神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。

健康および疾患におけるマイクロRNA(miRNA)の生物学的関連性は、単一のmiRNAの作用ではなく、多くの同時に規制緩和されたmiRNAの特定の組み合わせに大きく依存する。これらの特定のmiRNAモジュールの特徴付けは療法の使用を最大にする基本的なステップである。組み合わせ属性が実質的に悪用される可能性があるため、これは非常に重要です。ここで説明する、神経膠芽腫における発癌性クロマチン抑制剤の制御に関連する特定のmiRNAシグネチャを定義する方法である。このアプローチは、最初に正常組織と比較して腫瘍で調節解除されるmiRNAの一般的なグループを定義する。分析は、差動培養条件によってさらに洗練され、特定の細胞状態の間に同時に発現されるmiRNAのサブグループを強調する。最後に、これらのフィルタを満たすmiRNAは、自然に存在するmiRNAクラスター遺伝子の足場に基づく人工ポリシストロントランス遺伝子に結合され、これらのmiRNAモジュールを受け取る細胞に過剰発現するために使用されます。

miRNAは、^がん4、5を含む多くの^{疾患1、2、3}に対する広範な遺伝子治療アプローチの開発のための比類のない機会を提供する。これは、これらの生体分子のいくつかのユニークな特徴に基づいており、その小さい^{サイズ6、}単純な生体^{発生7、および関連8}で機能する自然な傾向を含む。多くの疾患は、しばしば複雑な生物学的機能の調節に収束する特定のmiRNA発現パターンによって特徴付け^される9.この方法の目的は、最初に特定の細胞機能に相乗的に関連するmiRNAのグループを識別する戦略を定義することです。その結果、下流の研究および応用におけるこのようなmiRNA組み合わせの再確立のための戦略を提供する。

この方法により、複数のmiRNAの機能解析を一度に行い、多数のmRNAを同時に標的化し、疾患の複雑な景観を再現することができます。このアプローチは、最近、1)脳癌で同時に制御され、2)放射線による無毒性ストレスに応答する神経分化中に強い共発パターンを示す3つのmiRNAのグループを定義するために採用されている。DNAアルキル化剤以下に説明するクラスタリング法による3つのmiRNAのこのモジュールの組み合わせ再発現は、癌細胞の生物学に対する深い干渉をもたらすものであり、前臨床^研究10の遺伝子治療戦略として容易に使用することができる。このプロトコルは、miRNA研究およびその翻訳アプリケーションに関与する人々に特に関心があるかもしれません。

1. 神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付け

1. 神経膠芽腫対脳における広い差分miRNA発現の解析
   1. まず、腫瘍内で最も著しく緩和されたmiRNAを決定する。これは、少なくとも 3 つの異なる方法を使用して実現できます。
      1. https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcgaで見つかったがんゲノムアトラスを採掘し、^データ11をシーケンシングする。
      2. 新鮮な手術^標本12からマイクロアレイ解析を行う。
      3. 以前にパブリッシュされたデータセット^{13 を}使用します。
         注:どちらの方法を選択した場合でも、出力は、発現が腫瘍生物学と統計的に(直接的または逆に)相関するmiRNAのバルクセットを提供します。この初期グループは、以下で説明するように、発現変化のより動的な分析を実行することにより、最も厳格な機能関連を示すmiRNAのサブセットの同定のためにさらに分析されるmiRNAのプールを構成する。
2. 条件特異的miRNA発現解析
   1. 細胞分化の誘導:
      1. 単層培養の形成を支持するために、あらかじめコーティングされたポリD-リジン(PDL)プラスチック皿を使用してください。皿コーティングの場合は、PDLを100μg/mLの濃度で水に溶かします。25 cm²表面あたり 1 mL の溶液を使用します。PDL溶液の塗布後、PBS 6hで2xをすすいで下します。
      2. ヒト神経幹細胞を等量でプレート(100,000細胞/5mL)幹細胞培地(神経ベース培地+B27サプリメント+20ng/mL EGF/FGF)、星球分化媒体(DMEM+10%FBS)、または神経分化培地(神経基性培地+B27)サプリメント, + 2 μM レチノイン酸)¹⁴.オリゴデンドロサイト分化のためのプロトコルは、EGF/FGF^{除去14、15}の後にIGF-1(200 ng/mL)の添加を必要とする。
      3. 細胞めっき後、37°Cで1週間インキュベーターに置き、5%CO2を入れなさい。
   2. RNA抽出:
      1. 7日後、インキュベーターから細胞を取り出し、培地を除去する。
      2. PBS(5 mL)で細胞を洗浄します。次に、1mLのライシス試薬(材料表参照)を加えて細胞をlyseし、細胞スクレーパーを使用して1.5mLのマイクロフュージチューブに細胞を削ります。ライゼルを含むチューブを室温(RT)で5分間保管してください。
      3. 製造元の指示に従って、RNA の完全な分離に進みます。
   3. miRNA発現分析:
      1. リアルタイムPCRによる3つの分化パターンの中でステップ1.1で同定された特定のmiRNAの微分発現を定量化し、TaqManプローブを使用し、リバース転写およびPCR増幅のためのメーカーのプロトコルに従う(図 1)
3. ストレス特有の課題によるmiRNAクラスターの検証
   1. 神経基底培地+B27サプリメント+20 ng/mL EGF/FGFにおける培養G34神経膠芽腫幹細胞様細胞。25 cm²低い付属フラスコで 5 mL の 1 x 10⁶セルから開始します。
   2. めっき後48時間を開始し、次のように5日ごとにDNAアルキル化剤テモゾロミド(TMZ)の二重濃度を追加します。
      1. 5 μM から 5 日間開始します。5日後、培地を取り出し、テモゾロミドを使わずに新鮮な培地に置き換え、生き残った細胞が回復できるようにする。48時間後、10 μM TMZを追加し、さらに5日間インキュベートします。
      2. ステップ1.3.2.1を繰り返し、TMZ濃度を毎回倍増させ、少なくとも100μMの濃度に達し、細胞が^薬物10に対して耐性になるまで。
   3. 並列実験では、次のようにG34細胞を照射します。
      1. 25cm²低アタッチメントフラスコで5mLで1 x 10⁶細胞をめっきした後48時間を開始し、2Gyのエネルギーを有する細胞を照射する(フォトン発光を提供する任意の照射器が許容される)。細胞をインキュベーターに戻し、邪魔をしないでください。48時間後、エネルギーの追加2 Gyで再び細胞を照射する。
      2. 合計 10 Gy のエネルギーが投与されるまで、ステップ 1.3.3.1 4 倍を繰り返します。
      3. 細胞をインキュベーターに戻し、下流分析の前に少なくとも5日間新鮮な培地で回復させます。
   4. 抵抗性誘導後、ライシス試薬を用いて細胞をlyseし、製造元のプロトコルに従って全RNAを抽出する。
   5. ステップ 1.2.1 (図 2)で説明されているように、セクション 1.1-1.2 で識別される特定の miRNA の式を分析します。
4. クラスタ化されたmiRNAの機能収束の特徴付け
   1. miRNAターゲティング予測ツールを用いて得られたセクション1.2-1.3で定義された各miRNAの予測標的を得る。
      注:アルゴリズムは定期的に¹⁶を更新されているので、一般的に TargetScan に頼ります。その他の予測ツールは、miRanda¹⁷、miRDB^18、および DIANA-miRPath¹⁹です。これらのプログラムはすべて無料の Web ベースのアプリケーションです。
      1. Targetscan のフロントページから、事前に設定されたドロップダウン メニューから関心のある miRNA を選択します。[送信]ボタンをクリックします。
      2. [ダウンロード] テーブルリンクを使用して、結果のターゲットの一覧をスプレッドシートとしてダウンロードします (補足図 1)。
      3. 誤検知の可能性を減らすには、下流分析で保存されたサイト列内のターゲットのみを含めます。また、追加のmiRNA予測プログラム(上記参照)を使用し、すべてのアルゴリズムに共通するターゲットのみを含めることによって、さらなるストリンジェンシーを得ることができます。
   2. ToppGene Suite²⁰を使用して遺伝子オントロジーカテゴリに従って得られた標的を分類し、各miRNAに共通する経路の濃縮を評価する。
      1. HGNCシンボルをエントリータイプとして使用して、「トレーニング遺伝子セット」ウィンドウにステップ1.4.1から得られたターゲットのリストを貼り付けます。[送信]をクリックします。プログラムは、入力された遺伝子のリストの最も重要な「囲碁」カテゴリを示す出力テーブルを提供します(補足図2)。
   3. 最終的に共通の経路または細胞プロセス(この場合はクロマチン調節)の調節に対する各miRNAの寄与を確立するために、ステップ1.4.1で得られた各標的を特定の細胞プロセスに関与する遺伝子の完全なリストに対してチェックしてください(すなわち、クロマチン調節)は、バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスウェブサイトに提供されるベン図関数を使用して、http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn。
      注:このプログラムでは、複数のグループを同時に交差することができます (図 3)。各miRNAによって提供される特定のユニークな標的にアニテンを付け、下流の機能実験のために選択されます。
      1. プログラムのフロントページで、各miRNAのターゲットmRNAまたはそれぞれのウィンドウに関心がある場合は、リストをアップロードまたはコピー/貼り付けます。各リストに一意の識別子を付けます。
      2. [送信]をクリックします。プログラムは、各セクターの遺伝子の数を持つベン図の視覚的な出力だけでなく、各サブセットと交差の組み合わせのためのmRNAの完全なリストを提供します。

2. miRNAモジュールをポリシストニックトランスジェニッククラスターに組み込む

1. miR-17-92クラスター遺伝子座に基づくトランスジェニック足場の調製
   1. ensemblゲノム^{ブラウザ21}からmiR-17-92クラスターのヌクレオチド配列を得る。遺伝子座の6つのエンコードされたmiRNAヘアピンと、コア配列の上流(5')と下流(3')の両方の少なくとも200ヌクレオチドフランク配列を包含する〜800塩基対「コア」配列を選択する。
   2. 上記のシーケンスを任意の単語編集プログラムに貼り付けます。
   3. miRBase²²でそれらを取得することにより、6 つのネイティブ ヘアピンの各シーケンスを定義します。これらのシーケンスのそれぞれを、以前に識別した「コア」シーケンスのスパン内にマークします。各ヘアピン間のシーケンスはスペーサー配列を表し、トランスジーンの正しい処理に重要です。
   4. 新しいヘアピンの受け入れ者として機能する各ヘアピンの5'と3'の両端で3-5ヌクレオチドを除いて、「コア」シーケンスからネイティブヘアピンシーケンスを削除します。
2. 複数のmiRNAをコードする新しいトランスジーンの構築
   1. miRBaseからトランスジーンで過剰発現することを意図したmiRNAのヘアピン配列を取得する。マイクロプロセッサ切断の部位である特定のヌクレオチドに注意してください。
   2. 取り外したヘアピン(ステップ2.1.4)を、ステップ2.2.1で得られた目的のmiRNAのヘアピンシーケンスに置き換えます。
   3. トランスジーンの両方の側面領域に所望の制限配列を追加して、選択した送達ベクターへのサブクローニングを容易にする。選択した制限シーケンスがシーケンス自体に存在しないことを確認します。
   4. 陰性対照の場合、20ヌクレオチドスクランブル配列を使用して、各成熟したmiRNAの天然20ヌクレオチド配列を置き換える。https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequenceなどのオンライン ツールを使用して、これらのスクランブル シーケンスを生成します。
3. トランスジーンの2次元構造の検証
   1. RNA構造予測ソフトウェアプログラムRNAwebフォール^ド23に完全なトランスジェニックシーケンスをコピーします。
   2. 標準のプログラム設定を使用して、[続行]をクリックします。
   3. グラフィカル出力を分析し、特に明確に定義されたヘアピンの存在と、マイクロプロセッサ切断部位に近い少なくとも11個のヌクレオチド構造の存在について分析する。また、ヘアピンシーケンス内に分岐点がないかどうかを探します(図4)。

3. DNA合成によるトランスジーンの取得

1. キメラmiRNAクラスターの設計およびシリコ検証後、商業^{ベンダー24}からのDNA合成を用いて作業配列を得て、ベクターおよびトランスジーン送達への下流クローニングを進める。我々は、インビトロ送^達10およびアデノ関連ウイルス(AAV)にレンチウイルスベクターを生体内頭蓋内送^達25に使用した。

この方法は、脳腫瘍において一貫してダウンレギュレーションされている3つのmiRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経分化(図1)の間に特異的に発現され、その後の腫瘍生存応答に関与するセラピー(図2)。これは、複雑な発発性クロマチン抑圧経路を調節することによって達成される。この共発現パターンは、これら3つのmiRNAの間で強い相乗活性を示唆した(図3)。その結果、miRNAの小さなサイズと単純な生体発生を利用して、このプロトコルの第2部は、神経膠芽腫細胞における3つのmiRNAの発現を同時に要約することができるトランスジーン(図4)を設計するために使用された。インビトロとインビボの両方で、腫瘍生物学に重大な干渉を有し、有望な翻訳適用性(図5A、B、C)10.さらに、トランスジェニッククラスターが乳癌モデルにおいても機能的であることを実証した(図5D,E)。

図1:神経膠芽腫における機能的miRNAモジュールの特徴付け(A)TCGAから得られたヒト神経膠芽腫試料(n=516)対正常脳(n=10)における分発性発現miRNAを表す火山プロット。緑色では、>4 倍の差を持つ miRNA があります。赤い円は、神経膠芽腫における10の最も著しくダウンレギュレートされたmiRNAを表す。(B)神経幹細胞における異なる分化経路の誘導中に(A)で選択された10 miRNAの相対発現は、神経分化誘導時のmiR-124、miR-128、およびmiR-137モジュールの明確なアップレギュレーションを示す。3つの生物学的反復からの平均± SD (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001;学生のtテスト、両尾)。この図は、参照¹⁰からの許可を受けて変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:遺伝子毒性ストレス時のmiRNAモジュールの共発現パターンの確認多発性神経膠芽腫細胞および細胞株で図1に定義された3つのmiRNAの相対発現(G62-間葉系;MGG4-陽子;U251、U87プロニューラル様、およびT98G間葉状様神経膠芽腫細胞株)は、テモゾロミド(TMZ、ピンクバー)または電イオン放射(RT、緑色バー)に対する耐性の誘導後である。報告された手段は、2つの独立した反復からのSDを持つ手段である。この図は、参照¹⁰からの許可を受けて変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:共発現miRNAの標的の機能収束の解析バイオインフォマティクスおよび進化ゲノミクスのウェブサイトから出力されるベン図は、同時に、関心のあるGOカテゴリーを構成するmRNA(この場合、クロマチンリプレッサ)とラベル付けされたmiRNAの標的を横断する。単一miRNAによって一意に標的とされたmRNAは、さらなる下流機能研究のために選ばれた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:3つのmiRNAクラスターをコードする工学的miRNA配列の2D構造。RNAweb フォールド プログラムからのグラフィカル出力。トランスジーンによってコードされるそれぞれのmiRNA(miR-124、miR-128、miR-137)のヘアピンを表す3つの明確に定義されたステムループ構造の存在に注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:トランスジーン処理とその下流生物学的効果の証拠(A)トランスジェニックmiRNAクラスター(クラスター3)または陰性対照(ctrl)を有するG34神経膠芽腫細胞のレンチウイルス媒介伝達伝達後のmiRNA発現の相対定量。報告されたのは、陰性対クラスター3トランスジーンを発現するG34神経膠芽腫球の3つの独立した実験±SD.(B)蛍光顕微鏡写真からの手段である。スケールバー = 100 μm.(C)頭蓋内ヒトG34細胞異種移植片の生体内増殖において、対照またはクラスター3トランスジーンのいずれかを発現する。スケールバー = 1 mm。このフィギュアは^許可10で再現されています。(D)トランスジェニックmiRNAクラスター(クラスター3)または陰性対照(ctrl)を有するMDA-MB-231乳癌細胞のレンチウイルス媒介伝達伝達後のmiRNA発現の相対定量。(E)陰性対クラスター3トランスジーンを発現するMDA-MB-231乳癌細胞の蛍光顕微鏡画像。スケールバー = 100 μm。すべての実験は三つ三つ(*p < 0.05; **p < 0.01;学生のt検定、両尾、複数比較)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1: ターゲットスキャン ワークフロー:(A) ホームページのスクリーンショット, miRNA検索の選択オプションを示しています.(B) miR-137 の代表的な検索結果。標的遺伝子のリストは左側の列にあります。赤いボックスは、保存されたターゲティング部位を持つ遺伝子を示します(実際のターゲティングの信頼性が高いことを示唆しています)。この図を見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

補足図 2: ToppGene スイート ワークフロー。(A)分析する遺伝子のリストが挿入される検索ボックスを示すホームページのスクリーンショット。(B)miR-137標的の代表的な検索結果は、最も統計的に有意な遺伝子オントロジー(GO)カテゴリを示す。この図を見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。

このプロトコルは、単独で機能するのではなく、miRNAがグループで働くことによって生物学的に関連するという概念に基づいており、これらのグループは、特定の細胞^{コンテキスト26}によって転写的に決定される。翻訳の観点からこのアプローチを正当化するために、細胞/組織におけるこのマルチmiRNAパターンの再構成を可能にするフォローアッププロトコルが導入される。これは、miRNAの比較的単純な生体発生を利用することにより、マイクロプロセッサによる特徴的なmiRNAヘアピンの認識が必要であり、正しいmiRNA^処理27に十分である。同時に、この最小限の要件により、自然発生するmiRNAクラスターの遺伝的足場を、任意の送達ベクターに適合させることができる短いDNA配列内に含まれる所望のmiRNAモジュールの発現のバックボーンとして使用することができます。選択の。このプロトコルの主な要件は、適切な切断を可能にするために、ヘアピン構造とステム成分の十分な長さを維持することです。

このプロトコルの実行に関しては、2 つの主要な重要な考慮事項があります。第1のポイントは、最適なmiRNA組み合わせの正確な決定です。これは、コントロールと比較して細胞または組織のmiRNA発現シグネチャだけでなく、細胞が実験的に操作される時に観察される任意の同時発現変化の慎重な分析によって決定されます。miRNA のセットが定義されると、各単数形の人工変調が他の人の発現を変更しないことを確認することも重要です。

第2の重要な側面は、この機能的なmiRNAクラスタリングを人工的に要約するキメラ配列の構築に関する。各miRNAヘア^ピン18の起源に十分な長いステム配列(少なくとも11ヌクレオチドを測定する)の存在であるmiRNA加工機械の構造要件に従うことが基本であり、オリジナルのメンテナンスも行います。ネイティブ miRNA クラスター スキャフォールドの間隔シーケンス。我々の経験では、これら2つの要件を満たすことは、一貫して適切なRNA折りたたみ(図4)をもたらし、マルチmiRNA発現に成功しました。

この手法の主な制限は、機能的トランスジーンに一緒にクラスター化できるmiRNAの有限数です。最大6種類のmiRNAを過剰発現する配列の設計に成功しましたが、ヘアピンの数が増えるにつれて処理効率が低下することが分かりました。これまでのところmiR-17-92クラスターの遺伝構造は、最短DNA配列(〜800塩基^対)内で最も多くのヘアピン(6個)をコードする1つであるため、8が用いられてきた。他にも天然miRNAクラスターがあるので、この目的にも利用できると期待^{されています28.}最後に、ヘアピン間の間隔配列の変更は、その処理を減少させるので、ネイティブ構造をどの程度変更できるかに関するいくつかの制約があります。

この提案された方法の最も重要かつ有利な側面は、主にシリコアプローチを使用して複数の所望のmiRNAを同時に過剰発現することができるトランスジーンの工学を可能にし、退屈な必要性を制限し、前述^{の29、30、31}のように、時間のかかる分子クローニングステップ。説明されているプロトコルは実行が簡単で、特殊な機器やスキルを必要としません。

分子生物学におけるmiRNAの重要性と治療用途におけるその可能性を考慮して、このプロトコルは、研究者の多くの聴衆に関心があります。このアプローチは、miRNAの組み合わせ特性に焦点を当て、その実行のためのシンプルで堅牢なツールとして機能する将来の研究を奨励することが期待されます。さらに重要なことに、これらのクラスター化トランスジーンは、遺伝子治療ベクターにとって理想的な貨物を表します。3-miRNAクラスターの生体内送達に成功した証拠は、AAVベクターの直接腫瘍内頭蓋内注射(未発表データ)を介して既に得られている。したがって、この技術はmiRNA研究の翻訳的側面を大きく後押しすると予想される。

著者は利益相反を報告しない。

著者らは、ハーヴェイ・クッシング神経腫瘍学研究所のメンバーに対し、支援と建設的な批判に感謝したいと考えています。この作業は、NINDS助成金K12NS80223およびK08NS101091によってP.Pにサポートされました。