後肢とラットの部分的な荷重を使用して火星への宇宙ミッションを模倣

革新的な地上のアナログ モデルを使用して、我々 はラット (0 g) への旅行および火星 (0.38 g) の宿泊を含む宇宙ミッションをシミュレートすることができます。このモデルは、ミッションの 2 つのハイポ重力段階中に発生する生理的変化の縦断的評価のことができます。

アンロード (HLU) 上肢の後肢の開発スペースの生理的影響の生理学的システムの飛行し 1979 年以来定期的に採用されていると理解する齧歯動物の地上ベースのモデルが活躍しています。ただし、今の宇宙探査の次のステップは、重力が地球の重力の 38% を火星への旅行を含めます。部分的な重力のこのレベルを経験している人間がいないので地上ベースの持続可能なモデルは、微小重力下での時間で既に障害身体がこの部分的な負荷に反応する方法を検討する必要。ここでは、短期のミッションを模倣し、重力で連続して適用の 2 つのレベルによる後肢筋の生理学的な障害を評価するために火星に滞在我々 の革新的な部分的な荷重 (PWB) モデルを使用しました。これは重力変化する筋骨格系の適応を検討し、宇宙飛行士の健康と機能を維持するために有効な対策を確立する安全、地上ベースのモデルを提供できます。

月や火星を含め、地球外の対象を表す有人宇宙探査の未来が両方地球よりかなり弱い重力。宇宙飛行士^1,2,3,4、5齧歯動物^6, 、筋骨格系の無重量の結果は、広く研究されている中^7,8,9、老舗後肢アンロード (HLU) モデル¹⁰、おかげで、後者は非常に小さな部分的な重力の影響について知られています。火星の重力は地球の 38% と長期探査¹¹; の焦点となっているこの惑星したがって、この設定で発生する筋肉の変化を理解することが重要です。これを行うには、我々 はラット¹²マウス^6,13筋肉と骨の両方の結果を使用して検証されましたが、前の仕事に基づく部分的な重量軸受 (PWB) システムを開発した.ただし、火星の探査前に、重力は、私たちの前述のモデル¹²に修正されなかった期間を延長。したがって、本研究では、火星への旅を模倣するモデルを変更我々 総後肢の最初のフェーズで構成されています、通常の読み込みの 40% で部分荷重の第 2 フェーズの直後に続きます。

ほとんどの HLU モデルとは異なりを選びました (Chowdhury ら⁹で説明したものに基づく) 骨盤のハーネスを使用する尾部懸垂動物の快適さを改善し、シームレスに移動することができるのではなく、難なく基板する HLU からほんの数分で。併せて、ケージとサスペンション デバイス、我々 は以前開発し、¹²が詳しく記載を使いました。/一貫した信頼性の高いデータを提供することに加えて我々 はまた、以前ロッドのセンターで懸濁液システムの固定アタッチメント ポイント移動、グルーミング、供給、または飲むから動物を予防しなかったを実証しました。この記事では、(完全および部分的に) 動物の後肢をアンロード、ように力とウェット グリップを使用して結果の筋肉の変化を機能的に評価する筋肉も彼らの達成された重力レベルを確認する方法について説明します。このモデルは探せ生物に適応する方法を調査することができ、既に侵害された筋骨格系の部分的な重力 (人工または地球外生物) の影響を調査するため非常に役に立つでしょう部分的な再読み込み、および対策中に、有人宇宙飛行の後に健康を維持するために開発される可能性がの開発のため。

ここで説明したすべてのメソッドは、[プロトコル番号] 067-2016 機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ベス イスラエス ディーコネス メディカル センターのによって承認されました。

注: 雄 Wistar ラットを基準 (0 日) に 14 週間の高齢者が使用されます。ラットは、順化を許可するカスタム ケージ 24 h 前基準で個別に収容されています。

1. 後肢

注: 骨盤のハーネスは、麻酔または目がさめている動物に置くことができます。ここでは、麻酔下の動物にプロトコルの説明が与えられます。適切な個人用保護具 (PPE) 動物の取扱いを着用します。

1. 3.5% イソフルランと 2 L/分の酸素流量麻酔ボックスにラットを配置します。
   注: 適切な anesthetization が確認できましたら後部足のしっかりしたピンチ反応は発生しません。
2. 動物完全に麻酔をかけられ、一度は、2% イソフルランと 1.5 L/分の酸素流量でノーズから麻酔ガスをベンチにラットを配置します。
3. 腹臥位でラットを置き、吻尾の動きで骨盤のハーネスを履きます。
4. 優しくベンド注意しながらきちんとしたを提供するために骨盤のハーネス フィットはない擦り傷や不快感を防ぐために後肢を絞る。
5. スイベル クラスプ付きステンレス スチール チェーンをフックが尾の基部にアタッチされている骨盤のハーネスのトップに接続します。
6. 麻酔からラットを削除し、最大延長チェーン カスタム ケージに動物を配置します。
7. ラットが完全に目を覚まし、モバイル、後肢はもはや床に到達できるまでトップ回転式クラスプを使用してチェーンを短きます。
8. 完全にアンロードされたままその快適さを評価し、ことを確認すべての回では、両後肢には数分のための動物を観察します。

2. 部分荷重

注: この手順は、目を覚まし、麻酔下の動物で実現できます。

1. ステンレス チェーンと背中の棒から成る三角形のパーツを追加して HLU サスペンション デバイスをプリント基板の懸濁液に変換します。
2. HLU (手順 1.1 および 1.2) の詳細として同じ手順に従い動物を麻酔します。
3. (400 g または 400 グラム以上重量を量るラット用 L 下のラットの M) ラットの前肢に適切なサイズのテザー ジャケットを配置し、バック ブラ エクステンダーを使用して閉じます。
4. 三角形の部分の 1 つのクラスプを背中ブラ エクステンダーでは、尾の基部に骨盤のハーネスにあるフックの反対側のクラスプにあるフックに取り付けます。
5. 檻の中の麻酔から回復する動物を許可します。一度目を覚まし、チェーンを短縮し、必要な場合は下のスイベル クラスプの場所の変更によって懸濁液は前肢と後肢に等しいことを確認します。
   注: この手順も実現できるフォース プレートを使用してすべての手足に等しい荷重を確認します。
6. 鎖の短縮なし動物と全体の器具の重量すなわち、「ロード」の体重を記録するスケールの上にラットを配置します。
7. スケール表示「ロード」体重と記録の達成の 40% までチェーンを短く重力レベル (荷を下された重量と重量の比率として表現される)。
8. 荷を下された重量が安定しているラットがすべて手足に均等にロードされていることを確認して動物を観察します。
9. ロッドを使用してスケールから全体の器具を取り外し、そのケージに戻ってラットを置きます。

3. 後肢の評価グリップ力

1. 前肢の下に 1 つの手を置くことによって伝統的な拘束とラットを保持します。2 番目の手と尻尾を軽くつかみ。
2. リアの足のグリップ バーのアプローチし、両方の足がバーに完全に休んでいることを確認します。
   注: ラットがバーを完全にグリップしない、自主的なグリップの証拠が表示されません、拘束を少し緩め。これが成功した場合、そのケージにラットを戻り、数分後再試行してください。
3. 優しくラットまでをまっすぐ引き上げますバックのグリップを解放します。探触子に表示される最大の力を記録します。
4. 測定と繰り返し 3 回テストの間待機約 30 秒。
5. 疲労のアカウントには、スコアリングのための 3 つの測定値の平均を計算します。

4. 筋の記録ウェット質量

1. CO₂安楽死室にネズミを配置します。IACUC と AVMA のガイドラインによると適切な時期を待っている後、呼吸の欠如の目視による安楽死を確認します。
2. 腹臥位で解剖テーブルにラットを置き、小さな解剖はさみを使って足首近く切開によって毛皮および皮を削除します。手を使用すると、皮膚の層をやってのけます。
3. 筋膜を破る小さな解剖はさみを使って、優しくし踵骨腱を分離します。
   注: 踵骨腱は、ヒラメ筋と腓腹筋の両方の接続点です。
4. 踵骨腱をピンセットの小さなペアを保持している間解剖はさみを使用して上にある、大腿二頭筋から腓腹筋とヒラメ筋を分離します。
5. 一度分離、膝窩動脈領域における腓腹筋とヒラメ筋の付着点をカットします。
6. ゆっくりと腓腹筋からヒラメの引きで、踵骨腱を切断することによってそれらをデタッチします。
7. ラットを仰臥位で配置します。慎重に筋膜を削除、脛骨、足首から上方への動きで皮をむきます。
8. その優れた添付ファイルの時点で前脛骨筋をカットします。
9. 正確なウェット tared 精密スケールと計量ボートを使用して各摘出筋量を記録します。

以前考案した、後肢 (HLU,図 1) と部分的な重量軸受け (プリント配線板、に適したステンレス鋼チェーン ベースのサスペンション装置を用いて詳細¹²で説明されている、新しいケージを活用図 2)。私たちの設計の重要な利点は、荷を下すこと、動物のための同じ環境を維持しながら数分のうちに他の 1 つのタイプから移動する機能です。HLU のそれぞれの側にスイベル クラスプ付き単一の特注ステンレス チェーンに接続されている (図 2 a) オーダーメイド骨盤ハーネスを使用しました。このサスペンション デバイスを変更し、基板を達成するため、強い背中の棒、背骨 (図 3) のすぐ上に座れるように設計を組み込むステンレス チェーンのワンピース三角形の追加は、唯一の要件です。目がさめているまたは麻酔下の動物にこれらの手順を実行できます。

我々 は正常に合併症なく 7 日間全ての動物の後肢をアンロードでき、すぐに彼らの通常の読み込み (PWB40、平均の 40% の部分的な重力を公開この実験で提供される汎用性の高い環境と重力レベル 0.4076 g ± 0.0036 g とする)。合計 HLU の最初の週の間に動物は有意な体重減少を表示 (図 4 a:-7.19% ± 0.87%、n = 9、 p < 0.001)、他を目撃されている¹⁴日をモデルし、で我々 が観察したものから大きな違いはありません同じ期間 PWB40 に暴露したラット (-5.53% ± 1.44%、n = 10, p = 0.37)。しかし、動物は、その後 PWB40 にさらされながら時間をかけての重量を失う続けた (-9.06 基準、 p < 0.0001 から ± 1.35%)。

後肢のグリップ力は縦に使用することができます筋肉の機能の標準的な測定 (図 4 b)。私たちに気づいた一週間、合計アンロード 50.16% ± 4.10% ベースライン (p < 0.0001) と比較してグリップ力の平均減少につながった。通常の読み込みの 40% で部分荷重の 1 つその後の週後、我々 はグリップ力に関する変更をさらに任意のことを気付かなかった (-44.29 基準、 p < 0.0001% ± 4.67%)。すべての時点でリア足把持力のパーセントの変化は年齢をマッチさせたコントロールと大幅に異なる (p < 0.0001 7 日目および 14 日 n = 11)。さらに、研究の完了後、部分的な荷重 (HLU PWB40) 続いて合計アンロードを受けた動物表示 PWB40 グループに比較して有意に大きいグリップ力損失を見ました (p = 0.03)。

通常の読み込みの 2 週間または PWB40 の 2 週間後得られた筋湿式質量の実験の終わりに記録され、データと比較した (図 4) と私たちのグループ¹²刊以前のデータ。我々 が見つかりましたのヒラメ (S), 腓腹筋 (G) 質量 PWB40、HLU PWB40 グループが有意に低かったが、濡れているし、年齢をマッチさせたコントロール (PWB100) よりも筋肉が前脛骨 (TA)。確かに、我々 は 0.1681 g ± PWB100 の前の実験で 2 週間曝露ラットに比べて有意に低かったが私たちの動物の 0.007 g 平均ヒラメ筋質量を記録した (-24.60 p < 0.0001% ± 3.18%)。腓腹筋の我々 はウェット 2.192 g ± 0.096 g 量平均を記録した (-10.55% ± 3.93%、 p = 0.038 対 PWB100) と 0.759 g ± 0.029 g 脛骨の湿式質量 (-14.40% ± 3.27%, p = 0.009 対 PWB100)。火星アナログ (HLU-PWB100) に暴露された動物が 2 連続週間の PWB40 にさらされる動物と比較してヒラメ筋と腓腹筋の筋の減少ウェット質量を持っていた私たちのデータのセットが強調表示中 (-8.75 ± 3.84%、-5.85 ± 4.14%それぞれ)、これらの 2 つのグループ間に有意差は見られなかった。

図 1: サスペンション デバイスの説明とプリント配線板 HLU から変換する方法です。(A) 私達の前の設計に基づいて、我々 は安定した懸濁液を保持するためにケージの上に座っているアルミ棒を使用ステンレス鋼チェーン (矢印 2) (矢印 1)、棒の中央に保護されたキー リングの構成デバイスと 2 回転 (矢印 3) の留め金。(B) プリント配線板、三角形の構造を達成するためにサスペンション デバイスを変換するは、下回転のクラスプを使用してアタッチされます。この作品は、ステンレス鋼チェーンとラットの背骨 (1 の矢印) の上に座ってポリ塩化ビニル (PVC) バック ロッドで構成されます。背中の棒のそれぞれの側にはハーネスとジャケットにそれぞれ接続するクラスプをある (矢印 2)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 後肢を骨盤のハーネスを使用してアンロードします。(A) 正面と側面は動物の後肢のサポートに使用されるハーネスの構造の図面を表示します。(B) 骨盤のハーネスは、ラットの後肢の周りぴったりに合うように説明されているように配置されました。ステンレス鋼リンク、尾のベース上に配置、回転式クラスプに付着します。正確な場所とハーネスの形状は、動物によって異なりますが、ラットは快適なする必要があり、後肢は決して地面に触れることが必要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 部分荷重。部分除荷すると、フロント手足をサポートするために動物にジャケットの追加が必要です。ジャケットは背中のブラのエクステンダーで閉じられます、フックが、肩甲骨の間横になっている、エクステンダーに接続されています。背中の棒の両端に位置する留め金にジャケットと骨盤のハーネスをつけたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: さまざまなアンロード レベルにさらされている動物の縦断的フォロー アップの例です。(A) 本体重量 (BW) の変化。動物は、ハーネスやジャケットと体重が記録されたことがなく毎週秤量しました。PWB100 = 通常の読み込みで部分荷重PWB40 = 通常の読み込みの 40% で部分荷重HLU PWB40 = PWB40 の 1 週間続いて後肢の 1 週間。次の 2 方法積み上げ ANOVA テューキー事後テストの結果として表示されます *: p < 0.05 * *: p < 0.01 * * *: p < 0.001 と * * *: p < 0.0001 対 PWB100。(B) リア足把持力の変化。毎週、後部足のグリップ力を測定したし、それぞれの動物のためのベースラインからの変化率で表現した結果。次の 2 方法積み上げ ANOVA テューキー事後テストの結果として表示されます * * *: p < 0.001 と * * *: p < 0.0001 対 PWB100、α: p < 0.05 対 PWB40。(C) 筋は、14 日後質量を濡れています。筋湿式質量精度スケール 14 日に犠牲の直後に記録されました。結果は、年齢をマッチさせた対照群 (PWB100) で得られた湿潤質量の割合として表されます。S = ヒラメ。G = 腓腹筋;TA = 脛骨。次の一方通行 ANOVA テューキー事後テストの結果として表示されます *: p < 0.05 * *: p < 0.01 と * * *: p < 0.0001 対 PWB100。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

このモデルは、最初地上アナログの連続機械荷役レベルを調査するために開発を示しへの旅行を模倣し、火星に滞在することを目的します。

このプロトコルの多くの手順は、その成功を保証し、厳密に調査する必要があります重要です。まず、動物の健康を監視し、彼らは比較的正常に保つ基板状態、特に中に通常の動作 (食事、休憩、探索などすなわち、実行タスク) を保持しているを確認することが重要です。生理学的な姿勢。第二に、時間をかけて非常に安定した、最小限の介入^12,14を必要とするプリント配線板のレベルにもかかわらず、動物の間で変動を最小限に抑えるために達成された部分的な重力を記録する不可欠です。さらに、動物は部分的な重力 (PWB40) に総荷重から移行、彼ら既に実質的な筋萎縮と表示機能^6,9,15, 過渡現象を引き起こす可能性がありますの損失四足の荷重動作を再開の難しさと瞬間的なぎこちない歩行につながる。

変数の環境によるいくつかの問題が発生して必要があります密接に記録でき対処します。たとえば、流体シフトが動物の斜めにより HLU 期間発生します、それはプリント配線板¹⁶の間に存在しません。いくつかのケースで流体の再配布は顔やリアの足の最も顕著な微妙な浮腫を引き起こす可能性が、通常次のリロード時間に消えます。浮腫の重症度をスコアし、毎日それを評価する調査をお勧めします。48 h 以上の重度の浮腫が続く場合は、動物を実験から除外すべき。

骨盤のハーネスの使用は、動物や利便性の向上、調査官に慰めを提供、いくつかの動物は、あります、いずれか完全にまたは部分的にからの脱出そのハーネス HLU または基板中に。マウス⁶ 3 回をエスケープする動物は研究から取除かれるの前の仕事に基づく排除プロトコルに従いました。側メモで、エスケープは非常にまれです。我々 の仕事で動物の 1% 未満 (148 動物は勉強から 1 動物) の 1 年間は除外しなければならなかった。基板レベルの毎日の滴定は決定的な瞬間、実験者が脱出の危険性をできるだけ少なくするジャケットと骨盤のハーネスのぴったりフィットを確保できます。動物の体重と健康を評価しながら毎日、特別な配慮は、骨盤のハーネスの維持にすべき。骨盤のハーネスが破損している場合、摩耗を表示できるサイト固有の脱毛は最も一般的な結果が、(すなわち、噛む)。ハーネスの状態を毎日チェックし、破損している場合のコンポーネントまたは皮膚摩耗の外観を防ぐために必要なとき全体のハーネス交換研究者をお勧めします。幸福は、少なくとも次の手順を含める必要があります: 体重、ポルフィリン症、食物摂取、尿や糞便、脱毛、皮膚の摩耗の有無の監視浮腫。

動物の爪は、フックとループのファスナーや布、したがって彼らのバランスを損なうことも時折はめになることができます。起きてからこれを防ぐために簡単かつ効率的な方法は、そっとジャケットを配置する前に麻酔下で爪をトリムするのにです。研究の過程で必要な場合、この手順を繰り返すことができます。

特別な注意は、HLU からプリント配線板に移行中に支払われる必要があります。一方、我々 はすべての動物がプリント基板に配置される直後に少し難しさの歩くことができることを観察、後肢と前面に重量の同量を入れに必要な時間の量はラットの間で変化。ラットが 24 h ですべての手足を使用して比較的普通の歩行を示していない場合は、研究から除外する必要があることをお勧めします。

シーケンシャル ・重力環境を模倣するように設計この小説のモデルは、時間をかけて信頼性と持続可能なです。ただし、いくつかの制限が存在する、まだ対処します。まず、このモデルの組み合わせは、HLU モデルのみリア手足に人工重力を作成すると、動物の後肢で発生する変更を評価するだけです。したがって、この地上ベースの HLU 基板順次アナログは調査に適した前面下肢の変化。第二に、14 日間にわたって私たちの動物は全体体重の部分 (図 4 a) アンロードするラットの複雑な区画整理を強調表示の連続が、生命にかかわる損失を表示されます。以前基板ラット モデル研究で PWB40 と PWB20 で暴露された動物 2 週間のみ、最初の 7 日間以上の重大な損失を発表した、取り戻した重量後¹²。これは、ラットの適応の最初の期間後四足歩行に荷を下すことを調整することができたという事実のために可能性が高いだった。しかしで本研究では、持続的な減量を説明する可能性が決して完全に 1 週間ごとに、2 つの異なるアンロード/部分リロード期間に適応ラット。完全のこれらの期間をさらに拡張することが重要と部分的なアンロード動物ことができます完全に適応し、各環境に落ち着くことを確認することです。ストレス レベルでは、このモデルでまだ評価されていないと、将来的に完全にアクセス可能のまま尾を使用して定期的な血液サンプリングを使用して監視することが簡単にできます。

縦断的評価が筋機能および筋質量において一週間、後肢の把持力の 70% の減少を示す私たちのラットの 1 つの後部足把持力 (図 4 b) 途方もない低下の原因。当然のことながら、14 日後動物表示平均ウェット後肢筋の質量に対し私たちの以前の研究¹² PWB40 の 14 日にさらされた動物間で有意差がなかったよりも大幅に低いグリップ力、PWB40、HLU PWB40 グループが平均のヒラメについての私たちの 3 グループ (PWB100、PWB40、HLU + PWB40) 間で強い線形相関関係を確立することができました質量 (R² = 0.92、 p < 0.0001)。

これらの結果をその次の総機械的アンロード妥協筋フィットネス部分除荷の連続が、安定した期間中に観察だろうものよりもより多くの読み込み部分確認します。今までの知識で、このギャップは解明されていません。この現象のさらなる評価は、月や火星へのミッションのコンテキストで筋肉が体調不良を防止する効果的な対策を開発するために追求されるべき。できますさまざまな荷を下すことのいくつかの学位を持つ異なる実験および時間の様々 な長さのため、モデルの強度はその汎用性で存在します。

著者が明らかに何もありません。

この仕事に支えられたアメリカ航空宇宙局 (NASA: NNX16AL36G)。著者は、この原稿に含まれる図面を提供するためカーソン センプルを感謝したいです。