、CFUと称される)は、その後、バイナリ核分裂を介して娘細胞の単離コロニーを見出すことができる。細菌群内の急速な突然変異率にもかかわらず、この細胞群は一般的にクローンとみなされている。その結果、この集団を収穫し、再ストリークすることで、その後の作業は1つの細菌タイプのみを含むことが保証されます。

図1:ストリークプレートは、元のサンプルの進行性希釈に基づいています。I)接種液は、最初はジグザグ運動を用いて分散し、比較的密な細菌集団を持つ領域を作成する。II-IV)ストリークは、4番目の象限に達するまで、毎回無菌接種ループを使用して、前の領域から引き出されます。V)プレートの中央に向かう最終的なジグザグ運動は、接種が著しく希釈された領域を形成し、コロニーが互いに別々に現れることを可能にする。

ストリークプレート技術は、選択的および/または差動媒体の使用と組み合わせることもできます。選択的培地は特定の生物の増殖を阻害する(例えば、抗生物質の添加を通じて)、微分培地は単に別のものと区別するのに役立ちます(例えば、血液寒天プレートの血化を通じて)。

微生物学のすべての仕事の根底にあるのは無菌(無菌)技術の使用である。危険な菌株の意図しない成長、エアロゾル形成、機器/人員の汚染のリスクがあるので、すべての細菌培養物は潜在的に病原性と見なされるべきです。これらのリスクを最小限に抑えるために、すべてのメディア、プラスチック、金属、ガラス製品は、通常、使用前後のオートクレーブによって殺菌され、残留細胞を効果的に拭き取る121°C付近の高圧飽和蒸気にさらされます。ワークスペースは、一般に、使用前および使用後の両方のエタノールを使用して消毒されます。ラボのコートと手袋は、常に感染性薬剤との作業中に着用されます。

1. 設定

1. すべての微生物は、それらが危険であるかのように扱われるべきです。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を結び、傷が特によく保護されていることを確認してください。
2. 70%エタノールを使用して殺菌して作業スペースを準備します。
3. 寒天プレート、サンプル溶液、および殺菌前のプラスチック接種ループまたは金属ループとブンゼンの炎の箱が近くにあることを確認します。使い捨て可能な、プラスチックループは通常前殺菌される。金属ループは70%エタノールに浸し、ブンセン炎の青い領域の近くに保持し、熱くなるまで加熱する必要があります。プレートの蓋を上げて(汚染を防ぐためにわずかに)、固化媒体に対してそれをタップして、ワイヤーを冷却することができます。
4. 作業スペースの繰り返し殺菌と手と手首の徹底的な洗浄/殺菌で各手順を終了します。

2. プロトコル

1. メディアの準備
   1. 利用される細菌種/株を維持する固体培地(通常は1.5%(w/v)寒天を含む固体培地を同定し、調べます。オートクレーブ時のオーバーフローを避けるために、最終ボリュームの2倍を保持することができるボトルに媒体を混ぜます。
   2. ボトルを半締め付けしたキャップで、オートクレーブに20分間121°Cに設定して、メディアを殺菌します。
   3. ボトルがオートクレーブから取り外されるとすぐにキャップを正しく閉じます。メディアをすぐに使用する場合は、ボトルを45°Cに設定した水風呂に入れ、液体状態に保ちます。寒天はそれ以外の場合は32〜40°C未満で固化し、後で85°Cの融点に再加熱(通常は電子レンジを使用)することができます。
2. 培養プレートの調製
   1. 滅菌ペトリ皿(通常は100 x 15 mm)のベースを、実験者の名前、日付、メディアタイプで側面または下部にマークします。
   2. 45°C寒天培養培地(以前に調製)の20〜25 mLをラベル付きプレートのそれぞれに注ぎます。泡がエッジに沿って表示される場合は、これは迅速に通常のピペットと無菌先端を使用して除去する必要があります。
   3. 直ちにすべての蓋を皿の上に戻し、汚染を防ぎます。
   4. 寒天を室温で約2時間、または4°Cで一晩固化させます。一度設定すると、細菌培養プレートは、中表面の結露を最小限に抑えるために、4°Cで逆さまに保存する必要があります。
3. ストリークメッキ
   1. 生殖不能ループを目的の接種液に沈め、ジグザグ運動を用いて採取したサンプルをプレートの最初の象限に直ちに分散させる(図1、I)。
   2. ふたを閉じ、接種ループを再殺菌するか、新しい生殖不能の使い捨てループを集める。
   3. プレートの第2象限に向かって第1象限(比較的密度の高い細菌集団を含む)から放射する3~4ストロークを作ります(図1、II)。
   4. 蓋を閉じて接種ループを再殺菌するか、使い捨てループを廃棄し、新しい滅菌ループを回収します。
   5. 第2象限から第3象限に3-4ストロークのこのストリークを繰り返し、次に3番目から4番目の象限に、毎回無菌ループを使用します(図1、III - IV)。
   6. 滅菌ループを使用して、プレートの中央に向かって4番目の象限からジグザグパターンで1つの最終ストロークを行います(図1、V)。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。
   7. 蓋を閉じ、(細菌種によって必要な場合)空気の流れを防ぐためにパラフィルムでシール。
   8. 細菌種/株に応じて、培養プレートを適切な環境に上下に置き、細菌のコロニーが見えるまでインキュベートします(分離されたコロニーは、初期濃度が変化する可能性があるため、プレートのどちらの領域にも現れることがあります)。
   9. クローン細菌集団を生成するために、別のプレートをストリークアウトし、元のプレートの単一のコロニーから単離した細胞に対してメッキされた接種を元のプレートに交換する。

最初のストリークプレートは、異なる遺伝的構成を持つ細胞に由来するコロニーを含むこともあれば、異なる細菌種からの(サンプル純度に応じて)コロニーを含んでいてもよい(図2A)。

すべてのユニットが共通の母細胞から派生する単一コロニーのその後の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の処置によって、第二のストリークプロシージャは、ブロスへのさらなる特徴付けまたは接種のために適した比較的クローン細菌集団を生成する(図 2B)。

図2:単一の人里離れたコロニーを単離して混合サンプルから純粋な培養物を生成することができる。A)単一の細菌細胞(CFU)の成長は、他の種および株のものから分離されたクローンコロニーを生成した。このCFUは、新しいプレートB)第2のプレートに続くストリーキングに使用され、細菌集団は初期CFUに由来する細胞のみで構成される。

純粋な細菌のコロニーを得て栽培する能力は、臨床および学術的な設定の両方で不可欠です。ストリークメッキは、共有CFUに由来する比較的クローン細胞集団の単離を可能にし、診断中または単離物の追加特性化のために特に関心を持つ可能性がある。サンプルは、適切な寒天ベースの栄養培地にストリークされ、コロニーが見えるまでインキュベートされます。孤立したコロニーは、その後収穫され、第二のプレートに再ストリークされます。

1. The Human Microbiome Project C. Structure, Function and Diversity of the Healthy Human Microbiome. Nature. 486:207-214. (2012)
2. Locey KJ, Lennon JT. Scaling laws predict global microbial diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (21) 5970-5975 (2016)
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