肺癌細胞株における癌幹細胞の放射線感受性

癌幹細胞の存在は、放射線療法後の再発または悪い結果に関連している。本原稿では、肺癌細胞株における癌幹細胞の放射線感受性を調べた方法について述べている。

癌幹細胞(CSC)の存在は、放射線療法後の再発または悪い結果と関連している。放射線抵抗CSCを研究することは、放射線抵抗を克服する手がかりを提供するかもしれません。電圧ゲートカルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5は、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株における放射線耐性CSCのマーカーとして報告されている。CSCマーカーの一例としてカルシウムチャネルα2δ1サブユニットを用いて、NSCLC細胞株におけるCSCの放射感受性を調べた方法が提示される。CSCは、フローサイトメトリーによって置きマーカーでソートされ、選別された細胞の自己再生能力は球体形成アッセイによって評価される。コロニー形成アッセイは、一定量の放射線の後にコロニーを形成する子孫を生成する能力を失う細胞の数を決定し、次いでソートされた細胞の放射感受性を評価するために行われる。この原稿は、CSCの放射感受性を研究するための最初のステップを提供し、基礎となるメカニズムをさらに理解するための基礎を確立する。

放射線療法はがん治療において重要な役割を果たしている。しかし、放射線耐性癌幹細胞(CSC)の存在は、放射線治療^後の再発または不良な結果につながる可能性があります 1,².CSCは、自己再生能力と異発癌細胞3を生成する能力によって特徴付げられる。より効率的なDNA損傷修復能力またはフリーラジカル清掃システムまたは他のメカニズムのより高いレベルを持つ装甲、CSCは放射線療法4、5、6、7に対して比較的耐性がある^,8.CSCマーカーを同定し、そのメカニズムを探索することは、正常な組織損傷を増加させることなく放射線抵抗を克服する薬剤の開発を容易にする。

電圧ゲートカルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5は、NSCLC細胞^株9における放射性CSCのマーカーとして報告されている。α2δ1は、もともと肝細胞癌(HCC)10のCSCマーカーとして同定された。同じ患者の一次腫瘍および再発性腫瘍に由来する一対のHCC細胞株を用いて、1B50-1という抗体を用いて、再発性HCC細胞を特異的に標的とすることを同定した。1B50-1陽性細胞は、インビトロにおける高球形成効率および生体内における高い腫瘍原性を示した。その抗原は質量分析により同定され、カルシウムチャネルα2δ1サブユニットアイソフォーム5として同定された。α2δ1はCSCで特異的に発現し、ほとんどの正常組織では検出不可能であり、CSC¹⁰を標的とする候補として潜在的な候補である。α2δ1はNSCLC細胞株のCSCマーカーとしても機能することができ、^放射線9に応答してDNA損傷修復の効率を高めることにより、NSCLC細胞に対する放射線耐性を部分的に付与することが示されている。

放射線抵抗CSCを研究することは、放射線抵抗を克服する手がかりを提供するかもしれません。NSCLCにおけるα2δ1を例にとり、CSCの放射感受性を調べた主な方法を紹介する。通常、CSCは置き面マーカーで単離され、陽性および陰性の細胞集団の幹細胞特性と放射感受性が比較される。自己再生を支持する成長因子を補う無血清培地中の球体形成は、インビトロの細胞の幹を評価するのに有用なアッセイである。球体形成能力の高い細胞は、免疫不備マウス10、11、12に注射すると高い腫瘍原性^を示す可能性が高い。次いでコロニー形成アッセイは、細胞の放射感受性を評価するために使用され、^放射線13の線量後にコロニーを形成する子孫を生成する能力を失った人の数を決定する。

注:ステップは示された温度の下で行われます。温度が記載されていないステップについては、室温(18〜25°C)の下で行います。細胞培養培地は4°Cで保存し、他の試薬はメーカーのガイドに従って保存する必要があります。培地は、細胞に添加する前に37°Cに予め温める必要があります。

1. セルの並べ替え

1. 抗体結合
   注:インキュベーション時間が短いことを考慮すると、細胞選別には直接標識抗体が好ましい。市販の直接標識抗体がない場合は、フルオレセイン結合試薬を使用して、製造元のガイドに従って抗体を蛍光色素に結合します(材料の表を参照)。細胞はソート後に培養されるので、すべてのステップは、生物学的安全キャビネットまたは層板クリーンベンチで行われるべきである。汚染を避けるために、抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を選別後に培養培地に添加することをお勧めします。
   1. 標識する抗体の10μLごとに修飾剤の1 μLを添加する。穏やかに混ぜます。
   2. 抗体と修飾子の混合物を凍結乾燥フルオレセインに直接加えます。優しくピペ。バイアルは、暗闇の中で室温(RT)で3時間または一晩放置します。
   3. 抗体の10 μLごとに1 μLのクエンチャー試薬を添加します。コンジュゲートは30分後に使用できます。フルオレスチンコンジュゲートは、最大18ヶ月間4°Cで保存することができます。
   4. 選別する前に、共役抗体の滴定が推奨される。マーカーを発現する細胞(例えば、h1299またはa549をα2δ1に対して)および発現しない細胞(例えば、H1975)を調出す。細胞をアリコートし、異なる濃度(例えば、15 μg/mL、7.5 μg/mL、1.5 μg/mL、および0.75 μg/mL)で抗体をインキュベートします。
   5. フローサイトメトリック解析(ヒストグラムまたはドットプロットを用いて)を実行し、H1299またはA549の陽性細胞をアイソタイプコントロールから分離し、H1975細胞が非特異的なシグナルをほとんど持たない濃度を選択します。
2. セルラベリング
   1. RPMI 1640培地における培養A549細胞を、細胞培養インキュベーター中の37°Cおよび5%CO2で10cmの料理で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充した。80%~90%の合流点(1皿あたり約5~10×10⁶細胞)に達した場合のソートに次のようにダイジェスト細胞。
   2. 培養培地を取り外します。リン酸緩衝生理食生理食べ物(PBS)の3 mLで細胞を洗浄します。各料理に0.05%トリプシンの3 mLを追加します。トリプシンを取り出し、1~3分間37°Cで細胞を消化するためにリジダリートリプシンを残します。
      注: NSCLC 細胞株 H520 や PC9 など、一部の細胞株は比較的消化が困難な場合があります。このような状況では、レジダリートリプシンで消化するのではなく、3mLのトリプシンを皿に残すことができます。また、消化時間を延長することができます。
   3. 細胞が緩んで皿から剥離し始めるとき、10%FBSを補充したRPMI 1640培地の3 mLを追加し、50 mLチューブに細胞懸濁液をピペットします。
   4. 4°Cで300 x gで5分間遠心分離機を廃棄します。10 mLのPBSを加えて細胞を再中断します。0.5 mL(または少なくとも5 x 10⁵セル)の細胞懸濁液をアイソタイプコントロールとして新しいチューブに移します。残りのセルは並べ替え用です。
   5. コントロールチューブと実験管の両方を4°Cで300 x gで5分間遠心分離します。
   6. PBS中の蛍光色素共役アイソタイプコントロールまたは抗体を、上述のように活性化した最適な濃度に希釈して染色するための作業液を調製する。
      注:この実験では、FITC結合1B50-1(α2δ1の抗体)を7.5μg/mLに希釈した。作業ソリューションの体積は、セル量に依存します。
   7. 約2-5 x 10⁷細胞/mLで各作業溶液で対照細胞と実験細胞を再中断し、穏やかに混合する。暗闇の中で30-40分間RTでサンプルをインキュベートします。
   8. サンプルに10mLのPBSを加えて細胞を洗浄し、4°Cで300 x gで穏やかに混合し、5分間上清を廃棄する。10 mLのPBSで細胞を再中断する。
   9. 制御および実験細胞のための新しい50 mL管にそれぞれ40 μmの細胞ストレーナーを置く。ストレーナーに細胞懸濁液を塗布し、フロースルーを収集します。
      注:このステップは、細胞ソーターの毛細血管をブロックする可能性のある細胞塊を除去します。
   10. 4°Cで300 x gで5分間流れを遠心分離し、上清を捨てます。0.2~1.0 mL PBSで細胞を再中断し、フローサイトメトリー用の5mLチューブに移します。
3. フローサイトメトリーによる細胞選別
   1. 陽性および陰性の細胞集団を収集するために2つの5 mLチューブを準備します。各チューブにRPMI 1640培地の1 mLを追加します。チューブをセルソーターの収集プラットフォームに配置します。
   2. ドットプロットを用いて対照細胞と実験細胞をそれぞれ分析する。パラメータフォワードスキャッタ(FSC)とサイドスキャッタ(SSC)を使用して、ライブセルをゲートします。FL-1強度に従って生細胞の正と負の集団をゲートします。
   3. α2δ1陽性細胞およびα2δ1陰性細胞を収集する。取得したセルの数を記録します。
   4. 収穫された細胞集団がα2δ1発現の異なるレベルを有することを確認するために、定量ポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)を行うことができる。
      1. グアニジニウムチオシアネート試薬で陽性および陰性細胞のRNAを抽出し、製造元のガイドに従ってRNAをcDNAに転写します。SYBRグリーン試薬でQPCRを実行します。プライマーの配列は次のとおりです: α2δ1-F, CAGTTGAGATGGAGGGGG;α2δ1-R, TTGTATGAGCAGTCGGTTTC;GAPDH-F, GTCGGAGTCAATTTGG;そしてGAPDH-R、AAAAGCAGCCCTGGGGACC。

2. 球体形成アッセイ

注:球体形成アッセイは、細胞の自己再生能力を決定するために適用される。自己再生能力を持つ細胞は、成長因子を補完するこの無血清性半固体培地で球を形成することができる。すべてのステップは生物学的安全キャビネットか層のきれいなベンチで行われるべきである。汚染を避けるために、抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を選別後に培養培地に添加することをお勧めします。

1. 中程度の準備
   1. DMEM/F-12粉末の1Lパッケージを蒸留水の475 mLに再構成することにより、2x DMEM/F-12培地を調製します。NaHCO₃の2.438グラムを追加します。pHを7.0~7.2に調整し、1 N NaOHまたは1 N HClを攪拌しながらゆっくりと加えます。500 mLの最終容積に蒸留水を加えます。0.2 μm フィルターを通してフィルター処理して培地を殺菌します。
   2. 蒸留水の100 mLにメチルセルロースの2gを添加することにより、2%メチルセルロース溶液を調出します。ソリューションをオートクレーブします。メチルセルロースは、オートクレーブ後に綿のような状態を示してもよい。ボトルを数回ゆっくりと上下に反転させ、自然な冷却のためにそれを残して混ぜます。一晩で透明な半固体になります。
   3. 自己更新培地の20 mLを得るために、50 mLチューブに2x DMEM/F-12培地の10 mLを追加します。B27の400 μLを培地に加えます。組換えヒト表皮成長因子(EGF)を25 ng/mLの最終濃度に添加する。組換えヒトの基本的な線維芽細胞増殖因子(bFGF)を25 ng/mLの最終濃度に加える。2%のメチルセルロースを加えて、20 mLの最終容積に達する。
   4. 培地を渦で混ぜて自己再生培地が得られるようにします。
2. 細胞種まき
   1. 収穫した細胞を自己再生培地に移し、2000細胞/mLに到達し、短い渦と混合する。超低アタッチメント96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのセルサスペンションを追加します。媒体は、これらの井戸で蒸発する可能性が高いとして、プレートの縁に井戸を使用しないでください。これらの井戸に殺菌水を加えます。
   2. 細胞培養インキュベーターで5%CO2を用いる37°Cで10〜14日間培養した。5~7日目に50μLの自己再生培地を追加します。
3. 球のカウントと計算
   1. 播種後10~14日で、50個以上(およそ)または直径100μm以上の球体の数を顕微鏡下で数える(対物レンズ4倍、10倍のアイピース)。
      注:ウェルの左上から始めて、顕微鏡のジョイスティックで目的表を水平方向に右に動かしながら球を数えます。次に、目的表を視野の中央の行に移動し、球を右から左に数えます。次に、下の行に移動し、左から右にカウントします。96ウェルプレートの井戸は3行以内に数えることができます。
   2. 球の数をシードしたセルの数で割った球数として球体形成効率を計算します。正の細胞母集団と負の細胞集団の間の球形成効率を比較する。

3. コロニー形成アッセイ

注:コロニー形成アッセイは、細胞の放射感度を決定するために適用される。放射線は放射線療法に使用される線形加速器によって送達することができる。実験室用の細胞照射システムは、装置が利用可能な場合にも使用できます。ステップ 3.1、3.2.3、および 3.2.6 は、生物学的安全キャビネットまたは層板のクリーンベンチで実行する必要があります。汚染を避けるために、抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を選別後に培養培地に添加することをお勧めします。

1. 細胞種まき
   1. 0 Gy群を含む各放射線量に対して6枚のウェルプレートを1枚調出す。6ウェルプレートの各井戸に1.5 mLの培地を加えます。コロニー形成アッセイ用培養培地は、従来のRPMI 1640培地を10%FBSで補合した(「完成1640」と名付けた)。
   2. 1640培地を1000細胞/mLに希釈する。
   3. ウェルにセルサスペンションを追加します。プレートを水平に振り、細胞が井戸に均等に分配するようにします。各用量群に追加された体積を記録する。
      注:一般に、0 Gyに対してウェル当たり200細胞、2Gy用に200細胞、4Gy用に400細胞、6Gyに800細胞、8Gyに対して1600細胞をそれぞれシードする。事前実験では、ソートされていない細胞の細胞数を調整することをお考えです。
   4. 細胞培養インキュベーター中に5%CO2を含む37°Cで培_養する。
2. 放射線
   1. 細胞がウェルの底部に付着した後(通常播種後1日、および細胞増殖を考慮して長い時間はお勧めしません)、細胞放射線を行う。
   2. 20 cm x 20 cm の放射線フィールドで 1 cm の深さで各線量のモニター単位 (MU) の数を計算します。
      注:深さの放射線被写界量/パーセンテージ深度線量(PDD)のMU=線量(cGy)/出力係数の数。たとえば、20 cm x 20 cm フィールドの出力係数は 1.066、1.0 cm の PDD は 0.987、8 Gy (800 cGy) の MU の数は 760 (800/1.066/0.987 = 760.35) です。各用量に対して複数のプレートを放射する必要がある場合は、より大きなフィールドを使用することもでき、MUの数はフィールドのサイズに応じて再計算する必要があります。出力係数と PDD はアクセラレータによって異なります。これらのパラメータについては、放射線物理学者を参照してください。
   3. 完成した1640を各井戸に加えて、媒体の高さに対して1cmに達する。
      注:6ウェルプレートの細胞増殖領域は、メーカーのガイドで見つけることができます。例えば、成長面積が6ウェルプレートの各ウェルに対して9.5cm2であり、前日に1.5mLの培地と0.4mLの細胞懸濁液を添加した場合、ウェルに7.6mL培地を添加する。高さは、用量の蓄積のために必要とされます.0.8 cm未満の中程度の高さはお勧めしません。
      注:放射線中はプレートを覆い続けてください。プレートを細胞培養室と放射線治療室の間で移す場合は、プレートをアルミホイルで包むか、汚染を避けるために清潔な箱に入れます。中程度がこぼれないようにプレートを平らに保持します。
   4. 20 cm x 20 cm の放射場を設定します。処理ソファに厚さ1.0cmの組織同等のボーラスを置き、6ウェルプレートをボーラスの上に置き、それらを接触させ続けます。プレート全体が放射線被ばくフィールド内にあることを確認します。ソーススキンの距離を 100 cm に設定します。
      注:同じ放射線量を持つプレートは、同時に放射することができます。この場合、より大きな放射場が必要であり、MUの数は対応する出力係数に従って再計算されるべきである。すべてのプレートが放射線被ばくフィールド内にあることを確認します。
   5. 各割り当てられた線量を各プレートに順番に配信します。
      注意:線形アクセラレータは、資格のある技術者のみが操作できます。放射線に近づかないで
   6. プレートを細胞培養室に持ち帰ります。各ウェルの完成した媒体の2 mLで媒体を変更します。細胞培養インキュベーター中に5%CO2を含む37°Cで培_養する。3~5日ごとにメディアを変更します。
3. 染色
   1. 放射線の7-10日後、多くのコロニーが形成され、それらが大きく成長し、一緒にマージする前に、染色とカウントを次のように実行します。培地を取り出し、PBSで簡単に洗います。細胞を固定するために、各ウェルに4%ホルムアルデヒドの1 mLを追加します。
      注意: ホルムアルデヒドは揮発性です。ヒュームフードにホルムアルデヒドを使用してください。
   2. 固定の10分後、ホルムアルデヒドを除去し、各井戸の蒸留水の2 mLで洗浄します。
   3. 各ウェルに1%結晶紫色染色液の1 mLを追加します。10分間染色し、結晶紫色汚れ液を取り除き、蒸留水で3回洗います。水を取り出し、プレートを乾燥させます。
4. コロニーのカウントと計算
   1. 50 を超えるセルを持つコロニーの数をカウントします。50 セル未満の小さなコロニーは含しないでください。顕微鏡下のコロニーをチェックして、50細胞で構成されるコロニーの印象を得て、マーカーペンでプレートの底に印を付けます。
      注:井戸を撮影し、ソフトウェアImageJを使用すると、カウントプロセスを容易にします。
   2. コロニーの数をシードした細胞の数で割ったコロニーの数としてコロニー形成効率を計算します。特定の照射用量でコロニー形成効率を0Gyでコロニー形成効率で割ったコロニー形成効率としての生存率を算出する。
   3. X軸としての線量と生存分率をY軸として用い、生存曲線を得ることができる。正の細胞母集団と負の細胞集団の生存曲線を比較します。

α2δ1高およびα2δ1-low A549細胞を選別した(図1A)。一部のマーカーは、異なる母集団を示す場合があり、ゲートが容易です。ただし、一部のマーカーは、明確な正と負の母集団ではなく、高い表現パターンと低い表現パターンを示すだけです。このような状況では、アイソタイプコントロールはゲーティングにとって非常に重要です。選別された細胞におけるα2δ1の発現はqPCRによって検証される。α2δ1をコードする遺伝子であるCACNA2D1の発現は、α2δ1低細胞と比較してα2δ1高細胞のソートにおいて高い(図1B)。

球の典型的な形態を図2Aに示す。球体形成効率はα2δ1-高およびα2δ1-低細胞(図2B)で計算される。α2δ1-高細胞は球体形成効率が高く、自己再生能力が高いことを示唆した。細胞コロニーの典型的な画像を図3Aに示す。約50細胞のコロニーを顕微鏡で調べ、基準としてマークすることができます。各用量での生存率を計算することができ、生存曲線を図3Bに示す。α2δ1-高細胞はα2δ1低い細胞と比較して放射線に対して比較的抵抗力がある。

ペアなしの両面学生のt-testを行い、グループ間の有意性を評価した。 p < 0.05 の値は統計的に有意であると考えられていました。データは平均偏差と標準偏差(SD)で表されます。同様の結果を持つ少なくとも3つの生物学的に独立した実験からの代表的なデータが提示される。

図1:A549におけるα2δ1-高およびα2δ1-低細胞のソート。(A)α2δ1発現の代表的なフローサイトメトリー分析。セルはアイソタイプコントロールに基づいてゲートされます。(B) QPCRによる高低集団におけるα2δ1発現の確認エラー バーは SDを示しています。

図2:α2δ1-高およびα2δ1-low A549細胞の球形成アッセイ。(A)選別されたα2δ1-高およびα2δ1-低細胞(bar= 200μm)によって形成された球の代表的形態。 (B)α2δ1-高およびα2δ1-低細胞の球形成効率。誤差余数は SD (***p < 0.001) を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:α2δ1-高およびα2δ1-low A549細胞のコロニー形成アッセイ。(A)α2δ1-高およびα2δ1-低細胞によって形成されたコロニーの代表的な画像。 (B)α2δ1-高およびα2δ1低細胞の生存曲線。種付き細胞の数は、0 Gyに対してウェル当たり200細胞、4Gyのウェルあたり400細胞、および8Gyの800細胞であった。誤差余数は SD (**p < 0.05、 ***p < 0.001) を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは、インビトロの癌細胞株におけるCSCの放射感受性を研究する方法について説明する。本研究では、α2δ1の発現はNSCLC細胞株において連続的である。したがって、ゲーティングはアイソタイプコントロールに基づいています。並べ替えの前に、α2δ1式は、フローサイトメトリーによって複数の細胞株で調べられ、QPCRまたはウェスタンブロットによって検証されるべきである。フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡下での蛍光観察、またはQPCR(ソート後)により、ソートされたα2δ1-highおよびα2δ1-低細胞のα2δ1発現を再分析することをお勧めします。

球体形成アッセイは、自己再生能力を評価する簡単な方法であり、これは、予備的に置かれたCSCを特徴付けるために使用することができる。この方法は、神経圏またはマンモスフィアを培養して神経膠腫または乳癌細胞の幹細胞を特徴付けるために使用され、かつ式は他のタイプの癌4、6、10を培養するために改変される。EGFおよびbFGFは、無血清培地における幹細胞の自己再生をサポートすることができる。しかし、基本的な培地および成長因子は、異なる細胞型を培養するために異なる場合があります。半固体培地は、細胞を固定化するために使用され、球が一緒にクラスタリングするのではなく、細胞増殖によって形成されます。超低アタッチメントプレートは、球体形態を維持するために実験で使用されます。また、CSCが球体培養後に濃縮されるにつれて、球を採取、消化、播種して二次球形成のために播種すると、その後の連続伝播9、10において球体形成効率が高まりやすくなる。CSCを特徴付のためのより厳密な基準は、一連のソートされた陽性および陰性細胞を免疫不枯滞マウスに皮下に注入し、次いで腫瘍性細胞の頻度を陽性および陰性細胞集団は10,14を計算する。球体形成アッセイにより置き換え癌幹細胞マーカーが同定された場合、生体内での更なる特徴付けは希釈アッセイを制限することを推奨する。

本研究では、CSCの放射感受性を評価する。コロニー形成アッセイは、放射感受性を評価する古典的な方法である。重要な並列ウェルに同じ数の細胞を播種する。各ウェルに追加されるセル懸濁液の体積が100 μLを超えるように、mLあたりのセル数を適切な範囲に調整します。ボリュームが小さすぎると、エラーが増加する可能性があります。細胞放射線の場合、線量の蓄積のために高さ1cmの培地を添加し、線量バックスキャッタのためにプレートの下に組織同等のボーラスを配置する。研究者は、放射線物理学者や技術者を参照して、細胞放射線モデルを設定し、線量を計算することをお勧めします。

この原稿は、CSCの放射線感受性研究のための最初のいくつかのステップを提供します。さらなるメカニズム研究は、DNA損傷修復に関連するタンパク質、活性酸素種のクリアランス、細胞周期停止などを含^{むことができる15。}これらの実験は大量の細胞を必要とします。したがって、細胞の多くの料理を準備する必要があります。CSC遺伝子の過剰発現またはノックアウト/ノックダウンは、CSCが放射線抵抗を得る方法に関する重要な洞察を提供します。

これらの方法は、がん組織のCSCを同定するために適用される可能性があります。Zhangらは、NSCLC外科試^料12からCD166陽性リン陰性細胞を分離について説明した。組織を無菌ブレードでみじん切りにし、酵素カクテルで消化した。細胞ストレーナーを通過して採取した細胞を選別用に標識し、次いで球体形成アッセイおよび生体内で希釈アッセイを制限することを特徴とする。CSCマーカーとしてのα2δ1については、肝細胞癌外科組織および小細胞肺癌患者由来異種移植片組織10,16においてCSCを単離することが報告されている。分析に必要な細胞数が多い場合、生検や循環腫瘍細胞においてCSCを単離することは比較的困難である。あるいは、生検のセクションを染色することは、腫瘍内のCSCの存在の手がかりを提供する可能性がある。しかし、この推定アプリケーションは、患者組織および臨床データで評価される必要があります。

著者は利益相反を宣言しない。

この研究は、中国国立自然科学財団(81402535および81672969)と国家主要研究開発プロジェクト(2016YFC0904703)によって支援されました。