海馬神経新生研究ツールとしての無線電気生理学と記憶行動検査の同時モニタリング

ここで紹介するプロトコルは、脳波(EEG)と行動評価の同時発生に関する情報をリアルタイムで提供します。このプロトコルに関連するすべてのステップを、神経科学の多く分野、特に学習および記憶分野の研究者にとって魅力的なソリューションとして説明しました。

脳波(EEG)から得られる脳波振幅は、動物や人間の認知能力、記憶、学習の基礎としてよく認識されています。成人の神経新生メカニズムは、記憶力と学習力の向上にも関連しています。伝統的に、研究者は行動課題によってげっ歯類モデルの学習および記憶パラメータを評価するために使用されていました。したがって、行動変化と脳波の同時モニタリングは、脳活動とタスク関連行動の間のデータを相関させる上で特に興味深いものです。ただし、両方の研究を実行するために必要な機器のほとんどは、複雑で高価であるか、自然の動物の動きを妨げる有線セットアップネットワークを使用しています。この研究では、脳波は、新しい物体認識タスク(NORT)の実行とともに、ワイヤレス電気生理学デバイスによって記録されました。動物の行動は、ビデオ追跡システムによって同時に監視されました。両方の記録は、EEG信号を動物の行動にリンクするために同期されたタイムスタンプによってオフラインで分析されました。被験者は、中期環境濃縮処理後の成体Wistarラットで構成されています。6つの頭蓋骨スクリュー電極は、前頭、中央、および頭頂領域の両半球にペアで固定され、鼻骨の後方に位置する電極を参照しました。NORTプロトコルは、動物を2つの同一の物体に10分間さらすことで構成されます。2時間後と24時間後、オブジェクトの1つが新しいオブジェクトに置き換えられました。各物体の探索時間は、行動追跡ソフトウェア(BTS)およびEEGデータ記録によって監視された。行動データと同期した脳波の分析は、アルファとベータの相対バンドパワーの推定と、3つの実験段階間の新しい物体認識と身近な物体探査の比較で構成されています。本稿では、電極製造プロセス、硬膜外電極移植手術、環境エンリッチメントプロトコル、NORTプロトコル、BTSセットアップ、リアルタイムでの同時モニタリングのためのEEG-BTSカップリング、および自動イベント検出に基づくEEGデータ分析について説明しました。

行動テストは、in vivoコンテキストで生成される大量の情報に対して、神経科学研究において非常に重要です。この点で、研究者は、感覚運動機能、社会的相互作用、不安様および抑うつ様行動、物質依存およびさまざまな形態の認知機能を分析するために、さまざまな行動テストを広く使用してきました¹。行動テストの手動記録は、ほとんどの専門家のオブザーバーにとってさえ、困難で、疲れ果て、不正確である可能性があります。行動登録のためのフリーでオープンソースのソフトウェア(例えば、性行動のためのsexrat male²アプリ)を開発するためにいくつかの努力がなされているが、いくつかの選択肢は魚³からげっ歯類^4,5,6までの異なる動物種の自動的かつリアルタイムの行動記録を可能にする。ビデオトラッキングは、さまざまなアプリケーションで使用される迅速かつ正確な行動記録のための貴重な方法です⁷。行動記録領域におけるより潜在的な特徴は、行動発現中の神経活動を探索することである。ニューロン活動(単一細胞から主要な脳領域まで)と行動課題を同時に記録することで、脳が特定の行動パターンをどのように生成するかを示すことができます⁸。行動は、神経活動と運動または行動との間の相関を明らかにする可能性のある一連のマイナーコンポーネントです。ニューロンの活動と行動パターンを複数のタイムスケールで同時に記録できれば、各脳の状態がそれぞれの特定の行動とどのように相関しているかを説明できます(行動記録のより詳細な調査については、Datta et al.、2019^{レビュー8}を参照)。したがって、望ましいスケール(ニューロンから脳の広い領域まで)での行動活動とニューロン活動の同期記録は、非常に有用なツールと見なされます。行動記録を神経活動として他の測定値と統合することを目的としたいくつかのシステムがあります^4,5。

脳波記録は、臨床および研究神経科学の分野で最も広く使用されている技術の1つと考えられていますが、比較的高い可動性とEEG記録装置のサイズにより、この技術はin vivoモデルの場合の検出に独特で困難です⁹。この問題に対するいくつかの解決策が開発されている、例えば、動物がアリーナ内を自由に動くことを可能にするケーブルおよび旋回装置の使用。それにもかかわらず、ケーブルベースのシステムは、例えば、あるケージから別のケージへの動物の移動中に、動物とケーブルとの妨害または絡み合いが観察されるなど、研究を実施するためにしばしば問題を課す。遠隔測定装置は、記録状況の柔軟性を高めるために無線電気生理学的記録のために開発されている^10、11。ただし、このようなシステムは、記録チャネル数が少なく、サンプリングレートが低いため、かなりの制限があります¹¹。本研究では、自由に動くげっ歯類システム¹²とのWi−Fi接続を介して動物からのEEG信号を送信する市販の無線システムを用いた。装置の重量は6グラムで、1kSpsで記録された最大16チャンネルまで対応します。このシステムは、動物環境でのEEGまたはスパイクの記録を可能にし、外乱を低減し、市場に出回っている従来の電気生理学的システムと比較して経済的なソリューションとして機能します。さらに、ビデオ追跡ソフトウェアを使用してこのデータを同期し、EEGと行動パターンの相関関係を提供しました。この同期は、両方のシステムによって生成されたタイムスタンプに基づいてデータとイベントのアライメントと補間によってオフラインで行われ、MATLAB で処理されます。

成体神経新生は、動物の歯状回において新たに生成された細胞のニューロンにおける増殖、生存、および分化として定義される^13,14。このプロセスは、豊かな環境(EE)条件を通じてげっ歯類の成体神経新生を増加させる記憶および学習の改善に関連していることが知られています¹⁵。EEは、おもちゃやチューブを備えた大きなケージ内に小グループでげっ歯類を収容することで構成されており、動物は新規で複雑ですが、生物学的関連性はありません¹⁵。EEは海馬の神経新生を刺激しますが、年齢、動物の系統、特定の刺激条件、または神経新生検出手順などの多くの要因でも異なります。EEハウジングに7日間曝露された中年マウスでは、海馬歯状回(DG)に新しい顆粒細胞(GC)が誕生することが報告されています¹⁶。成体ラットにおいて成体神経新生を選択的に除去しようとする研究は、学習された応答において約1〜2週齢の新しい顆粒細胞が必要であることを示唆している¹⁷。GCが成人DGで生まれてから約2〜3週間後に、興奮性シナプス伝達に不可欠な樹状突起棘などのいくつかの特徴的な特徴が現れ始めます¹⁸。Zhaoらは、脊椎成長のピークが最初の3〜4週の間に起こることを示すために定量分析を行った¹⁹。いくつかの電気生理学的in vivo研究は、わずか3週間のEEハウジング条件がDGのシナプス伝達に変化をもたらし、細胞の興奮性を増加させることを示唆しています²⁰。また、BrdU注射後1〜4週間で濃縮環境にさらされると、マウスのDG顆粒層のBrdU/NeuN細胞の密度が有意に増加したことが報告されています²¹。これらの著者らは、新しいニューロンの数の大幅な増加が観察されたため、EE曝露後1〜3週間の間に臨界期間が存在することを示唆しています²¹。ヒトにおける成人海馬神経新生(AHN)の研究は、直接的な証拠がなかったため、物議を醸しています。しかし、最近の報告では、ヒト成人脳におけるAHNの発達段階を説明し、DG内の数千の未熟ニューロンを特定し、それによってヒトの老化中のAHNの重要性を実証しました²²。前述の証拠に基づくと、動物モデルでのAHNの研究はこれまで以上に重要です(AHNのより詳細な調査については、Leal-Galicia et al.、2019^{レビュー15}を参照)。

前述のように、海馬は学習能力と記憶能力の基本的な機能に関連しています。記憶の形成は、符号化(記憶獲得)、統合(記憶記憶)、検索(記憶認識)の3つの異なるプロセスを経ます²³。ヒトにおける認識記憶は、視覚的対比較タスク²⁴を用いて試験される。記憶と健忘症の人間と動物のモデルの基礎は、視覚的にペアの比較タスクが人間で行うように、以前に提示された刺激を認識する能力を評価する行動テスト^です25,26。したがって、げっ歯類が以前に提示された刺激を認識する能力、つまり学習能力と記憶能力を評価するために最もよく使用される行動テストの1つは、自発的な新規物体認識タスク(NORT)^23,27です。NORTプロトコルは、取得試験で10分間、慣れ親しんだアリーナで2つの同一の新規オブジェクトで構成されます。0 28から⁴⁸時間²⁹の間の特定の時間(各プロトコルに従って可変時間)の後、動物は、同じ身近な物体の1つと、1つの新規物体を含む同じアリーナに戻される。おなじみのオブジェクトが記憶されている場合、動物は自発的に小説オブジェクトを探索します²⁶。選好比は、探査パフォーマンスの評価によく使用されます。これは、新規または身近なオブジェクトの探索時間から総オブジェクト探索時間を割ることによって決定されます。NORTには、他の認識メモリテストに比べていくつかの利点があります。最も重要なことは、外部の動機、報酬、または罰を必要としないことです。ストレスの多い状態は発生しません。最後に、オブジェクトを探索する動作を呼び起こすためのトレーニングは必要ありません(NORTのより詳細な調査については、^ref.23を参照してください)。

したがって、成人の海馬神経新生の効果として、複数のデータモダリティの同時記録と学習と記憶の研究におけるそれらの統合は非常に魅力的であり、この分野の研究者に魅力的なソリューションを提供します。本研究では、行動ビデオトラッキング評価(新規物体認識タスク)とワイヤレス脳波記録の同時進行に関わるすべてのプロセスを明らかにする。ここでは、電極製造プロセス、硬膜外(頭蓋スクリュー)電極移植手術、環境エンリッチメントプロトコル(海馬神経新生誘導用)、NORTプロトコル、BTSセットアップ、リアルタイムでの同時モニタリングのためのEEG-BTSカップリング、およびMATLABコンピューティング環境で実行されるEEGおよび行動データ分析についてレビューしました。

すべての手順は、動物福祉と動物の苦痛の禁止に使用される動物の数を減らすために、国立保健機関およびメキシコの地方法によって実施された実験動物の世話と使用のためのガイド(NIH出版物N°.8023、1978年に改訂)に従います。イベロアメリカーナ大学の倫理委員会は、この研究における動物の使用に関する実験プロトコルを承認しました。

1. 一般設定

1. 製造手順に従って、行動追跡ソフトウェアをコンピューターにインストールします。
2. カメラを下向きになるように、デバイスの真上に取り付けます。カメラがコンピューターに接続されている必要があります。
3. カメラに必要なドライバのソフトウェアをインストールします(製造手順に従ってください)。
4. カメラにズームレンズが含まれている場合は、カメラのディスプレイに完全に収まるように調整します。
5. 製造ソフトウェアに従ってカメラのオートフォーカス(AF)モードをオフにします。
6. カメラがリアルタイムで正しく機能していることを確認し、使用する準備ができるまでビデオキャプチャモードをテストします。

2.環境エンリッチメントプロトコル(図1を参照)

注:この実験には生後3か月の雄のWistarラットを使用し、自然な暗光条件下で維持しました。

1. おがくずの寝具を透明なアクリルの正方形のアリーナ(500 x 500 x 500 mm)に置きます。
2. げっ歯類が相互作用するために、アリーナに3種類のおもちゃを置きます(例:アクティビティホイール、ダブルデッキ、階段など)。
3. 4つの2インチと4つの湾曲した灰色の不透明なPVCチューブを追加します。
4. 食品およびウォーターディスペンサーに動物への 自由 アクセスを提供します。
5. 通常の条件下で、ケージごとに3匹のげっ歯類をビバリウムルームに入れます。
6. 対応するプロトコルに従って必要な時間、動物をこのアリーナに残します。この実験では、動物はアリーナ内に20日間滞在する必要があります。
   注:電極移植手術後、動物は環境濃縮治療に戻りません。代わりに、新しい物体認識テストが完了するまで、単一のケージに入れられました。

3. 電極製造工程

1. 銅線を約2cmで切り、サンドペーパーを使用して両端から約0.5cmこすります。
2. 銅線の一方の端を小型ネジ(電極)の頭に転がし、これは重要なステップであるため、しっかりと固定されていることを確認します。EEG信号のアーチファクトを回避するために、両方の材料間の正しい接触を保証する必要があります。
3. もう一方の端をコネクタの端子先端に挿入し、細かい鉗子を使用して補強して適切に固定されていることを確認します。このチップはアンプケーブルで接続する必要があります。
4. マルチメーターを使用して、先端からネジまでの適切な導電率を測定します。このプロセスにより、電極接続が正しく取り付けられていることが保証されます。

4.硬膜外(頭蓋骨スクリュー)電極移植手術

注:20日間の環境濃縮処理の後、動物は以下に説明する手順に従って手術を受けます。

1. ケタミン/キシラジン(90/10 mg / kg、i.p.)のカクテルを動物に注射します。.
   注意: 気道閉塞を避けるために、ラットの動きが止まるまで待ってから、ハウジングケージから取り出して動物を平らな面に置きます。先制鎮痛として、非ステロイド性抗炎症薬(メロキシカム1 mg / kg、s.c.)と抗生物質(エンロフロキサシン2.5 mg / kg、p.o.)を注射します。.
2. ラットが完全に麻酔をかけられたら、ラットの頭の部分を剃ります。
   注:手術を続ける前に、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認してください。片方の足または尾を慎重につまみます。動物が刺激に反応した場合は、さらに数分待ってからもう一度つまんでください。動物がピンチに反応しない場合は、次のステップに進みます。必要な機器が利用可能な場合は、安全性のために滴定が容易なため、ガス麻酔(イソフルランなど)の使用を強くお勧めします。
3. 最初に両耳をイヤーバーで固定して、動物を定位固定装置に置きます(動物の内耳を傷つけないように注意してください)。最後に、前歯をバイトバーの上に置き、ノーズバーを固定します。
   注:この手順で使用される麻酔は通常、低体温症と呼吸の問題を引き起こすため、すべての手術に動物に加熱パッドを提供します。
4. クロルヘキシジンまたはヨウ素ベースのスクラブを3回交互に使用して、生理食塩水またはアルコールをすすぎ、ヘッド領域の上部を清掃します。
5. リドカインを頭の皮膚下(0.5 mL)の皮下に皮下(20 mg / mL)投与します。.
6. 各動物の目に点眼液または生理食塩水を5〜10分ごとに滴下して、乾かないようにします。
7. メスを使用して、頭蓋骨の上部を適切に露出させるために、前方から後方向に約2 cmの切開を行います。
8. ブルドッグクランプを使用して皮膚を引っ込め、頭蓋骨の上にある組織をこすります。
9. 取得したブレグマ座標を特定して記録します。
10. ブレグマから始めて、脳定位固定装置パキシノスとワトソンアトラス³⁰を使用して、電極が固定される7つのポイント(座標)のそれぞれの位置を見つけてマークします。
    注:この実験では、F3、F4ネジ(ブレグマから+ 2.0 mm、正中線から横方向2.25 mm)です。C3、C4ネジ(ブレグマから-3.0mm、正中線から2.75mmの側面);P3、P4ネジ(ブレグマから-7.0 mm、正中線から2.75 mm)が取り付けられました。7番目のネジは、地面の基準として、鼻骨(NZ)の後方に配置されました( 図2を参照)。
11. 可変速ドリルツールを使用して、各マークに先端サイズ2(長さ44.5 mm)の穴を開け、頭蓋骨を完全に貫通しないように注意してください。
12. 電極を穴に挿入し、頭蓋骨に慎重にねじ込みます。
13. 7 本のネジがすべて適切に固定されるまで、手順 4.10 と 4.11 を繰り返します。
14. 7本のネジすべてを歯科用セメントの最初の層で固定します。各電極をコネクタに挿入します。ワイヤーを歯科用セメントの2番目の層(動物がネジを引っ張るのを防ぎます)とコネクタの底で完全に覆います。必要に応じて、歯科用セメントの3番目の層で覆い、EEGデバイスを適切に接続できるようにEEGコネクタを清潔なままにします( 図3を参照)。
    注意: 両側ネジの各ペアを配置した後、これらは歯科用セメントで固定できます(オプションの手順)。
15. ラットを術後ケアに一晩放置します。この手順で使用される麻酔は通常低体温症と呼吸障害を引き起こすため、動物を観察し、手術後1〜2時間動物に加熱パッドを提供します。
16. 脱水を防ぐために、50mL / kg / 24時間(維持用量)の生理食塩水を皮下投与します。.非ステロイド性抗炎症薬(メロキシカム2 mg / kg、s.c.)と抗生物質(エンロフロキサシン5 mg / kg、p.o.)を手術後および次の24時間注射します。.
17. 手術後、行動試験を実施する前に、ラットを7日間完全に回復させるために単一のケージに入れてください。
18. 将来の操作におけるストレスを軽減するために、定期的に(少なくとも1日1回)動物を穏やかに操作します。片手でラットを持ちながら、指の圧力を動物の背中にそっと加え、毛皮を通して指を滑らせます。手術後1週間、頭部の傷、健康状態、行動全般、体重を確認します。
    注意: 動物に病気/ストレスの異常や兆候が見つかった場合は、担当の獣医に通知してください。この期間の後、新規物体認識テストとEEG記録技術を実行します。

5. 新規物体認識テスト(NORT)

注:手術の7日後に、行動テストに進みます。全ての行動手順は、提示された実験において、ラットの光サイクルに対応する14時間00分と16時間00分の間に行われた。

1. 柔らかい布で作られたベスト(行動テスト中にEEGデバイスが配置される)をラットに置きます。行動テストを実施する前に、2〜3日間慣れさせてください。
2. 黒いアクリルの正方形のアリーナ(500 x 500 x 500 mm)を薄暗い照明の録音室に置きます。
3. 両面テープを使用して、2つの同一の斬新なオブジェクトをアリーナの床の中央に固定します(動物による移動を防ぐため)。オブジェクトは互いに等距離にあり、アリーナの壁から等距離にある必要があります。
4. 事前に50%エタノールで各オブジェクトを完全に洗浄し、各試行後にアリーナの床を洗浄します(嗅覚の手がかりを避けるため)。
   注:各セッションを開始する少なくとも30分前には、必ず動物を飼育室(ビバリウム室から実験室)に移してください。記録セッションが完了したら、動物をさらに1時間実験室に置いておきます。これは、このテストのパフォーマンスに影響を与える可能性のあるストレスを回避するためです。
5. 各テストを開始する前に、EEGデバイスを接続します。動物をそっと拘束し、動物の背中に取り付けられたEEGキットを使用して、ケーブルを動物の頭のコネクタにしっかりと挿入します( 図4を参照)。許可されるポジションは 1 つだけです。
   注意: 動物の穏やかな以前の操作は、接続手順中の動物のストレスを軽減するのに役立つ可能性があります。そうしないと、デバイスや動物が損傷するリスクが高まります。USBポートを使用してデバイスのバッテリーを完全にプリ充電します。
6. 新しい物体認識テストフェーズ
   1. 慣れ:5分間隔で2日間連続して動物を扱い、その直後に動物をアリーナ(物なし)に置き、10分間自由に探索できるようにします。
      注:獲得および記憶テストセッションを実行する前に、ラットを注意深く取り扱い、対応するEEGデバイスに接続し、テストを開始する前に適切に固定しました。
   2. 取得セッション:オブジェクトとは反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします。手順 6.13 に進み、行動追跡ソフトウェアを使用したテスト記録を行います。
      注意: EEGデバイスがラットの背中に取り付けられたベストを適切に保持していることを確認してください(動物を適切に追跡するため)。追加の補強には、マスキングテープを使用してください。
   3. 短期記憶テスト(SMT):オブジェクトの1つを、形状、色、テクスチャがまったく異なる他のオブジェクトに置き換えます。取得セッションの2時間後に、オブジェクトの反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします。手順 6.13 に進み、行動追跡ソフトウェアを使用してテスト記録を行います。
   4. 長期記憶テスト(LMT):使用したオブジェクトを、短期記憶テストとはまったく異なる形状、色、質感のオブジェクトに置き換えます。取得セッションの24時間後、オブジェクトの反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします 行動追跡ソフトウェアを使用したテスト記録については、手順6.13に進みます。

6.行動追跡ソフトウェアのセットアップ

1. 行動追跡ソフトウェアを開きます。
2. インスティテューションのユーザとパスワードを使用してアカウントにログインします。
3. [新しい空の実験] をタップし、プロトコルの名前 (例: "NORT") を選択します。
4. 「ビデオトラッキングモード」を選択します。
   注:この実験では、カメラはビデオトラッキングをライブでストリーミングするように設定されています。ただし、事前に録画されたビデオを選択するための追加のオプションがあります。
5. 「装置」に移動します。オレンジ色の長方形を投影されたアリーナの境界に合わせて調整して、アリーナ領域を定義します。画面上のカメラから投影されたアリーナ内のオブジェクトの境界にオレンジ色の円を合わせ、オブジェクトの領域を決定します。
6. スケール移動定規線を画像の既知の長さに沿った位置(アリーナ)に設定します。[設定]パネルの[定規線の長さは]オプションにオブジェクトの長さをミリメートル単位で入力します。この場合、アリーナのサイズは500 x 500 mmです。
7. 「トラッキングと行動」に移動します。「ゾーン」に進みます。「アイテムの追加」メニューをクリックし、「新しいゾーン」を選択します。アリーナエリアを選択し、新しいゾーンに名前を付けます(例:「フィールド」)。
8. オブジェクトの領域で前の手順を繰り返し、新しいゾーンに名前を付けます(例:「オブジェクト」)。
9. 「動物の色」に移動し、「動物は装置の背景よりも明るい」オプションを選択します。
   注:この実験には白色(ウィスター)ラットを使用しました。ただし、このソフトウェアには、黒ネズミや斑点のあるネズミを使用する研究者向けの追加オプションがあります。両方の種類の動物を同じ実験に使用することができる。
10. 「動物の頭と尾を追跡する」に移動し、「はい、動物の頭と尾を追跡します」を選択します。
11. 「テスト中」へ |「ステージ」をクリックし、メニューから「アイテムを追加」から「新規ステージ」を選択します。新しいステージに「取得」という名前を付けます。ステージの期間を定義します(例:600秒)。
12. 「短期記憶テスト」と「長期記憶テスト」の段階の前のステップを繰り返します。
    注:このプロトコルでは、すべてのステージの持続時間(10分)が同じです。
13. 「手順」に進みます。各ステージ (獲得、短期記憶テスト、長期記憶テスト) で追跡するイベントを定義します。
14. (各動物で)テストを開始します。上部のメニューバーの[テスト]に移動し、[テストの追加(+)]を選択します。検査する動物に番号を割り当てます(例:「1」)。
15. 「記録」を選択し、動物とセッションに名前を付けます(例:「M1 Acq」)。
16. 動物をアリーナに配置する前に、「再生」ボタンを1回クリックします。「開始待ち」というメッセージが表示されます。
17. 動物をアリーナに配置した後、「再生」ボタンをもう一度クリックします。テストは自動的に開始および終了します。
18. 短期記憶テスト(取得セッションの2時間後)と長期記憶テスト(取得セッションの24時間後)について、手順6.13〜6.16を繰り返します。

7.ワイヤレス電気生理学デバイスのセットアップ

1. モデムをPCホストに接続し、電源を入れます。PC上の他のネットワークデバイスの電源を切ります。できれば、Bluetooth、携帯電話、他のモデム、さらにはワイヤレスハンドセットなど、登録室での他のワイヤレス通信を無音にします。
2. ステップ5.5で述べたように、アンプをラットの背中に取り付けます。
3. バッテリーを接続してEEGデバイスの電源を入れます。
   注意: デバイスを接続してから2秒後、EEGアンプの赤いLEDが点滅し、モデムとの通信がアクティブであることを示し、緑色のLEDが点灯します。通信が成功すると、モデムのLEDが継続的に点滅し始めます。これで、アンプはモデムに情報を送信する準備が整いました。
4. EEGソフトウェアを起動し、製造元の指示に従ってセットアップして、ワイヤレスEEG取得デバイスに統合します
5. 「表示開始」ボタンを押します。EEGソフトウェアは、実際の信号取得を表示します。
   注意: 「Windowsタスクマネージャー」を使用して「リアルタイム」優先モードを割り当て、実験中に情報が欠落しないようにします。

8.脳波(EEG)信号記録

1. EEGソフトウェアがデータを取得していることを確認した後、行動追跡ソフトウェアを起動し、実験プロトコルを設定して、動物が観察ゾーンにあり、セットアップが正しく機能していることを確認します。
2. この時点で、「記録開始」ボタンを押してEEGソフトウェア記録を開始します。取得信号が動作していることを確認したら、BTSで実験を開始します。
3. 実験が終了したら、EEGソフトウェアに戻り、記録プロセスを停止します。録音は、次の形式を使用して記録された日付で構成される既定の名前を使用して保存されます: "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx"。デフォルトでは、すべての記録はEEGソフトウェア(NeurophysData)フォルダに保存されます。
4. 両方のデータ ファイルが作成されたことを確認します。混乱を避けるために、実験ログを記録するか、名前を変更してください。

9.行動課題と脳波信号の同期

1. MATLAB を開き、次のコマンドを実行します。 convert_plx2mat.このような関数はブラウザボックスを開きます。変換関数は製造元によって提供されており、MATLAB のパスに追加する必要があります。
2. 変換する* .plxを選択し、MATLABのコマンドラインで「Enter」を押してデフォルトのパラメータに変換します。
3. BTS実験ファイルを開き、「プロトコル」に移動します。[結果、レポート、およびデータ]オプションをクリックして、両方のオブジェクトのすべてのイベントを選択し、[レポートの時間形式を選択]をクリックして、3番目のオプションを選択します:「イベント時刻をHH:MM:SS.sssでリアルタイムとして表示する-たとえば、13:20:14.791。」
4. 次に、[ファイル]に移動し、[エクスポート]と[実験をXMLとしてエクスポート]をクリックし、[テストの日付と時刻]をオンにして、最後に[XMLの作成]をクリックします。
5. 「テストデータのエクスポート」に移動し、「データの保存」をクリックします。イベント時間を含む.csvファイルが作成されます。
6. ファイルごとに手順 9.1 から 9.5 を繰り返します。私たちの場合、3つの実験はACQ、STM、およびLTMでした。
7. EEGファイルとビヘイビアファイルが変換されたら、それらを1つのフォルダーに収集します。フォルダーには、それぞれ 6 つのファイル、3 つの .mat ファイル、および 3 つの.csvが必要です。私たちの場合、ファイルはPID_01_ACQ_N.mat、PID_02_STM_N.mat、PID_03_LTM_N.mat、PID_01_ACQ_M.csv、PID_02_STM_M.csv、PID_03_LTM_M.csvと呼ばれていました。 IDは動物の識別番号を指します。
8. MATLABを使用して「procesa_sujeto.m」関数を開き、2行目を動物のIDに調整します。
9. 次に、MATLABをそのようなフォルダに移動し、「procesa_sujeto」を実行して、ACQ、STM、およびLTMステージでのオブジェクト認識に関連するアルファおよびベータ相対バンド対パワーの図を作成します。
   注:「procesa_sujeto」は、いくつかの信号処理解析を実行/実行する関数です。これらの分析は、ステップ9.10から9.15に次のように要約されます。
10. 位相補正を使用して、[5-40] Hzの4次バターワースバンドパスフィルターで各EEG信号をフィルタリングします。
11. 以下の分析の前に信号を目視検査し、動物の動きによる欠陥電極の配置または調整ミスに由来するアーチファクトを有するチャネルは、さらなる分析から除外された。
12. 信号を共通平均に参照して、モーションアーチファクトを軽減します。
13. 脳波信号をセグメント化して、BTSから派生したタイムスタンプによって同期された4秒の長さのエポックを形成します。対象となるイベントは、動物と物体の境界までの距離によってマークされた物体の探査でした。これらのイベントはBTSタイムスタンプでマークされ、識別子がウィンドウの位置を修正するために使用されました。したがって、EEGエポックは、探査が始まる1秒前から3秒後までで区切られます。現時点では、探査長に関する検証は行われていませんが、今後の研究で検討されます。
14. これらのパラメータを使用して、1秒のウィンドウ長、90%のオーバーラップ、フーリエ変換推定前のハニングウィンドウを使用してウェルチのピリオドグラム法を使用して、これらのエポックのスペクトルパワー密度を推定し、1Hzの分解能を達成しました。
15. ピリオドグラム下の領域を評価することによって各バンドのパワースペクトルを評価し、提示された値は相対エネルギーに対応し、各EEGバンドのエネルギーをエポックの総エネルギーで割ったことを意味します。この手順はまた、EEG信号のアーチファクトによる誤った推定を減らします。

上記の方法は、環境濃縮処理後にEEGとラットの活動を同時に記録するために適用されました。生後3か月のオスのWistarラットは、中期環境濃縮処理プロトコルを20日間受け、NZにある7番目の電極を参照して、前頭部、中央部、頭頂部に対になった6つの頭蓋骨スクリュー電極を固定するように操作されました。動物は自然の暗光条件下で維持され、食物と水に 自由 にアクセスできました。この作業は、同時ライブ録音のためのEEGシステムと行動追跡ソフトウェアの統合を示しています。治療の有効性を比較するふりをするのではなく、機器の利点を例示するだけなので、EEプロトコルの下で治療された動物のみを使用しました。使用された20日間の環境エンリッチメントハウジングプロトコルが成体の神経新生を刺激する証拠として、EE下の動物および標準条件下で飼育された動物からのBrdU陽性細胞数データを提示します私たちの研究室からの未発表データから。生後3ヶ月の雄のWistarラットを使用した。それらは、互いに12時間の間にBrdUを3回注射した。動物を麻酔し(ペントバルビタール(50 mg / kg、i.p.)、経心灌流によって安楽死させました( 図5を参照)。EEGデバイスに取り付けられたベストが動物の動きを制限しないことを確認するために、オープンフィールドテスト(OFT)を2つのグループに分けて実行し、1つのグループは機器(ベストとEEGアンプ)を着用した状態で手術を受け、もう1つのグループはハードウェアを着用せずに無傷のままでした。10分間の試験では、動物の移動距離に有意差は見られませんでした( 図5を参照)。一般的な NORT プロトコルは、2 つのオブジェクトの表示と、そのうちの 1 つのオブジェクトを新しいオブジェクトに置き換えることで構成されます。行動追跡ソフトウェアは探索時間を監視しました。

行動追跡ソフトウェアは、動物のグループを記録して、主要なパフォーマンスパラメータを評価しました。そこで、3つのパラメータを用いて探査性能を評価した。選好比は、動物の頭が各オブジェクトで費やした合計時間を報告するオブジェクトゾーンで費やされた動物の頭の時間を使用して計算されました。また、オブジェクトに向かって移動するのに費やされた時間の選好比を計算し、各オブジェクトゾーンに向かって移動していたすべての動物に費やされた合計時間を示します。さらに、各オブジェクトへの訪問あたりの費やされた時間が計算されました。 図6 は、上記の3つのパラメータの結果を示しています。獲得試行では、3つの評価パラメータ(3つの試行ではオブジェクトゾーンでのヘッドタイム、3つの試行ではオブジェクトに向かって移動する時間、および各オブジェクトの訪問あたりの時間)のオブジェクト間に区別はありませんでした。STM試験に差はなかった。一方、LTM試験では、新規天体に対して有意に高い探査優先比が見られた。さらに、LTMトライアルでは、訪問ごとに費やされた時間(パネルC)における新規オブジェクトの好みも見られました。動画 1 は実験で記録したラットの代表例を、 動画2 は脳波と行動の同時記録の代表例です。

行動追跡とコンピューターの時計を使用したEEGソフトウェア記録で追跡された時間イベントを照合することができました。図 7 と 図8 は、アルファバンドとベータバンドに対するEEG相対パワーの変化を示しています。これらは運動制御、集中力、記憶に関係しており、探索はこれらの機能に関連しているだけであることを示唆しています。動物3の結果は、ACQとLTMに関してSTMでアルファパワーが低下する傾向があることを示しており、探索または記憶検索に関連する非同期を示唆しています。物体認識数(処理エポック)が少なかった。この時点では、統計的検定がそのような差が本物であるかどうか、またはアーティファクトがそのような実験条件を生成することができたかどうかを検証できるかどうかを判断することはできません。それにもかかわらず、エポックセグメンテーション、ラベリング、および分析は、動物の同時マーキングイベントと将来の研究プロジェクトのために生成されたEEG結果のタイムラインによって可能になりました。これらのシステムを組み合わせることで、動物実験目的で大きな問題となっている手動マーキングプロセスによるイベントの不正識別を防止します。BTSと電気生理学的(EP)活性の組み合わせは、動物の行動と正確に関連している可能性があります。それにもかかわらず、実験条件では、モーションアーチファクトを排除し、実験セットアップを効果的に改善するために、高度な信号処理技術を使用する必要があります。

図1:濃縮環境(EE)条件ケージの例。 住居にはおもちゃやチューブが提供され、動物は斬新で複雑であるが生物学的関連性は見られなかった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ラット頭蓋骨の硬膜外電極の位置。 ネジは、ヘッドセットのアンカーと電極として同時に使用されました。F =正面;C =前頭頭頂;P =頭頂;3 = 左;4 = 右;NZ = 地表参照として。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:硬膜外(頭蓋螺子)電極移植手術の代表的な画像。 手術の異なる段階でラットに埋め込まれた頭蓋内電極スクリューを示す画像。この手順を実行するときは、無菌技術に従っていることを確認してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ラットの代表的な画像と実験セットアップ。 ラットは、NORTプロトコルに使用されるアリーナ内で、バッテリーが埋め込まれたEEGデバイスに取り付けられたベストを着用するように作られました。画像は、ヘッドセットとヘッドラットに取り付けられたケーブルコネクタを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:EEプロトコルによる運動能力、および成体の神経新生刺激の証拠。 (A)オープンフィールドテスト(OFT)での10分間の動物活動の代表的な画像と、機器/手術を着用した動物、および機器を着用していない動物/手術を受けていない動物の平均距離。(B-E)EEおよび標準ハウジンググループ用のBrdU標識細胞(濃い暗色)を用いた代表的なDGセクション。パネルBおよびDはDGの低倍率を示し、パネルCおよびEは高倍率でのボックス領域を示す。パネルBおよびCはEEハウジンググループからの組織であり、パネルDおよびEは標準ハウジンググループからの組織である。挿入図は、両方のグループの標識された細胞の平均数を示しています。ML - 分子層。GCL – 顆粒細胞層;SGZ – 亜粒状ゾーン;矢印 - BrdU+ セル。グラフはSEM±平均値を示しています。グループを比較するためにT-studentテストを使用しました。* p≤0.05。オープンフィールドテストでは、グループ間で有意差は見られませんでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:NORT評価における探査性能。 (A)3回の試行のオブジェクトゾーンでのヘッドタイム。(B)3つの試行のためにオブジェクトに向かって移動する時間。(C)各オブジェクトの訪問あたりの時間。グラフはSEM±平均値を示しています。 Sidakの多重比較検定による二元配置反復測定ANOVAがすべてのパラメータで使用されました。* p≤0.05, ** p≤0.01 それぞれの試行内のオブジェクト間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:探査に伴うアルファEEGバンドパワーの変化。 この図は、動物が物体の探査を開始した後の30秒から2.5までの相対アルファパワーの変化を示しています。6つのグラフは、前頭電極、中央電極、頭頂電極(上から下)および左側と右側に対応していました。箱ひげ図は、オブジェクトの条件の組み合わせごとに「使い慣れた」と「新規」、およびステージ(「ACQ」、「STM」、「LTM」)の時系列の分布を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:探査に関連するベータEEGバンドパワーの変化。 この図は、動物が物体の探査を開始した後の半秒から2.5までの相対ベータパワーの変化を示しています。6つのグラフは、前頭電極、中央電極、頭頂電極(上から下)および左側と右側に対応していました。箱ひげ図は、オブジェクトの条件の組み合わせごとに「使い慣れた」と「新規」、およびステージ(「ACQ」、「STM」、「LTM」)の時系列の分布を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

動画1:実験で記録したラットを示す代表的な動画。ラットはNORTプロトコルに使用されるアリーナ内にいました。ラットは、バッテリーが埋め込まれたEEGデバイスに取り付けられたベストを着用していました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:脳波と行動の同時記録を示す代表的なビデオ。脳波信号は左側に表示され、行動テスト(NORT)はビデオの右側に表示されました。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

行動および脳波検査の研究は、本質的に困難で挑戦的です。したがって、両方の手法の組み合わせは、重要な重要なステップを提示します。したがって、両方の同時実行手法は広く使用されていません。実際には、世界中のすべてのグループが、動物、分析されたパラメーター、または治療などの特別な条件で行動テストを実行します。上記は、この分野で重大な論争を引き起こし、誰もが利用できる標準的な手順を開発する必要性を生み出します。ここでは、公開された記事のほとんどで通常説明または言及されていないすべての重要な手順と方法論的考慮事項を使用して、この詳細な手順を準備しました。これらについては、以下で説明します。

必要な材料の製造は、この技術の成功の基本的なステップです。この点で、電極はステンレス鋼のネジ、銅ケーブル、および銀溶接機を使用してゼロから構築する必要があります。これらの材料は、使用前に各電極の導電率と強度を検証する必要があるため、恒久的に溶接することは困難です。電極アセンブリに別のタイプのワイヤを使用することが可能である。ただし、銅は電極を操作してアンプコネクタに挿入するのに十分な柔軟性があります。これに関して、市販の電極の使用が望ましいが、それらの取得は複雑で高価であり得る。手術は、このプロトコルで最も重要なステップの1つです。特に電極の埋め込みには、経験豊富な外科医がいることが強く推奨され、必要でさえあります。手術では麻酔時間を長くし、時には手術中に溶接を施す必要があることが多いため、各検査室は、特にビバリウム条件、同腹仔間の違い、さらには動物間の個人差の下で、げっ歯類の系統ごとに適切な麻酔(異なるカクテルを使用できます)で必要なテストを実行する必要があります。適切な計画と検討により、手術中に動物を失うことを防ぐことができます。電極の埋め込みも重要なステップです。頭蓋骨を殴ったり、髄膜や脳組織を損傷したりしないように、細心の注意が必要です。ネジは正しく配置する必要があります、つまり、頭蓋骨に完全に固定しないと、EEG記録を使用しないお粗末なコロケーションや動きに関連するものなど、ノイズやアーティファクトが信号に表示されます。げっ歯類の苦しみを避けるために、術前および術後の治療と状態を常に実行し、観察する必要があります。皮下リドカインは、メスで切開する前に頭の皮膚に使用できます。動物の目に生理食塩水を滴下すると、乾燥を防ぐのに役立ちます。また、生理食塩水を口に投与し、手術後に1mLを皮下または腹腔内に投与して、動物の体液バランスを補い、脱水症を防ぐ必要があります。手術直後に、抗炎症薬(痛みを軽減するため)、および皮下または局所抗生物質による抗生物質を、歯科用セメントキャップが配置されている頭皮の周辺に直接投与する必要があります(感染の可能性を減らすため)。手術の24時間後に上記の手順を繰り返します。動物の背中にEEGアンプを配置することは、同時記録の主な困難です。ベストのデザインと製造は、特に動物のサイズに基づいています。ベストはげっ歯類の自然な動きを許さなければなりません( 図5を参照)。この後者は、自由な動きの記録である技術の主な利点を保証します。動物は手術後およびその後の数日間、ベスト、ヘッドコネクタ、またはケーブルを取り外そうとしなかったため、セットアップは運動制限を有意に発生させたり、痛みや不快感を引き起こしたりしなかったと推定されました。BTSによってマークされたイベントに基づくエポックでの正しいEEGセグメンテーションのためには、明確に定義されたプロトコルを書き留めることが必須です。一時的なマークは、両方のシステムが同じクロックを使用してタイムスタンプを設定するため、時系列操作によってマージできます。以上により、解析のための電気生理学的データを組み込んだ動物実験の可能性が広がります。

ここで紹介する手法は、あらゆる神経科学研究分野で使用でき、最も一般的なマウス種、さらには他の種でも使用できます。行動追跡ソフトウェアの汎用性は、モリス水迷路、オープンフィールド、斬新な物体認識、条件付き場所の好み、ホールボード、高架プラス迷路、Y迷路、ラジアルアーム迷路、バーンズ迷路などの迷路の非常に多様性で使用できるため、最も重要な利点の1つです。最大16台のカメラを同時に使用できます。さらに、何百もの異なる対策(より詳細な情報については、マニュアル^31,32を参照)を報告することができます。この作業はEEG記録の実験を説明しており、局所場ポテンシャルや単一ユニット記録などの他の手法が可能であると考えてください。ただし、ユーザーは、一般的なセットアップといくつかの準備手順を他の目的のために変更する必要があることを考慮する必要があります。したがって、この手法をEEG Wi-Fi記録と一緒に使用すると、接続性、EEGバンドパワー、誘発応答など、EEG統合とダイナミクスのいくつかの特性を評価するために人間に対して行われるような動物実験に新しい視点が追加されるため、可能性が広がります。人間とは異なり、動物実験は、他の多くの実験パラダイムの中でも、薬物投与、遺伝子改変、または発現を評価することが可能です。EEG分析では、一部のプロトコルでは、望ましい動作の繰り返し回数が非常に少なく、応答を平均化して信頼できる結果を得る可能性が抑制されていることを考慮してください。したがって、実験を開始する前に、実行すると考えられる記録および分析プロトコルを設計するように注意してください。それにもかかわらず、動物実験での作業は動きを妨げることは不可能であり、実験プロトコルの複雑さを増し、信号分析と行動タスクの考慮事項を増すことを考慮しなければなりません。現在、完全な追跡システムとEEG記録のための機器は標準化またはモジュール化されていないため、それらのセットアップは単一のプロトコルと他の行動タスクを探索するための適応を目的としており、多くのラボに高いコストを示唆/示唆しています。この状況は、この調査で説明されているオプションに従うことで解決できます。それにもかかわらず、より信頼性の高い実験のためにいくつかの改善を実現することができました。この作業は、電極の製造からビヘイビアおよび信号処理までのいくつかのステップで改善できます。それにもかかわらず、動物の追跡とEEGの取得は、手頃な価格のハイテクでありながら安価なセットアップを使用して可能であることが実証されています。

要約すると、本研究は、特に神経科学分野の科学者が、一般的に組み合わせて使用されていないこれら2つの手法を使用できるようにする試みです。行動追跡ソフトウェアを使用したEEGと行動テストの同時記録技術には多くの利点があり、神経科学の多くの分野で、特に学習と記憶の分野で特に役立ちます。この装置が海馬のような皮質下構造の深い記録として他の能力を持っていると考えると、前述のように、いくつかの準備ステップが変更されます。ワイヤレス機器は、あるケージから別のケージへの動物の移動性の問題、ケーブルでの動物の妨害または絡み合いなど、従来のワイヤアプローチのほぼすべての制限を解決します。上記のように、このセットアップ手法はユーザーフレンドリーであり、ほとんど訓練を受けていない、または専門化されていない専門家または個人のグループがこのソフトウェアを使用できます。EEG機器の価格は、通常のEEGアンプよりも低くなっています。行動追跡ソフトウェアは、市場で最も手頃なビデオ追跡ソフトウェアの1つでもあります。このソフトウェアには年間ライセンスが必要です。この装置は、複数の実験セットアップ、さまざまな動物、および汎用性のタイプで使用できます。この取り組みが科学界に役立ち、行動と脳波を同時に研究するための簡単なアクセスを提供することを願っています。

シルビア・オルテガ・マルティネス博士は、この記事の制作とオープンアクセスを提供および後援した会社であるStoelting Co.の従業員として働いています。

技術支援を提供してくれたミゲル・ブルゴス氏とグスタボ・ラーゴ氏に感謝します。ビデオ制作費を負担してくださったStoelting Co.、技術支援を提供してくださったJinga-hi, Inc.、そしてこの作品に資金を提供してくださったメキシコ・イベロアメリカーナ大学の調査委員会に感謝しています。