モルモットから分離された右心房の収縮期機能の観察

本プロトコルは、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を増強する薬物をスクリーニングするための効率的な方法を説明しています。

一般的な慢性心不全(CHF)は、心室の充満および/または排出機能の障害を特徴とし、これが飽くなき心拍出量と発生率の増加につながります。心収縮機能の低下は、CHF の病因の重要な要因です。収縮期機能とは、単に酸素化された血液が左心室に充填され、その後、心拍中に血液が全身に送り出されることです。心臓が弱く、心臓の鼓動に合わせて左心室が適切に収縮できないのは、収縮機能が低下していることを示しています。多くの伝統的なハーブは、患者の心臓の収縮機能を強化することが提案されています。しかし、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための安定的かつ効率的な実験方法は、民族医学研究の過程でまだ不足しています。ここでは、ジゴキシンを例にとると、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための体系的かつ標準化されたプロトコルが提供されています。その結果、ジゴキシンが右心房の収縮性を著しく向上させる可能性があることが示されました。この体系的で標準化されたプロトコルは、CHFの治療におけるエスニック医薬品の有効成分をスクリーニングするための方法論的参照として機能することを目的としています。

心不全は、心筋梗塞、心筋障害、血行動態過負荷、炎症、およびその他の心筋損傷の原因によって引き起こされ、心筋の解剖学的構造と活動を変化させ、最終的には心室のポンプまたは充填の失敗につながります。動悸、疲労感、体液貯留が主な主要な臨床症状^です1。CHF は慢性心不全疾患であり、時間の経過とともに維持、悪化、または代償不全を示す可能性があり、その発生率と有病率は² 歳とともに増加します。心収縮機能の低下は、CHF³ の病因の重要な要因です。この疾患の現在の治療法は、主にアンジオテンシン変換酵素阻害剤、β-アドレナリン受容体(神経ホルモン系、すなわち交感神経系とレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の過剰な活性化を阻害する)、または利尿薬(うっ血^{を軽減する)4}などの降圧薬の使用を伴います.しかし、心拍出量と予備能の減少によって引き起こされる心不全の臨床徴候は、これらの治療の影響を調べる研究ではあまり取り上げられていません⁵。

陽性変力薬は、心筋の収縮性を高めるように設計されています。強心配糖体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、およびβアドレナリン受容体アゴニストは、心不全を治療するための陽性変力薬として使用されます。強心配糖体は主に ジギタリス 誘導体です。一例は、最も一般的に使用されている ジギタリス 誘導体であり、 ジギタリス・ラナタ (白いキツネノテブクロ)⁶に由来するジゴキシンです。それらは細胞膜上のNa⁺/K⁺-ATPaseに選択的に結合して細胞内カルシウム濃度を増加させ、したがって、酸素摂取量を増加させることなく心臓の収縮性と一回拍出量を増加させ、それによって心臓の効率を改善します⁷。強心配糖体以外にも、ホスホジエステラーゼ阻害剤やβアドレナリン受容体アゴニストなどのほとんどの陽性変力薬は、心拍数と心筋酸素消費量を増加させ、心筋細胞のカルシウム負荷を増加させて心筋収縮性を高め、臨床的に重度の不整脈や低血圧を引き起こし、死亡率を増加させる可能性があります⁸.したがって、これらの変力薬の臨床応用は限られています。細胞内カルシウム濃度の上昇による合併症を避けるためには、CHFの治療薬として、より安全で効果の高い変力モジュレーターを開発する必要があります(図1)。

ここ数十年で、心臓の血行動態の正の変力特性をサポートできる化合物を生成および分析するために、多くの研究が行われてきました。Euodia rutaecarpa(Juss.)などの多くの伝統的な漢方薬(TCM)。Benth.、Apocynum venetum L.、およびSophora alopecuroides L.などは、心筋の収縮性を高めることができます^9,10,11。研究により、TCMとその活性モノマーは、変力薬と比較してさまざまなメカニズムを通じて正の変力効果を発揮できることが証明されています。例えば、_C2および_C5(四川Lovage根茎の有効成分の1つ)でメチル化されたリグストラジンの一種であるリグジンジオールは、心拍数を増加させることなく筋小胞体カルシウム過渡性を増強することにより、単離されたラットの心臓の収縮性を有意に増強し、副作用が少なく、CHF12のより良い治療法となる可能性がある。さらに、マトリンはTCM植物Sophora flavescens Aitから抽出されたアルカロイドです。マトリンは、心不全モデルラットにおいて、β_3-ARタンパク質発現のアップレギュレーションを阻害し、eNOS発現を減少させることで、心筋の収縮性を高めることができる¹³。しかし、民族医学の研究では、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための安定的かつ効率的な実験方法が不足しています。

モルモットは、他のげっ歯類と比較して、電気生理学およびカルシウムの取り扱い特性がヒトのものにより類似していることが一般に知られている¹⁴。一方では、モルモットの心電図は人間のそれと十分に類似しており、彼らの心拍Ca²⁺の取り扱いは、ラットやマウスのそれよりも人間の生理学に類似している^15,16。一方、モルモット心筋細胞の計算モデルは広範な研究が行われており、エネルギー学や活性酸素種の代謝¹⁷などの重要な細胞サブシステムが含まれています。したがって、モルモットから単離された右心房は、心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするために広く使用されています。ここでは、ジゴキシンを例にとり、モルモットから単離された右心房を使用して心筋の収縮性を高める化合物をスクリーニングするための体系的かつ標準化されたプロトコルを提供します。したがって、この研究は、CHFの治療における民族医学の有効成分をスクリーニングするための方法論的参照を提供します。

実験プロトコルは、寧夏回族自治区医科大学の実験動物の使用および施設の動物管理および使用委員会の要件に従って実施されました。本研究では、体重300〜450gの雄のDunkin-Hartleyモルモットを使用しました。ジゴキシンの収縮性への影響は、モルモットから分離された右心房で観察されました(図2)。

1.モルモットの単離された右心房の酸素化準備

1. 生体信号取得・処理システム、JH-2筋力変換器、マグナス浴、L型換気フック、厚ハサミ、シャーレ、パラフィンなどの実験装置を準備します( 材料表参照)。
2. 1,000 mLの二重蒸留水に7.02 gのNaCl(120.0 mM)、2.10 gのNaHCO₃(25.0 mM)、0.30 gのKCl(4.0 mM)、0.07 gのMgSO4(0.6 mM)、0.07 gの_NaH2PO₄(0.6 mM)、0.28 gのCaCl₂(2.5 mM)、および1.98 gのグルコース(11.0 mM)を添加して、1,000 mLのKrebs-Henseleit溶液(K-H溶液)を調製します。 マグヌスバスを2〜3回すすぎます(表1および材料の表を参照)。
   注意: K-H溶液の温度を37°C±1°Cに保ちます。
3. 100 mLの二重蒸留水に、0.70 gのNaCl(120.0 mM)、0.21 gのNaHCO₃ (25.0 mM)、0.03 gのKCl(4.0 mM)、0.01 gのMgSO₄ (0.6 mM)、0.01 gのNaH₂PO₄ (0.6 mM)、0.01 gのCaCl₂ (0.8 mM)、および0.20 gのグルコース(11.0 mM)を加えて、100 mLの低カルシウムK-H溶液を調製します( 表1 および 材料の表を参照)。
4. 約20 mLの37 °C K-H溶液を手術槽に入れます( 材料の表を参照)。
5. ペトリ皿の底に5 mmの厚いパラフィンを広げ、次にペトリ皿に37°CのK-H溶液を入れます( 材料の表を参照)。
6. L字型の換気フックを膀胱のラテックスチューブの端に取り付け、ペトリ皿に入れて、1〜2個の泡/秒に調整します( 材料の表を参照)。
   注意: 泡をゆっくりと調整します。アクションが速すぎると、酸素がすぐに不足する可能性があります。

2.モルモットからの分離された右心房の調製

1. はかりでモルモットの体重を量ります( 材料の表を参照)。
2. 100%酸素中に5%イソフルランを含む誘導ボックスを使用して麻酔を誘発し、その後、メンテナンスのために1.5%〜3%イソフルランを含むノーズコーンに切り替えます( 材料の表を参照)。
3. 粗いハサミで頸動脈を切断し、抜血を誘発してから皿に載せます。次に、はさみを使用して胸部を開き(剣状突起から始まり、側面を完全に分離して心臓を露出させます)、心膜をはがします。
   1. 左手で心臓を持ち上げ、右手で大動脈の根元から心臓を切り取り、K-H溶液と一緒に手術槽にすばやく置きます。最後に、手で心室を2〜3回優しく押し、心室血を絞り出し、心臓をペトリ皿に入れます。
      注:アクションは活発で、2〜5分で完了し、温度は35°Cに制御する必要があります。 K-H溶液の温度は37°Cに制御する必要があります。
4. パラフィンでコーティングしたペトリ皿に心臓の先端を針で固定し、酸素を供給します(60泡/分)。
5. 適切なアトリウムを特定します。
   注:モルモットでは、心房は腹側表面で肺動脈によって分離され、背側では大動脈によって分離されています。左右の心房はどちらも「逆三角形」のように心室に付着しており、右心房は左心房よりもわずかに小さく、エッジに不均一があります。右心室の心筋は薄く、虚脱の上端は右心房です。左心室はより膨らんでおり、冠状血管の分布は豊富です¹⁸ (図3)。
6. 眼科用鉗子で右心房の端をそっと持ち上げ、房室接合部に沿って切断します( 材料の表を参照)。.
   注:洞房結節の損傷を避け、房室接合部に沿って切断しながら、心室により近くで切断するようにしてください。このステップでは、右心房の自動的なリズミカルな収縮を観察できます。
7. 4-0の外科用縫合糸( 材料の表を参照)を使用して、右心房の上部と下部(「対角線」の両端)をそれぞれ結紮し、一方の端をループさせ、もう一方の端を長い糸の端もループさせます。
   注:心房の「対角線」の両端を結紮するときは、できるだけ少ない組織を結紮するようにしてください。

3. モルモットから分離された右心房の収縮期機能の測定と記録

1. コンピュータの電源を入れ、生体信号取得および処理システムに入ります( 材料の表を参照)。接続チャンネル(第1チャンネル、テンション)を決定した後、ゲイン(50 mV)、時定数(DC)、フィルタ(20 Hz)、スキャン速度(1.00 s/div)を調整します。
2. 試料の一方の端をL字型の換気フックに吊るし、マグヌス浴の横にあるペトリ皿と酸素を入れます。試験片のもう一方の端をJH-2筋力変換器に吊るします( 材料の表を参照)。
3. 心房収縮期曲線を観察し、予荷重を0.5〜1.0 gに調整し、安定するのを待ちます(約30分)。
   注意: KH溶液は20分ごとに交換してください。正規の場合は、観測された曲線を基準として、「正規」とマークします。画面が少し速くスキャンされる場合は、これを遅くする必要があります。
4. 0.2mLの低カルシウムK-H溶液を投与し、曲線が下がらなくなるまで5分間観察します。
5. 0.2 mLの5%ジゴキシン( 材料表を参照)を投与し、5分間観察し、3回洗浄した後、正常に戻します。
   注: 管理をマークします。効果が明らかな場合は、画面をより速くスキャンします。曲線が上がらなくなったとき、つまり収縮振幅が増加しなくなったら、すばやく3回洗います。そうしないと、不整脈が発生し、その後の薬物実験の結果に影響を及ぼします。
6. データを収集し、フロッピー ディスクに保存します。

心筋の収縮性が低下すると、心拍出量が不十分になり、CHFにつながります(図1)。このプロトコルにより、モルモットから分離された右心房の収縮期機能に対するさまざまな薬物の影響を記録し、その後、心筋の収縮性を高める民族薬からの化合物を迅速にスクリーニングすることができました。右心房、JH-2筋力変換器、生体信号取得処理システムを段階的に接続した後、パラメータを適切に設定し、収縮期曲線を観察しました(図2)。曲線の振幅は、右心房収縮の強度を表します。実験は4匹の動物で行い、データは記述統計量と度数分布で分析されました。 図4に示すように、正常条件下では明確な曲線が現れ、0.2mLの低カルシウムK-H溶液を投与すると、曲線は徐々に減少し、変化しなくなるまで、右心房の収縮性が弱まったことを示しています。しかし、5%ジゴキシンを0.2mL投与すると、弯曲が徐々に上昇し始め、右心房の収縮性が増強されたことが示唆された。

図1:CHFの病因とジゴキシンの作用機序。 心筋病変や心臓のプリロードとアフターロードの増加は、心筋の収縮性と拡張期能力を低下させ、心拍出量が不十分になり、CHFを引き起こします。このプロトコルは、心筋の収縮性を高めることができるエスニック医薬品の化合物を迅速にスクリーニングすることを目的としています。また、ナトリウムポンプがジゴキシンによって阻害されると、細胞内のナトリウム濃度が上昇し、心筋細胞のカルシウム濃度が上昇し、心臓の収縮力が増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:モルモットから分離された右心房の収縮機能を記録するための実験ワークフロー(1)オスのDunkin-Hartleyモルモットを撮影しました。(2)モルモットは麻酔後、操作盤に固定した。(3)モルモットの胸が露出していた。(4)動物の心臓を取り出し、酸素富化K-H溶液に入れます。(5)右心房を慎重に分離し、その対角線の端を別々に結紮しました。(6)右心房の一端をL字型ベンチレーションフックに吊り下げ、もう一端をJH-2筋力変換器に載せてプレートに固定しました。(7)JH-2筋力トランスデューサーを生体信号取得および処理システムに接続し、パラメータを調整し、関連する溶液を投与し、データを記録しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:モルモットの心臓の表現(背側)。 略語:LA =左心房;LV =左心室;RA =右心房;RV = 右心室。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:モルモットから単離された右心房の収縮性に対する低カルシウムK-H溶液と5%ジゴキシンの影響。 右心房の収縮曲線は、x軸に時間(s)、y軸に張力(g)で示されています。(A)正常条件下では明確な曲線が現れ、0.2mLの低カルシウムK-H溶液の投与後、曲線は徐々に減少し、変化しなくなりました。(B)5%ジゴキシン0.2mLを投与した後、弯曲は徐々に上昇した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:K-H溶液と低カルシウムK-H溶液の調製。

心臓の正常なリズミカルな活動には、孤立した右心房の活動と同様に、適切な物理的および化学的環境が必要です。孤立した右心房は、体の神経支配と全身性体液性因子の直接的な影響から分離されているため、曝露される薬物を変更する際の右心房の活動の変化を観察できます。興奮性細胞における生体電気活性の根本的な原因は、細胞膜のイオン透過性の変化と、それに続く膜¹⁹に沿ったイオンの拡散である。したがって、心筋細胞の膜の外側のイオン濃度の変化は、心筋細胞の生体電気活性と生理学的特性に大きく影響します。イオンの中では、K⁺、Na⁺、Ca²⁺ が最も重要です。血中K⁺ の含有量が過度に高い(7.9 mmol/L以上)と、心筋の興奮性、自動性、伝導性、収縮性が低下し、収縮性の低下、徐脈、伝導ブロックに反映されます。重症の場合、拡張期²⁰で心臓が停止することがあります。血液のCa²⁺ 濃度が上昇すると、心筋の収縮能力が向上します。ただし、Ca²⁺ の濃度が高すぎると、収縮期に心室が停止する可能性があります。この場合、血液の^Ca2+ レベルが低下する可能性があり、心筋の収縮性が低下する可能性があります²¹。さらに、血液中のNa⁺ レベルのわずかな変化は、心筋に認識できる影響を与えません。逆に、心筋の生理学的特性²²に影響を与えるためには、大きな変化が必要である。

ジゴキシンは、うっ血性心不全、心房細動または粗動、特定の不整脈など、さまざまな心臓の問題の治療に一般的に使用される中程度に強力な強心配糖体であり、心臓病学で最も古い薬の1つです²³。これにより、Na⁺/K⁺-ATPase酵素が一時的に阻害され、これには多くの利点があります。Na⁺/K⁺-ATPase酵素は、ナトリウム、カリウム、カルシウムの流入と流出を制御して、細胞内環境を(間接的に)維持します。ナトリウムポンプは、Na ⁺ / K ⁺ -ATPaseの別名です。ジゴキシンによって引き起こされるナトリウムポンプの閉塞は、心筋細胞の細胞内ナトリウムおよびカルシウムレベルの増加につながり、心臓の収縮力を増強する²⁴。これにより、心機能の重要な指標である左心室駆出率が増加します²⁵。しかし、低カルシウム環境では、心筋の収縮性と心臓の脱分極が影響を受けます(図4)。

モルモットは、心血管への影響が予想される薬物を評価するための貴重な生物学的モデルである²⁶。彼らの心筋細胞のイオンチャネルと電流は、ヒト心筋細胞によって発現され、測定されたものと非常によく似ている²⁷。モルモットの分離された右心房を使用して、心筋の収縮性を高めることができる薬剤をスクリーニングするこのプロトコルは、シンプルで操作が簡単です。各投与後、収縮期曲線を5分間観察し、その後、右心房を正常になるまで3回洗浄します。特に、ストロファンチン-Kは、右心房での毒性反応を避けるために、わずかな効果の直後にゆっくりと投与し、すぐに洗浄する必要があることに注意することが重要です。実験全体を通して恒温浴を使用して、37°Cの実験環境を維持し、したがって、右心房での良好な生理学的活性を確保しました。

ここで紹介するモデルには、さまざまな利点があります。単離されたモルモットの右心房モデルは、従来の心筋細胞や心臓組織全体よりも高いレベルの機能的および構造的統合を表していますが、 in vivo モデルに関連する交絡の複雑さも回避します。このモデルで観察されるもう一つの大きな利点は、異なる時間に複数の薬物を投与する能力であり、これにより、心筋の収縮性に対するさまざまな薬物の影響を監視できます。特に、このモデルで記録された心筋収縮値は、心筋細胞の縦方向の収縮から導き出されます。右心房壁の縦方向の心筋の伸縮は、房室リング²⁸に縦方向の引っ張り運動を生じさせる。さらに、このモデルには、前述のように使いやすさ(つまり、簡単な操作と低コスト)という利点があります。

この方法の限界には、 これがin vitro 実験であるため、心拍数に対する薬物の影響を正確に記録できないことが含まれます。別の制限は、適切に行われない場合の麻酔の潜在的な副作用です。この実験では、用量依存的な心臓保護機能にもかかわらず、イソフルラン吸入麻酔が採用されました。より多くの投与量で使用すると、イソフルランは潜在的に危険であるように見えます。.その結果、その投与量を考慮に入れる必要があり、実験を行う際にはイソフルラン投与量の適切な管理が必要です。同様に、再現性のある安定した結果を得るためには、いくつかのステップが技術的に重要であることを覚えておくことが重要です。これには、正常な収縮期および拡張期の活動を維持するために、できれば3分以内に右心房標本を迅速に準備することが含まれます。心臓を損傷から保護するために、すべての製剤は37°CのK-H溶液を使用し、十分な酸素を供給する必要があります。さらに、実験の成功は、右心房の調製、単離、および結紮中の適切な手作業による取り扱いに大きく依存しており、これには練習が必要です。

要約すると、単離されたモルモットの右心房を使用して心筋収縮性を高める化合物をスクリーニングするための体系的で標準化されたプロトコルが開発されました。このプロトコールは信頼性と効率性に優れており、CHFの治療におけるエスニック医薬品の有効成分をスクリーニングするための方法論的参考資料として役立ちます。他の潜在的な分子標的を調査するさらなる研究のために、コンピュータシミュレーションと表面プラズモン共鳴は、薬物誘発性心臓収縮のメカニズムを解明するための強力なツールである^29,30。

著者は何も開示していません。

本研究は、寧夏回族自治区自然科学財団(Grant No. 2023AAC03620)、寧夏回族自治区高等教育局科学研究プロジェクト(NYG2022030)、中国国家自然科学財団(Grant No.82160816 and 82260797)の支援を受けて行われました。