自己組織化ヒト間葉系幹細胞凝集体の構築、特性評価、および再生応用

本研究では、ヒト間葉系幹細胞の自己組織化に基づく凝集体の構築方法を検討し、頭蓋骨欠損の再生治療のための形態学的および組織学的特性を同定する。

間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製能と多系統分化能を特徴とする様々な供給源から誘導することができ、特に歯、骨、軟骨、皮膚の再生に向けた再生医療の有望な候補として浮上しています。MSC凝集の自己組織化アプローチは、特に発達中の間葉系凝縮を模倣した細胞クラスターを構築するため、高密度の幹細胞送達、保存された細胞間相互作用、および微小環境ニッチとしての細胞外マトリックス(ECM)が可能になります。この方法は、効率的な細胞生着と生存を可能にすることが示されており、したがって、組織工学における外因性MSCの最適な適用を促進し、臨床臓器の再生を保護します。この論文では、臍帯間葉系幹細胞(UCMSC)に基づく自己組織化凝集体の構築と特性評価のための詳細なプロトコルと、頭蓋骨再生アプリケーションの例を提供します。この手順の実施は、組織工学と再生医療のための効率的なMSC移植戦略の確立を導くのに役立ちます。

間葉系幹細胞(MSC)の凝縮は、初期の器官形成^1,2、特に骨、軟骨、歯^{、皮膚の形成}において、体の正常な成長と発達を確保するために不可欠な段階です^1,3,4。過去数十年の間に、培養出生後MSCと生分解性足場を組み合わせた組織工学療法は、骨形成⁵と軟骨再生⁶において重要な進歩を遂げました。しかし、スキャフォールドの使用には、免疫拒絶反応、細胞親和性および可^{塑性が低い}など、いくつかの欠点がある場合がある7。この点に関して、我々は、MSCsと沈着した細胞外マトリックス(ECM)⁸のみを含む、発生中の縮合現象を模倣したスキャフォールドフリーの自己組織化凝集体を提供するスフェロイド細胞培養法の適用可能性を検討した。凝集体の形成は、欠陥形状に一致するように適用可塑性を高め、移植用のMSCを収穫するためのタンパク質分解酵素による足場の移植と消化を回避します⁹。

MSC凝集体は、骨、歯髄、歯周組織、皮膚¹⁰などの組織や臓器の再生に広く使用されています。種子細胞の候補として、骨髄MSC(BMMSC)、臍帯MSC(UCMSC)、脂肪組織由来間質細胞(ADSC)、歯科用MSC(例えば、歯髄間葉系幹細胞[DPSC]、乳歯間葉系幹細胞[SHED]¹¹、歯周間葉系幹細胞[PDLSC]⁾¹²など、多くの異なるタイプのMSCを選択することができます。.過去10年間に、アシステッドアグリゲーションや自己組織化凝集など、三次元細胞クラスターの多くの技術が開発されました。しかし、補助凝集アプローチは、ECMを産生し、均一で密集体を形成するのに弱いことが多く、したがって、生理学的条件^13、14、15を模倣するのには適していない。さらに、いくつかの補助凝集法は、安定した構造を形成するために細胞-材料相互作用を必要とするが、16,17,18,19、^一方、この自己組織化凝集法は、一般に広範囲のMSCsに利用可能である。特に、我々の最近の臨床試験では、MSC凝集体は、損傷したヒト切歯への移植後に歯髄-象牙質複合体および歯周膜を再生するために成功裏に使用されている。 これらは、生理学的構造と機能を持つde novo組織再生を達成しました^20,21。

この論文では、MSC凝集体の構築と特性評価、 およびin vivo 移植の徹底的な手順について説明します。このアプローチは、幹細胞の応用に基づいて、歯、骨、軟骨、皮膚などの組織の欠陥を修復することを目指す研究者の注目を集めます。この方法は、シンプルで便利で、追加の足場なしで細胞とECMから完全に構成されており、長期間培養して緻密で安定した凝集体^{を得ることができる22}。一方、この方法で培養された凝集体はECMを豊富に含んでおり、これはこれらの高密度細胞の発達中のニッチを模倣し、したがって組織再生^{を促進する23}。構築プロセスは、細胞の調製と培養、および細胞凝集体の自己組織化形成と収穫の2つの段階に分けることができます。凝集体の特性評価には、倒立型光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM) による 形態学的同定、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)およびマッソン染色 による 組織学的解析が含まれます。形成された凝集体は、頭蓋骨欠損を修復するための再生移植のために実証されました。この手順の実施は、組織工学と再生医療のための効率的なMSC移植戦略の確立を導くのに役立ちます。

注:すべての動物処置は、第4軍事医科大学の動物管理および使用委員会によって承認され、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドに従って実施されました。本研究では、市販の供給源から得られた凍結保存されたヒトUCMSCを使用しました( 資料表を参照)。ヒト細胞の使用は、第4軍事医科大学の倫理委員会によって承認されました。UCMSC は、手順を説明するための例として取り上げられました。頭蓋欠損は、移植手順を説明するための修復の必要性を示す例として取り上げられました。すべての実験を3回繰り返しました。

1. UCMSC骨材の構築

1. UCMSCの準備と文化
   1. 10 mLの予熱リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、滅菌バイオセーフティキャビネット内の新しい15 mL遠心チューブに加えます。
   2. 凍結したUCMSCを含む凍結チューブを液体窒素から取り外し、すぐに37°Cのウォーターバスに入れます。チューブを静かに振って、細胞の融解を迅速かつ完全に促進します。
      注意:凍結液中のジメチルスルホキシド(DMSO)は細胞毒性を引き起こす可能性があるため、手順全体を1分以内に完了する必要があります。
   3. 凍結チューブ内の細胞をわずかに懸濁し、10mLのPBSを含む遠心分離チューブにすべての内容物を移します(ステップ1.1.1)。サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、10mLのPBSで細胞を洗浄します。
   4. サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、10%のウシ胎児血清(FBS)、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、および584 mg / Lグルタミンを含む完全なα-最小必須培地(α-MEM)で細胞を穏やかに再懸 ?? します。.
   5. 再懸濁した細胞を10 cmの培養皿(遠心分離後の細胞の総量に応じて、1つのチューブに1〜2皿の皿で、皿あたり×5〜10⁶ 細胞の密度で播種します)。ディッシュに完全なα-MEM培地を合計10mLまで加えます。
   6. 皿を静かに振って細胞を分散させます。加湿チャンバー内で、5%の_CO2 を含む37°Cでディッシュをインキュベートします。一晩インキュベートした後、上清培地を廃棄し、PBS 1-2xを5 mL加えて非接着性細胞を除去します。新鮮な完全α-MEM培地10 mLを加えます。培養培地は2日ごとに交換してください。
   7. 細胞継代では、細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、上清を捨て、細胞を5mLのPBSで洗浄して培地を完全に除去します。細胞を0.25%トリプシン-1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の2 mLに溶かし、37°Cで2分間インキュベートします。
   8. 顕微鏡下で細胞が丸くなり、細胞間結合が壊れたら、細胞構造をあまり乱さずに細胞を皿から分離します。4 mLの完全α-MEM培地を追加してトリプシンを中和します。.
   9. 新鮮な15 mLの遠心分離チューブでピペッティングすることにより、皿から細胞を繰り返し穏やかに収集します。サンプルを100 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を完全α-MEM培地で再懸濁し、新鮮な培養皿またはウェルプレートに播種します。培養培地は2日ごとに交換してください。
      注:欠陥領域のサイズに応じて、25 mm³ の欠陥は、凝集体を形成するために培養された6ウェルプレート細胞のウェルを使用する必要があります。
2. 骨材の形成と収穫
   1. 10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 584 mg/L グルタミンを含む α-MEM に 50 μg/mL のビタミン C を添加して、細胞凝集体誘導培地を調製します。
      注意: ビタミンCを使用すると、光にさらされるとビタミンCが酸化して効果がなくなるため、ビタミンCを使用するときは直接光にさらさないようにする必要があります。
   2. ステップ1.1.12の細胞が95%のコンフルエンスに達したら(補足図S1)、培地を細胞凝集誘導培地に変更します。新鮮な細胞凝集体誘導培地を2日ごとに交換してください。
   3. 7〜10日間の誘導後(誘導時間の長さは幹細胞の種類によって異なり、UCMSCのエッジでは~7日であることが多い)、顕微鏡下で、ディッシュの底から厚いエッジが分離された成形凝集体を探します。
   4. 培地を捨て、PBSで細胞を2回優しく洗浄します。小さな滅菌鉗子を使用して骨材を端から中央にそっと押し込み、骨材を折ります。
   5. 場合によっては、UCMSC が中心に向かって自発的にカールして、固体の結露を形成することがあります。この構造は、ステップ 1.2.4 で取得した集計と同等です。

2. 凝集体の形態学的同定

1. 一般観察と顕微鏡観察
   1. 骨材は緻密で一体化しており、剥離や移植時の引っ張りなどの機械的な力によって簡単に損傷しないことを確認します。
   2. 顕微鏡で、織り模様のある特定の厚さの膜のような構造を探します。
2. 生細胞/死細胞染色
   1. 6ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり10個×10個の⁶ 細胞の密度で播種します。
   2. 2 μM calcein AM と 4 μM EthD-1 ワーキング溶液を調製し、PBS を使用します。
   3. 0.3%トリトンを細胞に5分間添加し、PBSで3回洗浄して細胞を死滅に誘導し、染色のコントロールとして使用します。
   4. 細胞、凝集体、および死細胞をPBSで2回洗浄します。
   5. ステップ 2.2.2 で調製した PBS 100 μL と調製した染色液 100 μL を各ウェルに加えます。
   6. サンプルを室温で30分間インキュベートし、サンプルをPBSで2回洗浄します。
   7. 各ウェルに200 μLの10 μg/mL Hoechstを加え、サンプルをRTで5分間インキュベートします。
   8. 蛍光顕微鏡で観察します。
3. SEM観察
   1. ステップ1.2.4または1.2.5で得られた凝集体をシードし、細胞に誘導します。ステップ1.2.4で凝集体が形成された後、細胞をPBSで洗浄します。または 1.2.5.
   2. グルタルアルデヒドを使用して細胞を少なくとも4時間固定します。
   3. サンプルをPBSで洗浄し、エタノールの30%、50%、70%、80%、90%、100%までの勾配濃度でそれぞれ5分間脱水します。2倍を無水エタノールで処理します。
   4. 骨材を3mLのヘキサメチルジシラザンに30分間浸します。すべての液体を吸引し、サンプルを自然に完全に乾燥させます。
      注意:ヘキサメチルジシラザンは揮発性で毒性が高いため、プロセス全体をドラフト内で実行する必要があります。
   5. 乾燥させたサンプルを両面カーボンテープでサンプルテーブルに貼り付け、表面を金属でコーティングします。サンプルを室温(RT)で数日間保存します。
   6. SEMで観察します。
      1. サンプルを交換しますampマシン内のファイル。マシン電圧を5 kに、焦点距離を~12 mmに調整します。鮮明な画像が表示されるまでフォーカスバーを調整します。
      2. 低倍率で画像を撮影します。倍率を調整してピントを合わせ直すと、より高い倍率の画像が得られます。
         注意:表面形態の破壊を避けるために、観察前に凝集体の表面に触れることはできません。

3. 凝集体の組織学的解析

1. サンプルの固定と切片化
   1. ステップ1.2.4または1.2.5で得られた凝集体を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで少なくとも24時間固定します。固定後、PBSで洗浄し、サンプルを埋め込みカセットに一晩入れて流水ですすいでください。
   2. メーカーの指示に従って、自動脱水機を使用して、グラジエントエタノール、キシレン、パラフィンを使用してサンプルを脱水します。全体のプロセスは次の通りである:RTで2時間のための85%エタノール、RTで2時間のための95%エタノール、RTで2時間のための95%エタノール、RTで2時間のための100%エタノール、RTで1.5時間のための100%エタノール、RTで45分のためのキシレン、RTで45分のキシレン、RTで30分のパラフィン、 パラフィンを室温で1.5時間、最後にパラフィンを60°Cで2時間。
   3. サンプルをパラフィンに埋め込みます。厚さ約5μmの切片を調製し、カチオン性スライドに接着し、スライドを45°Cで2時間乾燥させます。
   4. キシレンを15分、2回、100%、90%、80%、70%エタノール(それぞれ5分間)で順次脱ワックスします。
   5. スライドを流水で3回、5分間ゆっくりとすすぎます。
2. HE染色
   1. ヘマトキシリンで3〜5分間染色し、水ですすぎ、組織の周りの余分な水分を慎重に取り除きます。
   2. 1%塩酸を含むエタノールで3〜5秒間分画し、流水ですすいでください、その間に色が少し明るく青くなります。ティッシュの周りの余分な水分を取り除きます。
   3. エオシンで1分間染色し、流水ですすぎ、組織周辺の余分な水分を取り除きます。
   4. 70%、80%、90%、100%エタノールで各10秒間、キシレンで15分間、2回脱水し、ドラフト内で自然乾燥させてからシートを密封します。
   5. 中性樹脂ドロップを追加し、スライドをカバーガラスで密封します。光学顕微鏡で観察します。
3. マッソンのトリクローム染色
   1. ヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリンで5分間染色し、水ですすぎ、拭いて乾かします。
   2. 1%塩酸を含むエタノールで3〜5秒間分画し、流水ですすいでください、その間に色が少し明るく青くなります。表面を拭いて乾かします。
   3. Lixinの赤い酸性マゼンタ溶液で5〜10分間染色し、蒸留水ですばやくすすいでください。
   4. ホスホモリブジン酸水溶液で3〜5分間処理します。
   5. アニリンブルー溶液で5分間、水洗いせずに直接再染色します。
   6. 1%氷酢酸で1分間処理します。
   7. 70%、80%、90%、100%エタノールで各10秒間、キシレンで15分間、2回脱水し、ドラフト内で自然乾燥させてからシートを密封します。
   8. 中性樹脂ドロップを追加し、スライドをカバーガラスで密封します。光学顕微鏡で観察します。

4. 移植

1. ヌードマウスに50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔をかけます。.
   注:フットパッドを挟んだときの角膜反射と四肢の反応がないことに基づいて、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。
2. ヨードフォアで消毒した後、ヌードマウスの耳の後ろの皮膚に横切開(~3-4cm)を滅菌済みの小さなハサミで切り取ります。
3. 皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を露出させます。計画された欠損領域の端を11#ブレードで軽く描き、骨片を取り除きます。欠陥領域は直径約4mmの円形領域です。生理食塩水を使用して創傷を洗い流し、適切な止血を行います。.
4. ステップ1.2.5または1.2.6で得られた骨材を滅菌ガーゼに浸して、表面の水分を吸収してから移植します。骨材をその領域に置き、わずかに加圧して欠陥を埋めます。
5. 引っ張った後、インプラントが固定されていることを確認するために皮膚を交換してください。1/2、4、4×10の角度付きステッチと4-0縫合糸で切開部を閉じます。
6. 手術後、動物を活性化するまで温め直した毛布の上に置いてから、ケージに戻します。
   注:動物は、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置してはいけません。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻されません。

UCMSCから骨材は、実験ワークフローに従って正常に構築できます(図1)。凝集体の品質は、形態学的観察と組織学的分析 を通じて 、使用前に評価する必要があります。形成されるラメラ構造は完全で緻密であり、細胞は顕微鏡観察によって織り交ぜられたパターンを形成する必要があります(図2A)。エッジのカールは、集約中に発見できます。オーバーカールしたエッジは、細胞のギャップを残す凝集の失敗を示します(図2B)。最終的な骨材は目視検査で確認でき、簡単に取り外すことができます(図2C)。凝集体は、生/死染色剤を使用してライブで観察できます(図2D)。生細胞の細胞質はカルセインAMで染色して緑色に見えることがありますが、死んだ細胞の核はEthD-1で染色して赤色に見えることがあります。すべての細胞核はヘキストで染色され、青色に見えます。SEMで分析すると、表面スキャンでは、凝集体が正常な細胞構造を持ち、ECMに豊富に存在することが示され(図3A)、断面スキャンでは、細胞の層が数層含まれている特定の厚さの凝集体の典型的な形態学的特性が示されています(図3B)。HEとMassonの染色は、細胞が凝集体内である程度のスペースを伴って積層構造を形成し、栄養液の浸透を促進する可能性があることを示しています(図4A)。一方、凝集体には、コラーゲン繊維で構成されるECMが豊富に含まれています(図4B)。凝集体は、再生用途のために頭蓋骨欠損に埋め込むことができます(図5)。

図 1: MSC アグリゲートを構築するためのプロトコルの図。 上の画像は、細胞培養、誘導、収穫を含む凝集体構築の全過程を示しています。破線の長方形の下の画像は、骨材が皮膚の傷、骨の欠陥、および歯の病気を再生するために適用できることを示しています。略称:MSC=間葉系幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:MSC凝集体の形態学的同定 (A)顕微鏡下での細胞形態。左:UCMSCは播種後24時間でスピンドル形状を示しています。中央:細胞は48〜72時間培養した後、80%〜90%のコンフルエンスに達します。右:細胞は48時間誘導した後、コンパクトで織り交ぜられたパターンを形成します。スケールバー = 500 μm. (B) 顕微鏡下でのエッジ形態。法線エッジ(左)、カールエッジ(中央)、細胞ギャップのあるオーバーカールエッジ(右)が観察できます。スケールバー = 500 μm。黄色の矢印:セルのカールエッジ。黒矢印:細胞のない細胞間ギャップ。(C)形成された骨材は一体化され、緻密であり、ディッシュまたはウェルプレートから容易に取り外すことができる。略称:MSC=間葉系幹細胞。(D)生/死染色。細胞(左)、凝集体(中央)、カルセインAMおよびEthD-1で染色した死誘導細胞(右)。緑:カルセインAM;赤:EthD-1;青:ヘキスト。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:SEMによるMSC凝集体の形態学的観察 (A)SEM観察では、ある程度の厚さ、多層、大量のECMを持つ凝集体が示されています。実線の矢印:セル;中空の矢印:ECM。スケールバー = 30 μm (左)、6 μm (中央)、3 μm (右)。(B)骨材の断面スキャン。断面スキャンは、特定の厚さと複数のセル層を持つ凝集体を示しています。スケールバー = 3 μm (左)、0.6 μm (中央)、0.3 μm (右)。略語:MSC =間葉系幹細胞;SEM = 走査型電子顕微鏡;ECM = 細胞外マトリックス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:MSC凝集体の組織学的解析 (A)HE染色は、凝集体内の連続的な細胞層を意味します。スケールバー = 500 μm (左)、100 μm (中央)、200 μm (右)。(B)Massonの染色は、凝集体にコラーゲンが沈着した濃厚でコンパクトなECMを示しています。スケールバー = 500 μm (左)、100 μm (中央)、200 μm (右)。略語:MSC =間葉系幹細胞;ECM = 細胞外マトリックス;HE = ヘマトキシリンとエオシン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:頭蓋骨欠損の修復のための凝集体の外科的移植を示す手順の例(A)頭蓋骨の露出。(B)直径4mm程度の瑕疵を生じさせる。(C)MSC骨材を埋め込む。(D) 7 日間のモデリング後に PBS で治療された頭蓋骨欠損の代表的なマイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) 画像。(E) 7 日間のモデリング後に MSC 凝集体で治療された頭蓋骨欠損の代表的なマイクロ CT 画像。略称:MSC=間葉系幹細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:細胞は80%〜90%のコンフルエンスに達します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

組織工学バイオテクノロジーの進歩に伴い、最適な再生を達成できる高可塑性で長期生存細胞を含む埋め込み型構造を構築する戦略は、多くの科学者の焦点となっています。現在、MSCの移植方法には、細胞のみの方法、サイトカインで補完されたスキャフォールド^6,24、幹細胞とスキャフォールドの組み合わせ5など、さまざまな方法^{があります。}この論文では、細胞の自己組織化による特定の培地による凝縮クラスターの形成を含むMSC凝集体の構築と移植の効率的な方法を提示します。これは、採取と適用に便利な豊富な細胞ECMの利点を備えています。沈着したECMは、宿主と移植された凝集体との間の生体分子の交換を促進するための天然の足場として機能し、MSCの送達と生着を促進する^25,26。このようにして凝集体を得ることにより、細胞は自然に沈着したECMによって強固にカプセル化することができ、これにより、組織再生のためのより無傷で生理学的に模倣された細胞ニッチを提供する^27,28。私たちのプロトコルでは、生細胞/死細胞染色を使用して、凝集体の生存率を特徴付けます。これに加えて、WST-1などの代謝活性を適用して、凝集体の生存率を確認することもできます。この方法の頭蓋骨再生効果は、マイクロCTおよび組織学的染色によって調べることができます。さらに、このプロトコルは臨床的に適用されており、移植された凝集体は歯髄²¹の再生を達成している。

この手順にはいくつかの重要なポイントがあります。第一に、細胞老化および細胞機能の低下は、紡錘形の形態ではなく、MSCの増殖速度が遅く、細胞形態が平坦化することによって証明できる²⁹。これらの特性により、凝集体の形成が抑制されます。第二に、ポリマーマトリックスのコヒーレンスと密度は、成功した構築を決定する上で重要です。収穫時に骨材の延性が低いことが判明した場合、骨材のECMが再生を促進するのに十分な密度ではないことを意味します。第三に、骨材は、ECM内部の亀裂の発生または細胞接着^の障害30を避けるために、移植前に湿潤でなければならないが、過剰な流体を含まないようにしなければならない。しかし、これらの凝集体には足場が追加されていないため、大面積の欠陥の再生には用途が限定的であることは確かです。

従来、ビタミンCはMSCの増殖と分化を促進するだけでなく、^ECM31の形成を促進することができるため、誘導試薬として日常的に使用されていました。ビタミンCは、分泌されたコラーゲンの品質を促進するだけでなく、MSCのテロメラーゼ活性を誘導する抗酸化物質であり、細胞再生能力を改善する可能性がある32,33,34。凝集体誘導のためのビタミンCの適用に加えて、この手順で他の低分子薬物を追加して、最適な効果を達成することができます。例えば、漢方薬から抽出した化合物であるOstholeを施用すると、細胞凝集体の形成が改善され、歯周炎の状況下でもPDLSCの骨形成が促進されました³⁵。別の前臨床試験では、天然のフィトアレキシンであるレスベラトロール(RSV)は、対照MSCと歯周炎患者由来MSCの両方の凝集体の再生能力を高めた³⁶。さらに、メラトニンベースの戦略は、細胞の老化を防ぎ、BMMSCの自己複製と凝集体の分化特性を長期継代後に維持することができました²⁹。さらに、リコカルコンA(LA)は、骨粗鬆症性骨折の治療におけるBMMSC凝集体の形成可能性を改善し、骨形成能力を石灰化しました³⁷。その後の実験では、複雑な組織欠損においてより好ましい再生効果を達成するために、複合細胞源によって形成された凝集体を確立するべきであり、例えば、血管新生を改善するための内皮細胞の組み込みなどである^38,39。

要約すると、このプロトコルは、形態学的特性評価と組織学的特徴の分析、および再生実践を含む、MSCに基づく凝集体の構築と特性評価のための基本的なガイドを提供します。このプロトコルは、さらなる再生実験の基礎を確立するのに役立ちます。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

この研究は、中国国家自然科学基金会(81930025、82100969、82071075)および中国国家重点研究開発プログラム(2022YFA1104400および2021YFA1100600)からの助成金によって支援されました。国立基礎医学実験教育実証センター(AMFU)のご協力に感謝いたします。