下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。

リキッドバイオプシー(LB)という用語は、原発性および/または転移性腫瘍に由来する血液および他の体液中のタンパク質、DNA、RNA、細胞、または細胞外小胞などの分子を指す。LBはトランスレーショナルリサーチの柱として浮上し、臨床腫瘍学の実践の一部となり始めており、固形生検に代わる低侵襲の代替手段を提供しています。LBは、血液などの低侵襲サンプル抽出 を介して 腫瘍のリアルタイムモニタリングを可能にします。これらのアプリケーションには、がんの早期発見、疾患進行の検出のための患者フォローアップ、最小限の残存疾患の評価、分子進行および耐性のメカニズムの潜在的な同定が含まれる。診療所で報告できるこれらのサンプルの信頼性の高い分析を達成するためには、分析前の手順を慎重に検討し、厳密に従う必要があります。サンプルの収集、品質、および保管は、ダウンストリームアプリケーションでの有用性を判断する重要なステップです。ここでは、循環のないDNAに基づく下流のリキッドバイオプシー分析のために、血漿および血清サンプルを収集、処理、および保存するための当社のリキッドバイオプシー作業モジュールからの標準化されたプロトコルを紹介します。ここで紹介するプロトコルは、標準的な機器を必要とし、生物学的手順に焦点を当てたほとんどの研究室に適用するのに十分な柔軟性があります。

用語「リキッドバイオプシー」は、2010年¹ 月に、原発腫瘍に由来する血液および他の体液中の分子(例えば、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、細胞、または細胞外小胞(例えば、エキソソーム)の存在として定義された。リキッドバイオプシーサンプルの使用は、組織生検としてのトランスレーショナル腫瘍学研究に革命をもたらしており、特定の瞬間に特定の領域に限定され、腫瘍の不均一性のために関連するクローンを見逃す可能性がある。さらに、リキッドバイオプシーは、侵襲的な生検を回避し、患者のコストとリスクを軽減する可能性があるため、一次組織が乏しい、またはアクセスできない腫瘍タイプにおいて適切な役割を果たします。さらに、腫瘍分子特性は、主に治療圧力のために絶えず進化しており、リキッドバイオプシーサンプルは、ベースライン、治療、最良の応答、および疾患の進行時またはそれ以前など、疾患のさまざまな臨床的および治療的時間において、縦方向に採取することができるため、腫瘍クローンダイナミクスを捕捉することができる。「リアルタイムリキッドバイオプシー」の概念は、腫瘍の動的変化をリアルタイムで監視できることを意味し、この疾患における精密医療を可能にする。リキッドバイオプシーは、がんのスクリーニングと早期発見、疾患のリアルタイムモニタリング、最小限の残存疾患の検出、治療抵抗性のメカニズムの研究、治療レベル¹での患者の層別化など、診療所で数多くの潜在的な用途があります。疾患の再発および進行の早期発見は、多くの腫瘍タイプにおいて満たされていない臨床的ニーズであり、がん患者の生存率および生活の質を高める上で重要な要素である。日常的な画像化モダリティおよび可溶性腫瘍マーカーは、このタスクに必要な感度および/または特異性を欠いている可能性がある。したがって、循環遊離核酸に基づくものなど、診療所において新規な予測マーカーが緊急に必要とされている。

リキッドバイオプシー研究に使用されるサンプルの種類には、血液、尿、唾液、および便サンプルが含まれますが、これらに限定されません。他の腫瘍特異的試料は、細胞吸引液、脳脊髄液、胸水、嚢胞液および腹水、喀痰、および膵液²であり得る。前者の液体は、異なるタイプの癌由来物質、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームおよび無細胞循環腫瘍DNA(ctDNA)などの断片を含んでもよい。核酸は、細胞外小胞(EV)に封入されるか、または細胞死および損傷のために体液中に放出され得る。循環遊離DNA(cfDNA)は、主にアポトーシス細胞または壊死細胞から血流に放出され、すべての個体に存在し、炎症性または腫瘍学的疾患におけるレベルの増加を示す³。エキソソームは、核酸、タンパク質、および脂質を含む細胞によって分泌される小さな細胞外小胞(〜30〜150nm)である。これらの小胞は、細胞間通信ネットワークの一部を形成し、多くの種類の体液2に一般的に^{見られる。}EV内部に封入された核酸は、体液中の過酷な環境から保護されているため、リキッドバイオプシー環境でこれらの分子を研究するためのより堅牢な方法を提供します。

全体として、リキッドバイオプシーサンプル中の循環核酸のレベルは非常に低いため、デジタルPCRや次世代シーケンシング(NGS)などの検出には高感度な方法が必要です。サンプルの事前分析管理は、血球溶解および無傷のDNAの放出を防ぎ、cfDNAとゲノムDNAの汚染を引き起こすために不可欠です。さらに、サンプルを抽出する際には、酵素ベースの分析方法の阻害剤の存在を避けるために注意する必要があります。

ここでは、循環核酸分析を含むリキッドバイオプシーベースの下流アプリケーションにとって重要な最初のステップである、血漿および血清サンプルの収集と保存のための標準化された方法を紹介します。

血液サンプルの抽出前に、参加センターから事前の倫理的承認が得られました。血清および血漿単離のための以下のプロトコールは、生物医学研究のための倫理的原則に従って実施された。

メモ: プロトコルを開始する前の事前の考慮事項については、こちらを参照してください。生物医学研究におけるヒトサンプルの使用には、対応するインフォームドコンセントとともに、事前の倫理的承認が必要です。血液サンプルを処理するには、クラスIIバイオセーフティキャビネットが必要です。白衣、保護手袋、眼鏡は、血液媒介性病原体による感染を避けるために、手順全体を通して着用する必要があります。血清サンプルの処理には最低30分が必要です。抗凝固剤を含まないチューブで血液を抽出した後、凝塊形成を可能にするために室温(RT)で30〜45分間維持する。血漿調製には最低40分が必要であり、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)チューブを使用する場合は抽出時から4時間以内、細胞安定化収集チューブまたは特定の無細胞DNA収集チューブを使用する場合は24〜48時間以内にサンプルを処理する必要があります。しかし、一部のメーカーによると、サンプルはこれらの特殊なチューブで最大2週間安定しています。血漿または血清画分に赤みを帯びた外観を与える溶血をチェックすることが重要です。ディスカッションの溶血サンプルについては、トラブルシューティングのセクションを参照してください。

1. リキッドバイオプシー研究のための血清製剤

メモ:この手順の実行に必要な合計時間は30分です(図1)。

1. 抗凝固剤(赤または赤/灰灰黒キャップ)を含まないチューブで4〜10mLの血液を抽出し、RTで30〜45分間維持する。抽出時から4時間以内にこれらのサンプルを処理します。
2. サンプル抽出の日時と被験者識別(ID)を、適切に設計されたサンプルデータベースに記録します。
3. 白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、鮮血液の入ったチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。
4. 遠心分離後、チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。血清上清の上相は、透明で黄色がかったように見えます(図2)。サンプルが溶血の兆候を示しているかどうかを確認し(図3)、必要に応じて溶血の存在を記録します。
5. クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250μLアリコートとして収集チューブに移します。
   注:アリコートの量は、試験要件に合わせて調整する必要があります。
6. 直ちに血清を-80°Cの貯蔵ボックス内で直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。
7. サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。

2. リキッドバイオプシー研究のための血漿調製

メモ:この手順の実行に必要な合計時間は40分です(図4)。

1. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むチューブに血液4〜10mLを抽出する。抽出時から4時間以内にサンプルを処理します。
2. サンプル抽出の日時とサブジェクト ID を、適切に設計されたサンプル・データベースに記録します。
3. 白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、EDTAチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。
   メモ: 他の収集チューブを使用する場合は、製造元の指示書を参照してください。
4. 遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかった色に見えます。サンプルが溶血の徴候を示しているかどうかを確認し(図3)、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨てバルブピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して細胞層を乱すことなく血漿(上清)を15 mL遠沈管に移します。プラズマの残留体積をセル層の上に残しておきます(約5mm)。
5. 溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。(図5)。溶血を評価するには、「ディスカッション」のトラブルシューティングセクションを参照してください。
6. 血漿を15 mL遠沈管中でRT(15°C-25°C)で3,000(±150)x gで10〜20分間遠心分離します 。 このステップを実行して、第1の遠心分離ステップから引き継がれた残留無傷の血球を除去する。
7. 遠心分離後、遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨て電球ピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して、1〜4mLの血漿を1〜4mLポリプロピレン極低温バイアルに移す。血漿の残留量(約0.3mLまたは高さ7mm)は、血漿を血球で汚染しないようにチューブの底部に残す必要があります(図5)。
8. 直ちに-80°Cで貯蔵ボックス内のプラズマを直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。
9. P1000とろ過した先端を使用して細胞層(バフィーコート)を集め、2mLチューブに移します。直ちに凍結し、-80°Cで保存する。

抗凝固剤を含まない血液チューブの遠心分離後、上相は淡黄色で表示され、血清画分に相当する(図2)。この画分は慎重に除去され、その後の分析のために小分けされます。

溶血は血漿または血清画分のいずれかに存在することができ、上相は赤みを帯びた外観を有し、これは溶血の存在および程度を示す(図3)。

EDTAチューブの遠心分離後、いくつかの相または層が明らかになる。上相(淡黄色)は血漿画分であり、総血液量の55%を占める。薄い灰色がかった白い界面は、白血球および血小板を含むバフィーコート層であり、総血液量の<1%を占める。下相(赤色)には赤血球が含まれており、これは総血液量の45%を占める)。白血球層の1cm上方を吸引し、血球細胞による血漿の汚染を減らすために細胞層が乱れていないことを確認します(図5)。この画分は慎重に除去し、その後の分析のために小分けする必要があります。

血漿サンプルから抽出されたcfDNAの濃度および完全性は、電気泳動ベースの方法を用いて評価されるべきである。cfDNAは、市販のカラムベースのキットを用いて抽出した。定量は、cfDNA用途に特異的なゲルベースの市販キット(材料表)を用いて行った。 図6Aは 、下流用途に使用できる高品質のcfDNA抽出の例を示す。一方、 図6B は、高レベルのゲノム汚染を有する不適切なサンプルの例を示す。

図1:リキッドバイオプシー研究のための血清製剤。 サンプル遠心分離からアリコートの貯蔵まで、血清調製プロセスの概要が示されている。ステップ1:血清の単離のための抗凝固剤を含まないチューブ内の血液サンプル。工程2:血液管を遠心分離し、抽出から4時間以内に血清を得る。ステップ3:その後の保存のために血清上清の上相を除去する。ステップ4:血清チューブを-80°Cで直立 して凍結します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:遠心分離後に抗凝固剤を含まないチューブに採取した血液サンプル。 上相は血清画分に相当する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:遠心分離後の溶血試料の一例。 血漿/血清画分に対応する上相は、溶血のために赤色に見える。理想的には、これらのサンプルを廃棄するか、少なくともサンプル中の溶血の存在を記録する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:リキッドバイオプシー研究のための血漿調製。 サンプル遠心分離からアリコートの保存およびバフィーコート収集までの血清調製プロセスの概要が示されている。工程1:血漿の単離のためのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むチューブ内の血液試料。工程2:血液チューブを遠心分離し、抽出から4時間以内に血漿を得る。工程3:細胞層を乱すことなく血漿上清を15mL遠沈管に移す。工程4:血漿を遠心分離して、第1の遠心分離工程から引き継がれた血球を除去する。ステップ5:プラズマを極低温バイアルに移し、プラズマチューブを-80°Cで直立して凍結する。 ステップ6:細胞層(バフィーコート)を集め、-80°Cで保管 します。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5:遠心分離後のEDTA血液サンプル。 3つの可視層は、新鮮な血液を含むチューブの遠心分離後に可視である。上相は血漿画分に対応し、薄い灰色がかった白色の界面はバフィーコートに対応し、白血球および血小板を含み、下相は赤血球を含む。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:血漿から単離されたcfDNAの電気泳動ベースの分析(A)最適な実験の例。(B)最適でない実験の一例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

リキッドバイオプシーは、癌の管理中の異なる時期に多数の潜在的な用途を有する。第一に、診断時に、臨床的にさらに調査される可能性のある潜在的な腫瘍病変の存在を示唆する腫瘍分子マーカーを同定する。第二に、治療中に疾患のリアルタイムモニタリング、治療分子応答の評価、クローン進化、および疾患再発または治療抵抗性の早期発見を行う。最後に、外科的処置の後、最小限の残存疾患を検出するためのツールとして。欧州腫瘍医学会(ESMO)は最近、実用的な治療標的を同定するために、転移性非小細胞肺癌(NSCLC)におけるctDNA変異検査の実施に関するガイドラインを発表しました。これらのガイドラインには、方法論的考察、ctDNAプロファイリングの技術的評価と検証、体細胞モザイク、低バリアント対立遺伝子頻度(VAF)、および付随的な生殖細胞系列病原性バリアント検出などのいくつかの課題の議論^{が含まれます4}。転移性乳がん患者の診断、病期分類、および治療に関する最近発表されたESMO臨床実践ガイドラインは、治療アプローチに変更がある場合、または臨床試験に入るための必要条件である場合のctDNAベースの分析を示しています⁵。

サンプルは、抽出時から4時間以内に処理する必要があります。この時間枠外でサンプルを処理すると、サンプルの分解が進み、溶血が増加し、cfDNA濃度に影響を与え、miRNAプロファイリングなどの下流アプリケーションに影響を与える可能性があります。下流分析に十分な感度を得るためには、2〜4mLの血漿の使用が推奨される。cfDNAベースのアプリケーションには、有核血球を安定化させ、汚染ゲノムDNA(gDNA)の放出を防止する防腐剤が含まれています。DNAは、血液抽出後6°C〜37°Cで最大14日間、これらのチューブ内で安定である。ただし、溶解した白血球による汚染を避けるために、サンプルは24〜48時間以内に処理する必要があります。

血清および血漿サンプルの凍結融解を避けるために、適切な量のアリコートを使用する必要があります。アリコートの量と数は、サンプルの下流での使用と、-80 °C 冷凍庫の貯蔵容量によって異なります。1mLアリコートは、多くのcfDNA抽出プロトコルに使用される標準容量であり、より多くの容量が必要な場合はさまざまなアリコートを解凍できるため便利です。

サンプルの溶血は、透明な黄色がかった外観を有する非溶血サンプルと比較して、溶血が疑われるサンプルの波長540nmにおける吸光度を測定することによって推定することができる。サンプルの相対溶血は、非溶血サンプル(透明な黄色がかった外観)と溶血サンプル(赤みがかった外観)の波長540nmにおける吸光度の比として計算されます。読者は、さらなる情報のために、TylerVan Burenらの記事を参照することをお勧めします⁶。

サンプルの完全性は、すべての下流のリキッドバイオプシーアプリケーションにおいて重要であり、サンプル抽出から処理までの時間とサンプル収集チューブタイプは、ctDNAマーカーの品質と収率に影響を与えるため、考慮すべき2つの重要な要素です。原則として、すべてのサンプルはcfDNA特異的チューブまたはEDTAチューブで収集し、それぞれ抽出から48時間および4時間以内に処理する必要があります。したがって、サンプル収集に関わる人員やサービスとうまく連携することが重要です。理想的には、サンプルの取り扱いと転送の詳細な指示とともに、関係するすべての人のタスクを明確に定義する詳細なサンプル収集回路を確立する必要があります。血清は凝固プロセス⁷中の白血球溶解のためにゲノムDNAで汚染される傾向があるため、cfDNA用途のための血清よりも血漿が好ましい。一方、血漿は、一般に、ヘパリン、ヘモグロビン、ホルモン、免疫グロブリンG、およびラクトフェリン⁸などのPCR阻害剤を含有する。しかし、サンプルの希釈は、サンプルが十分な濃度のcfDNAを有する限り、この問題を克服するのに役立ちます。最近の研究では、リキッドバイオプシーアプリケーションのための前分析ワークフローが報告され、異なる安定化チューブを比較し、血漿から単離された核酸の定量および品質測定を比較し、再現可能な下流分析のための標準化された処理プロトコルの重要性を実証し^{ています9}。米国国立がん研究所(NCI)のcfDNA解析ガイドラインでは、EDTAチューブは2〜4時間以内に処理し、特別な防腐剤を含むチューブは3日以内に処理することが推奨^{されています10}。バイオバンクは、サンプルの処理と保管に必要な機器がなくても、研究者にとって有用な施設となり得ます。理想的には、サンプルは複数回凍結解凍せず、使用前に3年以上保存しないでください。したがって、凍結融解サイクルを避けるために、ダウンストリームアプリケーションのアリコートの量に細心の注意を払う必要があります。

プラズマ処理におけるもう1つの重要なステップは遠心分離です。最初のものは、ctDNAの相対的存在量を大幅に希釈することができるgDNA汚染の原因である単核球からの血漿の正しい単離を決定する。より速い速度で行われる第2の遠心分離は、溶解した白血球¹¹をさらに除去するものである。遠心分離終了後のブレーキの使用は、血漿試料¹²の品質に何ら影響を及ぼさないようである。血液サンプルを処理する際のもう1つの重要な考慮事項は、使用する遠心分離ローターの種類(スイングアウトローターまたは固定ローターのいずれか)です。血液サンプルの処理には、スイングアウトローターをお勧めします。このフォーマットは、密度勾配に基づく血液成分のより良い分離を可能にし、遠心分離後の細胞ペレットの位置は、遠沈管の底部にあり、一方、固定ローター遠心分離機では、細胞ペレットは、チューブの側面に沿って形成される。固定ローターは、より多くの重力の使用を可能にし、タンパク質および核酸の分離により適しているが、通常はより多くのサンプルを同時に処理することができる。

cfDNAの最終収率は、下流のアプリケーション感度にとって重要です。したがって、以前のデータでは、<0.1%の感度を達成するために最低3.6ナノグラム(ng)のcfDNAが必要であり、変異対立遺伝子¹³の検出のために<0.01%の感度を得るために36ngが必要である。収集と抽出のためのサンプル量を決定する際には、cfDNAの品質だけでなく量も考慮する必要があります。例えば、以前の研究では、血漿1mLから抽出されたcfDNAの平均濃度/中央値は、子宮内膜癌14では^21ng/mL、ホジキンリンパ腫では14.3(7-204の範囲)ng/mL、非小細胞肺癌(NSCLC)では8.02(±7.81)ng/^mL16、膵臓癌症例17^では1.35ng/mLであることが示されている¹⁷。必要な血漿量は、採用される下流技術に依存しますが、十分な感度に達するためには、2〜4mLの使用が推奨されます。

サンプルのトレーサビリティは、サンプルコレクションを作成する際に考慮する必要がある重要な側面です。すべてのサンプルとアリコートは、正確かつ明確にラベル付けされ、その後の識別を容易にできるようにする必要があります。バイオバンクは、適用される国内および国際的な法律および規制に準拠して、保存されたデータおよび生物学的サンプルの品質、セキュリティ、およびトレーサビリティを保証する認定された品質管理システムを備えているため、使用することもできます。サンプルに関連するデータは、理想的には、臨床研究のためのデータをキャプチャし、データベースやプロジェクト(https://www.project-redcap.org/)を作成するためにヴァンダービルト大学が開発したWebベースのアプリケーションであるResearch Electronic Data Capture(REDCap)など、この目的に適したデータベースに格納する必要があります。データ暗号化を備えた安全なサーバーを使用することも強くお勧めします。

クリニックにおけるリキッドバイオプシーの実施に関連する課題は最近¹⁰見直しられており、強調された重要な課題の1つは、分析および臨床検証、ならびに結果の再現性に直接影響するサンプル収集、処理、および保管などの分析前条件の標準化であった。CANCER-ID、欧州リキッドバイオプシー協会(ELBS)、Blood Profiling Atlas in Cancer(BloodPAC)などのリキッドバイオプシーコンソーシアムは、分析前のステップを標準化し、臨床現場でのリキッドバイオプシー研究のベストプラクティスを定義することを目指しています^18,19。

リキッドバイオプシーは、がんの診断、治療、フォローアップの文脈において大きな可能性を秘めた非常に柔軟で有用なツール^です20。増え続ける証拠は、その広大な関連性を示しており、その適切な実装と使用のためには、標準化された方法でサンプルを収集することの重要性が、貴重で比較可能なデータを取得するための鍵です。標準化されたプロトコルでの作業は、その後の分析における技術的な障害を回避するために不可欠ですが、これは過去に古いアーカイブサンプルを使用して大きな制限となっていました。ここでは、cfDNAベースのリキッドバイオプシー研究の臨床的および研究のための最適な事前分析手順を保証するのに役立つ検証済みのプロトコルを提供しました。

ベアトリズ・ベロシージョ(BB):BBは、アムジェン社、アストラゼネカ社、バイオカルティス社、ヤンセン社、メルク社セロノ社、ノバルティス社、キアゲン社、ロシュ社ダイアグノ社、ロシュ社ファーマ社、サーモフィッシャー社、ファイザー社、BMS社から講演者、コンサルタント業、またはアドバイザリー職の謝礼を受けました。Sara López-Tarruella (SL): SLは、Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo、MSD、Novartis、Pfizer、Roche Pharma、Gilead、Lilly、Pierre Fabre、Seagen、GlaxoSmithKline、Veracyteから講演者、コンサルタント、またはアドバイザリーの役割に対して名誉賞を受賞しました。ノエリア・タラゾナ(NT):NTは、アムジェン社、ファイザー社、メルク・セロノ社、セルビエ社、SEOM、ESMO社から講演者、コンサルタント業、またはアドバイザリー役の謝礼を受けました。ハビエル・エルナンデス=ロサ(JHL):アストラ・ゼネカ、ヤンセン、ノバルティス、ロシュ・ダイアグノスティックス、ロシュ・ファーマ、サーモフィッシャー、リリー、ダイアセウティクスから講演者、コンサルタント、またはアドバイザリーの役割に対して謝礼を授与されました。Rodrigo Toledo(RT)は、ノバルティスからこの研究に関連する研究助成金を受け、アストラゼネカとベイジーンからこの研究とは無関係の研究助成金を受け取ったと報告しています。残りの著者は、原稿に関して開示していません。

我々は、がんの生物医学研究ネットワーク(CIBERONC)の支援と、次のプロジェクト助成金に感謝したいと思います:LB CIBERONCプラットフォーム:リキッドバイオプシーの標準化と促進のためのシベロンクプラットフォーム。PI ロドリゴ・トレド, (CIBERONC), 2019-2021.