生物発光を用いたマウスにおける乳がん増殖および転移性コロニー形成のモニタリング

ここでは、種々の乳癌細胞株におけるルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質発現を伴う非侵襲的モニタリング法について説明する。このプロトコルは、マウスにおける腫瘍形成および転移性コロニー形成をリアルタイムでモニターする技術を提供する。

乳癌は、頻繁な不均一な悪性腫瘍であり、主に遠隔臓器転移による女性の死亡原因の第2位である。癌細胞が乳腺脂肪パッドに注入される広く使用されている同所性マウスモデルを含む、いくつかの動物モデルが作製されている。しかし、これらのモデルは、腫瘍増殖動態および転移性コロニー形成のモニタリングには役立たない。マウスのがん細胞をリアルタイムでモニタリングする最先端のツールは、腫瘍生物学の理解を大きく前進させるでしょう。

ここでは、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を安定に発現する乳癌細胞株が樹立された。具体的には、この技術は、 インビトロで ルシフェラーゼ活性を測定することによって開始され、続いて非肥満糖尿病重症複合免疫不全(NOD-SCID)マウスの乳腺脂肪パッドへの癌細胞の移植によって開始される2つの逐次ステップを含む。注射後、腫瘍増殖および転移性コロニー形成の両方が、非侵襲的生物発光画像化システムによってリアルタイムでモニターされる。次いで、肺におけるGFP発現転移の定量を蛍光顕微鏡により調べ、観察された生物発光結果を検証する。ルシフェラーゼと蛍光ベースの検出ツールを組み合わせたこの洗練されたシステムは、乳がんの治療や疾患管理に使用できる大きな可能性を秘めた 、生体内で のがん転移を評価します。

乳がんは世界中で頻繁に発生するがんであり、米国では毎年約25万件の新規症例が診断されています¹。その高い発生率にもかかわらず、抗がん剤の新しいセットは乳がん患者の転帰を有意に改善しました²。しかし、多くの患者が疾患の再発を経験し、患者の罹患率および死亡率の主な原因である重要な臓器²への転移性転移を経験するため、これらの治療は依然として不十分である。したがって、乳がん研究における主な課題の1つは、遠位転移の形成を調節する分子メカニズムを同定し、その発生を抑制する新しい手段を開発することである。

がん転移は、細胞が原発巣から剥離し、血液循環を介して隣接する組織に侵入する動的プロセスである。したがって、細胞が同様の転移性カスケードを受ける動物モデルは、このプロセス^3、4を支配する機構の同定を容易にすることができる。さらに、これらの in vivo モデルは、乳癌治療剤^5、6の開発に不可欠である。しかしながら、これらの同所性モデルは、効果が終了時にのみ決定されるため、実際の腫瘍増殖動態を示すことはできない。そこで、腫瘍の発生と転移性コロニー形成をリアルタイムで検出するルシフェラーゼベースのツールを確立しました。さらに、これらの細胞はGFPを発現し、転移性コロニーを検出する。このアプローチは比較的単純であり、侵襲的な処置を伴わない³。したがって、ルシフェラーゼと蛍光検出を組み合わせることは、乳がん治療薬および疾患管理の前臨床試験を進めるための有用な戦略である。

全てのマウス実験は、ヘブライ大学施設動物管理・使用委員会承認プロトコールMD-21-16429-5の下で実施した。さらに、ヘブライ大学は、実験動物ケアの評価と認定のための協会(AAALAC)によって認定されています。

1. 細胞株のメンテナンス

注:ヒト乳癌細胞株(MCF-7、MDA-MB-468、およびMDA-MB-231)をこのプロトコールで使用した。

1. 全ての乳癌細胞株をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養し、加湿二酸化炭素(5%_CO2)インキュベーター中で37°Cで10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。
   メモ: セル密度を定期的に確認してください。分割して、将来の使用のために拡張し、70%のコンフルエンシーに達したときに拡張します。

2. ウイルスの準備

1. HEK293T細胞を1mLのトリプシンで剥離するまで処理する。
2. トリプシン活性を中和するために10mLのDMEM(10%FBS)を加え、細胞懸濁液を新しい15mL遠沈管に移す。
3. 150 × g で5分間遠心分離し、細胞を沈降させた。遠心分離後に上清を捨て、1mLの新鮮なDMEM培地を加える。
4. 細胞濃度を決定し、6ウェルプレートに1.2×¹⁰⁶ 細胞/ウェルのシードを投与する。
5. 翌日、トランスフェクション試薬、無血清DMEM、エンベローププラスミド(VSV-G)、レンチウイルスパッケージングプラスミド(ΔVPR)、およびpLX304ルシフェラーゼ-V5ブラストプラスミドまたはFUW GFPプラスミドを含む、必要なすべての試薬を予温します。
6. 1.5 mL のオートクレーブ処理された遠沈管で、50 μL の無血清 DMEM を 0.3 μg の VSV-G プラスミド、1 μg の ΔVPR、および 1.2 μg の pLX304 ルシフェラーゼ-V5 ブラストプラスミドまたは FUW GFP プラスミドと混合します。
7. これらのプラスミドを培地と十分に混合した後、5 μLのトランスフェクション試薬を加え、穏やかに混合し、混合物を室温で15分間インキュベートする。
8. インキュベーション後、混合物をHEK293T細胞に滴下する。
9. 24時間後、増殖培地を2mLの(30%FBS)DMEMと交換する。翌日(トランスフェクション後48時間)に、ウイルス(「pLX304ルシフェラーゼ-V5またはFUW GFPウイルス」)を含む培地を採取する。
   注: 30% FBS を使用すると、ウイルスの生成効率が向上します。
10. HEK293T細胞残渣を避けるために、ウイルス含有培地を0.45μmのシリンジフィルターまたは遠心分離機に150× g で5分間通過させ、上清を回収する。
    注: 長期間保存するには、ウイルスの作動アリコートを -80 °C に保ちます。

GFPおよびルシフェラーゼを安定に発現する細胞(「GFP⁺Luc+細胞」)^の 樹立

1. 細胞を感染させる前日に、6ウェルプレートに1ウェルあたり8×¹⁰⁵ 個の細胞をシードした。
2. 一晩インキュベーションした後、増殖培地を8μg/mLのポリブレンを含む新鮮な培地と交換する。200 μLのFUW GFPウイルスを細胞に滴下する。
3. オプション:ウイルス効率を高めるには、プレートを560 × g で30分間(37°C)遠心分離します(スピン感染)。
4. 細胞を48時間インキュベートし、蛍光顕微鏡によりGFP発現を検証した。
5. 蛍光活性化細胞選別(FACS)(GFP⁺)によりGFP発現細胞を選別する(図1A)。
6. GFP選別した細胞に、ステップ3.2で説明したようにpLX304ルシフェラーゼ-V5ブラストウイルスを感染させます。
7. 感染後30時間後にブラストサイジン(10 μg/mL)で細胞を処理し、pLX304ルシフェラーゼ-V5芽細胞発現細胞(GFP⁺、Luc⁺ 細胞)を濃縮する。その後、2日ごとに、ブラストサイジンを含む新鮮な培地と交換する。さらに、対照として、ナイーブ細胞を同じブラストサイジン含有培地で処理する。
   注:感染細胞と対照細胞の間には、ブラストサイジン処理の数日後に明確な違いが観察されるべきである。この効果は細胞株依存性であり、通常〜8〜10日かかる。生存率が低い場合、ウイルス産生収率が低いことを示します。その場合は、効率が低いと将来の実験に影響を与える可能性があるため、ウイルスの新しいバッチを生成します。

4. インビトロ ルシフェラーゼ活性の検証

1. MCF-7、MDA-MB-468、およびMDA-MB-231 GFP+ Luc⁺細胞を15cmプレート中で80%コンフルエントになるまで増殖させる。ステップ2.1〜2.2に記載されているように、トリプシン処理によって細胞を回収する。
2. 各ウェル内の細胞数の増加(0.1、0.5、1、2、3、4×¹⁰⁴)を黒い96ウェルプレートに播種する。
   注:黒の96ウェルプレートは、白色または透明なプレートが自動発光シグナルを生成するため、ルシフェラーゼレベルの測定に適しています。対照として、1つのウェルにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のみを使用して、PBSからの自己発光がないことを確認します。
3. すべてのウェルを100μLのDMEMで満たし、16〜24時間インキュベートする。
4. 30 mg/mL のストックから PBS 中のルシフェリン溶液を 1.5 mg/mL の濃度で調製します。ルシフェリン溶液のストックをアリコートし、-20°Cで保存する。
5. 細胞をPBSで1回穏やかに洗浄し、各ウェルに100μLのルシフェリン溶液を加え、2分間待つ。最後に、生物発光を用いて全ての乳癌細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定する。
   注:動物実験の前に インビトロGFP およびルシフェラーゼ発現を調べることは極めて重要である。さらに、ブランクウェルを使用して背景を減算します。

5. マウスにGFP ⁺ Luc⁺ 細胞を注射する

1. 5 ×¹⁰⁶ (MCF-7 および MDA-MB-468) または 2 ×¹⁰⁶ (MDA-MB-231) GFP⁺ Luc⁺ 細胞をそれぞれ 200 μL または 100 μL PBS に移入します。
2. 注射前に、滅菌された生物学的フードを5%消毒液で洗浄する( 材料表を参照)。次いで、4%イソフルランを含む濾過された(0.2μm)空気でマウスを1L/minの気流速度で2−3分間麻酔する。
   注:適切な麻酔を確認することが不可欠です。マウスのつま先をつまんで、応答を探します。
3. 麻酔をかけたマウスの頭の上に円錐形を仰臥位に置きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医軟膏をその目に塗布する。
4. 乳腺の上のマウスの腹部を綿棒でエタノールで拭き取り、4^番目の 乳腺を鉗子で持ち上げます。
5. 脂肪パッドの下に針27 G x 3/4(0.4 x 19 mm)を挿入し、100 μLの細胞懸濁液をゆっくりと注入する。
   注:丸い膨らみが皮膚の下に表示されます。さらに、不適切な注射は、同じ実験群における腫瘍の増殖速度または非存在の偏差をもたらし得る。
6. 注射手順の後、マウスをフードから取り出し、新しいケージに移します。マウスが意識に戻るまでマウスを監視します。
   メモ:使用済みの針とシリンジがすべてシャープスボックスに捨てられていることを確認します。

6. GFP⁺ Luc⁺ マウスにおけるルシフェラーゼレベルの測定

1. 生物発光が検出される前に、左手で首をつかんで意識のあるマウスを拘束してください。次に、手を左に傾けて、下半身を仰臥位にした状態でマウスを上向きにします。
2. 100 μLのルシフェリン(30 mg/mL)を左下腹部象限のマウス腹部表面に注射し、針サイズ27 G x 3/4(0.4 x 19 mm)の1.0 mLシリンジを使用します。
   注:針の先端は、内臓を貫通する可能性があるため、腹壁から3〜5mm以上挿入しないでください。さらに、麻酔をかけられたマウスの体内でのルシフェリン分布が意識マウスよりも遅いため、麻酔なしで注射を行うことが推奨される。したがって、意識のあるマウスにおけるルシフェラーゼレベルをモニタリングすることは、より迅速な手順である。
3. 腫瘍動態を測定する前に、麻酔なしでマウスを7分間保持し、続いて麻酔チャンバー内で3分間保持する。
   注:インキュベーション時間は、異なる実験、細胞株、および種ごとに異なります。したがって、実験を開始する前にインキュベーション時間を較正することが推奨される。
4. ステップ5.2-5.3で説明されているようにマウスを麻酔する。
5. インキュベーション中にソフトウェア(材料表)を開き、イメージングシステムを初期化し、「 初期化」 ボタンをクリックします。
   注:カメラが冷却されて-90°Cに達するまでに約10分かかることに注意してください。 さらに、バックグラウンドコントロールとして、ナイーブマウス(すなわち 、ルシフェラーゼ遺伝子を発現しない細胞を注射したGFP⁺ マウス)におけるルシフェラーゼレベルを測定する。
6. 次の設定を使用して自動露出の設定を維持します:露出時間自動、60秒。ビニングミディアム、F /ストップ1;励起フィルタがブロックされました。発光フィルターが開きます。 初期化 が終了したら、 イメージングウィザード|を選択します。生物発光 をクリックし、[次へ]をクリック |フィルター|を開く 画像 の 被写体でマウスを選択します。
7. フィールド ビューで、ステージ C (10 cm) と [被写体の高さ: 1.50 cm] を選択します。
8. 「 イメージ・セットアップ」ステージ を C にクリックし、「 取得」 ボタンをクリックする前に、マウスがステージ上に適切な仰臥位に置かれていることを確認してください。
9. ドアを閉じ、[ 取得] ボタンをクリックして、画面に画像が表示されるのを待ちます。
   メモ: 自動露出 オプションを使用すると、強い信号は信号に応じて5〜20秒かかります。弱い信号は約60秒かかります。
10. 他のマウスについてもこの手順を繰り返します。
11. 肺転移を検出するには、原発巣の強い信号を厚い黒い段ボール紙で覆い、肺の腹側だけをカメラに向かって露出させます。上記と同じパラメータを使用して画像をキャプチャします。

7. 生物発光と蛍光を用いた 生体外 画像の取得

1. デシケーター内の二酸化炭素(_CO2)吸入を用いてマウスを安楽死させ、オートクレーブ処理されたハサミおよび鉗子を用いてマウスを解剖する。
2. 0.9%生理食塩水を使用してマウスを灌流し、臓器を採取し、1x PBSですすぎ、臓器から血痕を除去する。
3. すすぎた器官をペトリ皿に移し、生物発光機の段階に置く。手順 6.2 ~ 6.6 で説明したのと同じ生物発光設定を適用します。
   注:ルシフェラーゼシグナルの減少により、このステップは時間制限があります。これにより、マウスを安楽死させた後、直ちに生物発光により臓器を可視化する。
4. GFP 画像の場合は、生物発光の代わりに蛍光 GFP フィルターを使用して、手順 6.3 で説明したのと同じ設定を適用します。
5. 実体顕微鏡を用いて肺画像を撮影し、GFP⁺ コロニーの存在を調べた。

8. 生物発光データ解析

1. ソフトウェアをダブルクリックし、[ファイル]メニューから[開く]を選択します。
2. すべてのファイルを開き、最小化します。すべての単位が 放射輝度(光子)であることを確認します。さらに、「 すべてに適用 」をクリックして、すべての画像に同じパラメーターを保持します。
3. 表示メニューからツールパレットを選択すると、新しいウィンドウが開きます。
4. 「 ツールパレット」 ウィンドウから「 ROI ツール 」タブを選択し、「 タイプ」で 「平均 Bkg ROI」を選択します。
5. ROI ツールから [円] を選択し、マウスの胸部領域に小さな円を描画します。
6. 円をダブルクリックし、[バックグラウンド ROI] タブから [将来の ROI に BKG として使用する] オプションを選択し、[完了] をクリックします。

9. 全フラックスの測定

1. 「ツールパレット」ウィンドウで、「ROI ツール」タブを選択し、「タイプ」で「ROI の測定」を選択します。
2. ROIツールから[円]を選択し、マウスの原発腫瘍に大きな円を描きます。
3. [ROI のコピー] を右クリックし、[ROI を各マウスのすべての個別のファイルに貼り付け] を右クリックします。
4. [ROI ツール] タブの [ROI の測定] をクリックすると、[ROI 測定] という名前の新しいウィンドウが開きます。このタブでは、測定値タイプを放射輝度(光子)として、画像属性をすべて入力された値として保持します。
5. ファイルを 測定ファイル (*.txt) または Csv (*.csv) 形式でエクスポートします。
6. エクスポートしたデータをスプレッドシートで開き、 合計フラックス (p/s) と週の値を取得します。
   メモ: この手順は、さまざまなグループを測定するために使用できます。例えば、ビヒクルで処置されたマウス 対 薬物で処置されたマウスが挙げられる。
7. XY プロットを生成し、X 軸に沿って 時間 を表示し、Y 軸に沿って 合計フラックス (p/s) を表示します。各週について、各サンプルグループの [総磁束(p/s) ]パラメータを取得し、ノンパラメトリックスチューデントの t検定を使用して有意差を決定します。

GFPおよびルシフェラーゼベクターを発現する乳癌細胞株(MDA-MB-231、MCF-7、およびMDA-MB-468)を作製した。具体的には、これは逐次感染によって達成された。まず、乳癌細胞株を、蛍光GFPを発現するレンチウイルスベクターに感染させた。GFP陽性細胞(GFP⁺)を感染後2日目に選別し(図1A、B)、pLX304ルシフェラーゼ-V5ベクターに感染させた。次いで、ブラストサイジンを用いて、示された(GFP⁺、Luc⁺)細胞を生成するルシフェラーゼを選択する。 インビトロ ルシフェラーゼ活性を検証するために、我々は、ルシフェラーゼ活性レベルの細胞数依存的な増加を実証した(図1C)。さらに、ルシフェラーゼ活性と細胞数との間に線形相関が認められた(図1D)。

マウスにおけるルシフェラーゼ検出を確認するために、3つのGFP⁺、Luc⁺ 乳癌細胞株すべてを、雌性NOD/SCIDマウスの乳腺脂肪パッドに注射した。次いで、マウスを2週間ごとに生物発光読み取りに供し、腫瘍増殖動態を決定した。我々は、腫瘍増殖動態が細胞株間で異なることを見出した。より攻撃的なMDA-MB-231では速く、攻撃性の低い細胞株MCF-7およびMDA-MB-468では遅くなります(図2)。

次に、MDA-MB-231細胞株によって生成された単離された腫瘍の蛍光測定値が得られた。具体的には、注射後6週間で、マウスから腫瘍を採取し、GFP蛍光を確認し;腫瘍はGFP発現を維持していることが判明した(図3A)。次の目標は、生物発光装置を使用して、生きているマウスの肺における転移性コロニー形成をリアルタイムで評価できるかどうかを決定することでした。陽性の生物発光測定値は、マウス全体の肺から得られた(図3B)。これらが陽性転移性コロニーであることを確認するために、肺を採取し、転移性コロニーをGFPおよび生物発光について観察した(図3C)。

図1:細胞におけるGFP発現およびルシフェラーゼ活性の検証。MDA-MB-231非GFPおよびGFP⁺細胞の代表的な画像。(b)MDA-MB-231、MCF-7、およびMDA-MB-468細胞をGFP発現ウイルスに感染させ、続いてFACSソーティングを行った。各細胞株の画像は、明視野(左)およびGFP(右)で表される。細胞をニコンエクリプス80i顕微鏡下で10倍の倍率で捕捉した。(C)各細胞におけるルシフェラーゼ活性による生物発光をルミノメーターにより測定した。(Aのように)増加した数の細胞を、黒い96ウェルプレートに播種した。カラーバーは発光の強度を表す。(d)MDA-MB-231細胞のルシフェラーゼ活性を実証するXYプロット(Cで測定)。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;SSC-A = 側方散乱ピークの面積;GFP⁺ = GFP陽性;FACS = 蛍光活性化細胞選別。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:腫瘍増殖の動態は、生物発光機によって決定された。 NOD−SCIDマウスにおいてインビボ腫瘍増殖動態を毎週決定し、代表的な画像を(A)MDA−MB−231、(B)MCF−7、(C)MDA−MB−468について生物発光を用いて撮影した。カラーバーは発光の強度を表す。(d)発光活性の定量化は、全フラックスとして提示される。(e)MDA-MB-231マウス;プロットとして表される個々の読み取り値。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:腫瘍形成と肺転移を検証するためのさまざまなアプローチ。 (a)マウスを灌流し、MDA-MB-231細胞から生じた腫瘍を回収した。腫瘍中のGFPレベルを生物発光機によって測定した。(b)生物発光によって示されるように、マウス全体における肺転移。(c)転移の存在を確認するために、肺を採取し、SMZ18ニコン実体顕微鏡(明視野およびGFP)下で観察した。生物発光−Luc−サンプルは、マウスを安楽死させた直後に採取した。カラーバーは発光の強度を表す。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;Luc = ルシフェラーゼ;BLI = 生物発光イメージング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

動物ベースの実験は、癌研究⁷、⁸、⁹のために必須であり、そして実際に多くのプロトコルが^{開発されている3}、⁶、¹⁰、¹¹、^12、13、14。しかし、これらの研究のほとんどは、実験の終了時にのみ生物学的効果を決定したため、腫瘍増殖動態または転移コロニー形成への影響は未定のままである。ここでは、GFPおよびルシフェラーゼを発現する細胞を乳腺脂肪パッドに接種することによる非侵襲的二重生物発光アプローチを提供する。この強力なツールを使用すると、マウスの腫瘍発生と転移をリアルタイムで監視できます¹⁴。ただし、この手法にはいくつかの重要な手順が含まれているため、特別な注意が必要です。例えば、この実験の成功のための重要なステップの1つは、マウス注射前に細胞内のルシフェラーゼおよびGFP発現レベルをモニターすることによって感染の効率を検証することである。したがって、ブラストサイジン投与量¹⁵およびレンチウイルス産生¹⁶プロトコルは、実験効率を高めるために各細胞株に対して最適化されるべきである。

いくつかの技術的問題は、 in vivo 実験における生物発光シグナルに影響を及ぼす可能性がある。これらの問題には、生物発光の読み取り中のマウスの動きが含まれ、画質を妨害し、腫瘍の動態曲線に影響を与える可能性があります。したがって、動物は、基質注入後および処置全体を通して完全に麻酔されなければならない。さらに、複数の動物を同時に機械に配置すると、信号の大きいマウスが強度の低いマウスをマスクできるため、発光読み取りに矛盾が生じる可能性があります。したがって、発光測定値はマウスごとに個別に取得する必要があります。

インビトロ生物発光読み取りを行う場合、培地にはシグナルを妨げる可能性のある血清および他のサプリメントが含まれているため、培養培地をPBSに交換することが不可欠です。さらに、PBSのみを含むサンプル(細胞なし)の発光シグナルを測定することによってバックグラウンド読み取りを排除する必要があります。

このプロトコルは、乳癌細胞の増殖および転移を測定するための非侵襲的技術を記載している。具体的には、本稿では、GFPとルシフェラーゼの両方を発現する乳癌細胞株をマウス乳腺脂肪パッドに注入することを記載する。この組み合わせは、インビボおよびエクスビボでの転移性コロニー形成を測定するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。

この方法の明確な利点にもかかわらず、いくつかの制限があります。主な制約は、生物発光装置の必要性であり、これは比較的高価な機械であり、したがって常に利用可能ではない。さらに、各読み取りには時間がかかるため、マシンがオーバーブッキングされて使用できなくなる可能性があります。もう 1 つの制限は、プロトコル自体を指します。 エキソビボ サンプル中の生物発光シグナルを検出するには、マウスを安楽死させ、サンプルを直ちに検査することが推奨される。このステップは時間制限のある段階であり、大規模な実験セットでは実現不可能です。

結論として、この非侵襲的生物発光ツールは、マウスにおける腫瘍の発生および転移を検出するのに非常に敏感である。このプロトコルは乳癌に限定されず、肺癌や膵臓癌などの他の癌腫にも適用できる。さらに、非侵襲性であるため、抗がん剤¹² の有効性や腫瘍増殖動態への影響をリアルタイムで測定するために適用することができる。

すべての著者は、利益相反がないことを開示しています。

Y.D.S.研究室のメンバーの皆様に感謝いたします。エルサレムのハダサ医療センターのWohl Institute for Translational Medicineが、小動物イメージング施設を提供してくれたことに感謝します。この研究は、イスラエルがん 研究基金のリサーチキャリア開発賞 の支援を受けた。