ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

凝固促進剤の血小板形成は、血栓症のリスク増加と相関しています。.ここに提示されるのは、ヒトの血液から洗浄された血小板を単離するための正確なプロトコルであり、凝固促進剤の血小板の特徴であるホスファチジルセリンおよび微小胞放出の曝露を定量化することを目的としています。

活性化された血小板は、主に凝固促進剤であるリン脂質ホスファチジルセリン(PS)を外膜表面に露出させ、元の細胞の元の膜構造と細胞質成分を保持するPS発現微小胞を放出することによって凝固を促進します。ホスファチジルセリンのアクセシビリティは、主要な凝固因子の結合を促進し、凝固酵素の触媒効率を大幅に増幅すると同時に、微小胞放出は細胞間シグナル伝達の重要なメディエーターとして機能します。凝固促進剤の血小板は、止血中の血栓の安定化に重要な役割を果たし、血流中の血小板の割合の増加は血栓症のリスクの増加と相関しています。また、血小板微小胞には、創傷治癒と炎症調節を促進する成長因子が豊富に含まれていることも示されています。フローサイトメトリーを用いたホスファチジルセリン曝露と微小小胞放出の解析は、そのサイズが小さく、関心のあるマーカーの陽性イベントの数が限られているため、大きな課題を提起します。過去10年間で大幅な進歩が見られたにもかかわらず、ホスファチジルセリン曝露と微小胞放出を評価する方法は、まだ進行中の作業です。残念ながら、普遍的に適用可能な単一のプロトコルは存在せず、特定のアプリケーションごとに最も適切な方法論を決定するために、いくつかの要素を評価する必要があります。ここでは、洗浄した血小板をヒトの血液から分離し、続いてコラーゲンおよび/またはトロンビンの活性化を行い、凝固促進剤の血小板を特徴付けるホスファチジルセリンと微小胞放出の曝露を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコールは、多血小板血漿の初期調製と洗浄された血小板の単離を容易にするように設計されています。最後に、ホスファチジルセリンへの曝露と微小胞の放出をフローサイトメトリーによって定量化し、凝固促進剤の血小板の同定を可能にします。

血小板凝固剤の形成は、止血を維持するために重要です^1,2,3。このプロセスには、テナーゼおよびプロトロンビナーゼ複合体の集合に必須の血小板膜上でのリン脂質のアゴニスト誘導性発現が含まれます^1,3,4。血小板活性化後、血小板微小胞も連続的に放出されます^5,6。微小胞(直径50nm〜1μm以上)は、元の細胞の膜構造と細胞質成分の両方をカプセル化しています^7,8。微小胞は、細胞間^{シグナル伝達の重要な}メディエーターであり、^9,10、創傷治癒と炎症調節を促進する成長因子の貯蔵庫でもあります^11,12。微小胞は、活性化血小板よりも50〜100倍凝固促進剤であることも示唆されています¹³。特に、最近の証拠は、貯蔵された血小板が活性化され、微小胞の産生につながることを示唆しています-これは血小板輸血療法の実践に影響を与える可能性があります。微小胞の長期保存期間と凝固促進活性の高まるため、輸血用途における血小板の有望な代替品となっています¹⁴。

方法論の革新は、直接的および間接的に、健康状態と疾患状態の両方で血小板凝固剤の形成を評価するために行われてきました^4,14,15。精製血小板を用いたホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の評価は、多様なヒト疾患において血小板凝固反応がどのように摂動されるかについての新しいデータを提供してきた^1,4。この成長する研究分野は、治療的介入の道も開きます^1,4。しかし、血液から精製された血小板の単離と分析には時間がかかり、専用の実験装置が必要であり、したがって、現在のところ、日常的な臨床診断には適応できません^16,17。ホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の分析も、そのサイズが小さく、関心のあるマーカーの陽性イベントの数が多いため、困難です^18,19。

蛍光アネキシン-V結合を利用したフローサイトメトリーは、20年前の開始以来、血小板および微小胞でのPS発現の評価の基礎となってきました²⁰。これは、凝固促進剤の血小板および微小胞^21,22の検査において広く受け入れられています。したがって、Cazenaveのグループ²³によって開発された技術を使用して血液サンプルから精製された血小板を単離し、血小板活性化²⁴後のフローサイトメトリーによるホスファチジルセリン曝露および微小胞放出のその後の特性評価に使用できる最適化されたプロトコルがここに提示されます。このプロトコルは、関心のある臨床集団における凝固促進血小板のさらなる研究と詳細な特性評価を促進します。

このプロトコルはガイドラインに準拠しており、ボルドー大学病院の人間研究倫理委員会によって承認されました。血液サンプルは、インフォームドコンセントを提供した健康なボランティアから採取され、これらのサンプルは施設のプロトコルに従って処理されました。血小板機能に影響を与える可能性のある物質を摂取したドナーは、実験前10日以内にそのような物質を摂取した場合、除外されました。健康なボランティアからインフォームドコンセントが得られ、血液を採取してデータを公開しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.血液の採取と洗浄した血小板の調製

1. 最初の3 mLを廃棄した後、活性抗凝固剤とクエン酸三ナトリウムとクエン酸およびデキストロース(ACD)を含む収集チューブに末 ?? 静脈血を採取します。.
2. 採取後、チューブを静かに反転させて血液をACDと混合し、混合物を室温で15分間休ませてから遠心分離します。
3. 遠心分離前に自動セルカウンターを使用して血小板をカウントし、遠心分離の正しい速度を決定します(表1)。ブレーキをかけずに、250 x g で室温 (RT) で 10 分間遠心分離することにより、多血小板血漿 (PRP) を調製し、血小板の回復を最適化します。
   注:このステップでは、サンプルに3つの層が生成されます:血漿、血小板、および白血球のごく一部を含む上層。白血球が豊富な中間層。そして赤血球からなる最下層。PRPを上層から新しい50 mLコニカルチューブに慎重に移し、赤血球と白血球による汚染を防ぎます。
4. PRPに、1 mLのACD-A( 表2を参照)と9 mLあたり6.25 μLのアピラーゼを追加します。.
   注:アピラーゼは、0.02 U / mLの濃度で、血小板によって分泌される微量のATPまたはADPを分解し、それにより血小板ADP受容体の脱感作を防ぎ、血小板形状²⁵を維持します。.プロスタサイクリンPGI2阻害剤(0.5μM)もアピラーゼに含めて、血小板の活性化を防ぐことができます。
5. 血小板ペレットを室温で1100 x g で10分間遠心分離することにより、血小板ペレットを調製します。パスツールピペットなどの穏やかな方法を使用して、血小板不良血漿(PPP)を含む上清を吸引し、ペレットを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します( 表3 および 表4を参照)。.ピペットで穏やかに均質化し、さらに3〜4mLの洗浄バッファーを加えます。
   注:カルシウムレベルは、血漿中に存在する血栓因子による凝固を防ぐために減少します。.この段階では、血小板の少ない血漿が完全に除去され、トロンビン産生による血栓形成と血小板の活性化が防止されます。
6. 再びRTで1100 x g で10分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。150 μLの血小板懸濁液を1.5 mLチューブに移し、自動セルカウンターを使用して細胞計数を行います。次に、ペレットを3〜4mLの洗浄バッファーで再懸濁します。
7. 1100 x g で10分間(室温で)最終遠心分離を行います。上清を吸引し、血小板ペレットを反応緩衝液( 表5 および 表6を参照)に再懸濁して、最終濃度5 x 10¹¹ 血小板/ Lを達成します。.
8. 洗浄した血小板を実験前に少なくとも30分間休ませて、残留阻害剤が摩耗し、血小板が緩衝液に順応するのを待ちます。

2. アッセイ調製

1. 反応バッファー中のすべてのアゴニストと蛍光色素を調製します。5 μLのトロンビンを45 μLのバッファー(希釈1:10)に加え、5 μLのイオノフォアを495 μLのバッファー(希釈1:500)に加えます。
   1. 内部アッセイでは、非活性化血小板をシングルアゴニストおよびデュアルアゴニストで治療した血小板に対してベンチマークします。50 x^{10 9} 血小板/Lで洗浄した血小板100 μLを、(i)反応緩衝液10 μL、(ii)非希釈コラーゲン3 μL(最終濃度30 μg/mL)、(iii)10 μLの希釈済みトロンビン(0.5 IU/mL)、(iv)3 μLの非希釈コラーゲン+10 μLの希釈済みトロンビン、(v)10 μLの希釈済みイオノフォア(最終濃度2 μM)に、さまざまなアリコートで添加します。 これは、以前に述べたように、細胞内カルシウムレベルを直接増加させることが知られています²⁶。
      注:A23187やイオノマイシンなどのカルシウムイオノフォアによる治療は、広範なリン脂質膜のスクランブルとPSの外部化の促進を誘発するため、非常に重要です。
   2. 各アリコートを手で静かに振って、37°Cで5分間インキュベートします。
      注:アゴニストのインキュベーションを長くする(30分)と、フローサイトメトリー解析プロセス中の血小板集団間の分化が改善する可能性があります。
2. 各マイクロチューブに5 μLの非希釈Annexin-V FITCを加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。
   注:血小板特異的受容体の1つであるGPIX(CD42b)またはαIIbインテグリン(CD41、GPIIb)に対するモノクローナル抗体も、血小板細胞をよりよく同定するために含めることができます。
3. 500 μLの反応バッファーを添加してプロセスを停止し、フローサイトメーターを使用してサンプルの分析を進めます。

3. フローサイトメトリー(FC)による凝固促進剤の血小板および微小胞のキャラクタリゼーション

注:信頼性の高い血小板機能解析のためには、確立された標準²⁷に従って構成されたフローサイトメトリー(FC)装置を使用してください。装置は、前方散乱光(FSC)と少なくとも1つの蛍光シグナルを検出できる必要があります。光散乱検出器と蛍光検出器を対数ゲインに設定します。サンプルをFC用に適切に希釈して、個々の血小板のみがデータ取得速度を下げてカウントされるようにします。

1. フローサイトメーターを「低速」の流速に設定し、閾値は10,000血小板イベント以上とします。FITCのパスフィルターを使用して蛍光発光をモニターします。
2. 前方散乱法(FSC)を使用して血小板集団をゲートします。血小板と放出された微小胞をそのサイズに応じて調べます。密度プロットを使用して、休止血小板と刺激血小板の両方について、血小板と放出された微小胞を特定します。各ゲート母集団を個別に分析します。
3. FL1軸に従って凝固促進血小板を区別します。ネガティブカットオフを、休止状態(すなわち、反応緩衝液の存在下)の血小板集団の右端に配置します。血小板活性化後、このカットオフの右側に局在するすべてのイベントを、ホスファチジルセリンを曝露する血小板として分類します。
4. 微小胞は血小板よりも小さいため、その特異な光散乱特性によって区別されます。カットオフを、休止血小板集団で観察される最小のFSC値に設定します。活性化後、この閾値を下回るホスファチジルセリン陽性事象を微小胞として分類します。
   注:必要に応じてカットオフを調整することにより、血小板サイズの個々の変動を考慮に入れます。.静止状態にある微小胞が1%未満であることを確認してください。

凝固促進剤の血小板および微小胞の定量は、Annexin-V染色を使用して行われ、サンプルあたり少なくとも50,000のイベントが記録されています。ステップ 2.2 で述べたように、ベースラインの血小板測定値は、 図 1A に示すように、反応バッファーでインキュベートしたサンプルから行いました。血小板サイズは、前方散乱(FSC)の中央値を使用して測定されました。FSCはさまざまな要因の影響を受けますが、血小板を含む細胞サイズの推定の一般的なプロキシであることに変わりはありません。面積の密度プロット(図1A)を使用して、休止血小板と放出された微小胞を同定し、ゲートしました。

非活性化血小板の場合、アネキシン-V染色によって決定されるホスファチジルセリン(PS)を示したのは2.9%未満でした。コラーゲン単独またはトロンビンまたはカルシウムイオノフォアと組み合わせて洗浄した血小板を活性化すると、PS曝露の観察可能な上昇が見られました。.コラーゲンだけでも、PS陽性血小板が26.7%増加しました。トロンビンはPS曝露への影響が最小限(9.1%)であったが、コラーゲンと関連させると、PS曝露血小板の割合が36.2%に増加した。参考までに、2 μM イオノフォアで処理すると、血小板の 49.6% が凝固促進剤になりました。

図1 は、健康な個人の洗浄された血小板からの微小胞のベースライン割合が最小(0.3%)であったことを示しています。トロンビンとコラーゲンは微小胞形成を最小限に増加させましたが、微小胞形成が有意に増加したのはコラーゲンとトロンビンの組み合わせだけでした(図1D;11.4%)。2 μM のイオノフォアを添加すると、コントロール血小板によって形成された微小胞の 44.0% が PS 曝露されました。

図 2 は、このプロセスから予想される変動、再現性、および再現性に関する情報を示しています。

図1:安静時および活性化した対照血小板におけるPS曝露と微小胞形成。血小板は、30 μg/mL コラーゲン (B)、0.5 U/mL トロンビン (C)、コラーゲンとトロンビンの組み合わせ (D) と 2 μM イオノフォアを使用して、活性化または不活性化 (安静時) (A) しました。代表的なドットプロットは、血小板サイズ(前方散乱光(FSC log))とアネキシン-V結合を示しています。水平線と垂直線(E)は、血小板陰性の集団を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:イオノフォアとのインキュベーション後のPS曝露と微小胞形成の再現性と再現性。 クエン酸塩(カルシウムキレート剤)で処理した、または未処理の洗浄血小板中の2μMまたは5μMイオノフォアとインキュベートした後のPS曝露および微小胞形成の分析:(A)4つの異なる健康なコントロールから;(b)1つの健康なコントロールから5回繰り返される;(C) 2 人の異なる技術者によって準備された 2 つの健康なコントロールから。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:全血中の血小板数に対する多血小板血漿調製の相対遠心力。.

表2:酸-クエン酸-デキストロース(ACD)の1L水溶液の調製。

表3:洗浄バッファーの原液の調製。

表4:ストック溶液からの洗浄バッファーの50mL即席溶液の調製。

表5:反応バッファーの原液の調製。

表6:ストック溶液からの反応バッファーの50mL即席溶液の調製。

凝固促進剤血小板に関する最近の研究では、^{いくつかの疾患における}血小板の変化が強調されており1,28,29、詳細な分析と特性評価の重要性が強調されている30,31,32。血小板凝固剤の形成を評価するための現在の臨床検査は限られていますが、過去 20 年間で臨床的な関心は大幅に高まっています。例えば、カルシウム依存性スクランブラーゼTMEM16F(ANO6)は、凝固促進剤ホスファチジルセリン(PS)曝露に関与している³³。TMEM16Fの変異体は、スコット症候群33,34,35、リン脂質スクランブル障害および活性化血小板³⁶におけるトロンビン生成の減少を特徴とするまれな出血性疾患と関連している。さらに、凝固促進剤の血小板レベルの上昇は、血栓性脳卒中や冠動脈疾患と関連しており、血小板凝固剤の活性を抑制する治療法への関心を呼び起こしています³⁷。凝固促進剤の血小板形成を評価するために現在利用可能な方法のうち、アネキシン-V結合および微小胞放出によるPS曝露の評価は、最も一般的に使用される方法の1つである^38,39。

ここで概説するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してPS曝露と微小胞放出を測定することにより、ヒト精製血小板の単離と凝固促進血小板の特性評価を可能にします。健康なボランティアに、採血の少なくとも10日前に血小板機能に影響を与える可能性のある薬を控えるようにアドバイスすることが重要です。採血には、トロンビンの生成と血小板の活性化を誘発する可能性があるため、静脈の外傷や過度に遅い流れを避けるための注意が必要です。クエン酸ナトリウム-抗凝固血液は、残留カルシウムが遠心分離中のトロンビン生成および血小板活性化を可能にする可能性があるため、洗浄した血小板の調製には推奨されない¹⁷。ACD抗凝固血液のpHは6.5で、クエン酸抗凝固血液のpH7.5および13mmol / Lのクエン酸塩濃度¹⁷と比較して、クエン酸濃度は22mmol / Lと高くなっています。ACD抗凝固血液中の酸性pHと細胞外カルシウム濃度の低下は、血小板凝集を防ぎます²⁴。収集プロセス中のトロンビン生成を最小限に抑えることが重要です。静脈うっ血や過度の圧力を防ぐために、少なくとも21Gの針を使用した非外傷性静脈穿刺が推奨されます。さらに、血液の最初の数ミリリットルは、組織因子や微量のトロンビン¹⁷による汚染を避けるために廃棄する必要があります。静脈穿刺とサンプル処理の間の時間を最小限に抑えることも不可欠であり、長期の血液貯蔵は血小板の活性化につながり、それによってPS曝露と微小胞放出を増加させる可能性があるからである⁴⁰。自発的な血小板の事前活性化を防ぐために、血小板調製手順全体において特別な注意を払う必要があり、これは調製プロセス自体で起こり得る^41,17。さらに、精製された血小板を単離するには、他の血球による汚染を慎重に回避する必要があります¹⁷。これには、血小板を遠心分離した後に上清を完全に吸引して、きれいな調製を確保することが含まれます。ペレットは通常、視認でき、チューブ壁にしっかりと付着しているため、上清はピペットチップを使用して容易に吸引できます。

遠心分離洗浄ステップでは、血小板は生理学的条件をシミュレートするバッファーに再懸濁されます。洗浄した血小板を生理学的緩衝液中で使用することで、抗凝固剤や血漿から血小板を分離し、トロンビンを介したアーチファクトを防ぐことができます。多血小板血漿(PRP)は高血小板濃度を得るための迅速な方法ですが、機能研究での使用は、抗凝固剤によるpH変化と血漿の細胞外カルシウムおよびタンパク質含有量によって制限され、血小板の活性化に影響を与える可能性があります¹⁷。さらに、血小板活性化中に生成される高レベルのPSは、血漿凝固複合体の集合、その後のトロンビンバースト、およびPRPの血栓形成を促進するのに十分であり、実験結果を解釈不可能にします。対照的に、アピラーゼを含む緩衝液での再懸濁は、ATPおよびADPの分解によるプリン作動性受容体の脱感作を防ぐことにより血小板の機能を維持するために推奨される^42,43。遠心分離および洗浄ステップを繰り返すにはより多くの時間が必要ですが、この方法で調製された洗浄済み血小板の懸濁液は、1〜3時間以下の安定性であるクエン酸PRP調製物と比較して、より高い安定性(5〜8時間)の利点を提供します²³。

この研究は、フローサイトメトリーによる微小小胞の定量化の実現可能性と簡便さを実証しています。しかし、マイクロベシクルの生成は、機械の破片や騒音で失われる可能性があります。したがって、フローサイトメーターが広範囲に洗浄されていること、およびフローサイトメトリー解析中に高いバックグラウンドを引き起こす可能性のある汚染粒子が使用されていないことを確認することが重要です。あるいは、微小粒子検出機能を備えた専用のフローサイトメーターを使用して、微小小胞の形成を同定することもできます。フルオレセイン標識アネキシン-Vの膜PS含量の関数としての結合も研究され、アネキシン-V結合および凝固促進剤血小板応答のための緩衝液中の十分なカルシウム濃度の重要な役割が強調された⁴⁴。

血小板サンプルの経時的な安定性を裏付けるデータは、現在のところ乏しいです。いくつかの研究室では、ホルムアルデヒド含有緩衝液などの固定液を添加してサンプルを安定化させることで、この問題に対処しています。新たに採取した血小板サンプルに固定剤を添加すると、後の分析のためにサンプルを保存できるという利点があります。それにもかかわらず、ホルムアルデヒドの固定は、アネキシン-V結合を人工的に増加させる可能性があります。Rochatらは、低濃度のカルシウムフリーホルムアルデヒド溶液による血小板固定がアネキシンV陽性血小板の割合を変化させないことを実証した⁴⁵。ただし、固定が必要な研究者は、特定のプロトコルを最適化して、人工的に変化した結果を引き起こさないようにする必要があります。それ以外の場合は、サンプルをすぐに処理する必要があります。

PS曝露にもつながる可能性のある別の経路は、循環中の血小板寿命を調節することが知られているプロセスである内因性アポトーシスを含む⁴⁶。アポトーシス促進性BAKおよびBAXタンパク質を活性化すると、カスパーゼが活性化され、PSの外部化が促進され、血小板の in vivo クリアランスにつながります。最近、アネキシン-Vに加えて、別の血小板表面マーカーであるP-セレクチン/CD62Pを使用して、アポトーシス血小板から凝固促進剤を区別することが提案されている⁴⁷。凝固促進血小板は PS マーカーと P-セレクチンマーカーの両方で陽性であると予想されますが、アポトーシス血小板はアネキシン-V に対して陽性ですが、P-セレクチンに対して陰性です。しかし、時間はまた、凝固促進剤とアポトーシス血小板との間の差別化要因でもある⁴⁷。 in vitro での凝固促進血小板の生成は迅速なプロセスですが、内因性アポトーシスはより遅いプロセスであり、⁴⁸時間かかります。これに関連して、凝固促進血小板を評価するために追加のマーカーを使用する必要はなく、方法が簡素化されます。細胞内Ca²⁺ および凝固促進剤血小板形成の持続的な増加は、イオノフォアやコラーゲンおよびトロンビンとの併用活性化などの非常に強力なアゴニストで数分以内に発生しますが、BCL-XL阻害剤(またはBH3模倣物)は、アポトーシス促進性BAKおよびBAXを活性化することによりアポトーシス血小板の形成を引き起こし、ミトコンドリア外膜透過化、シトクロムC放出を引き起こします。 およびカスパーゼ活性化⁴⁹。

結論として、ここで説明するプロトコルは、精製された血小板の単離と、標準的な実験装置およびフローサイトメトリーを使用した凝固促進活性のその後の特性評価を容易にします。この手順は、患者の血液サンプル中の凝固促進剤血小板に関する将来の研究への道を開き、まれなスコット症候群⁵⁰の診断など、臨床診療での潜在的な応用をもたらします。

著者は、利益相反がないことを宣言します。

何一つ。