側頭葉てんかんと脳波監視テレメーター システムを使用してマウスのピロカルピン モデル

本稿では、全身ピロカルピン注射によるてんかん重積状態を誘導して無線テレメトリー ビデオと脳波システムを使用して生きている動物の自発的再発性発作を監視する方法について説明します。このプロトコルは、急性発作、てんかん、慢性てんかんの病態生理学的メカニズムを研究するために利用できます。

側頭葉てんかん (TLE) は、成人の一般的な神経疾患です。慢性てんかんのトランスレーショナル研究ピロカルピンによるてんかん重積 (SE) が頻繁に自発的再発性発作 (SRS) を要約する選択します。ここでピロカルピンの投与した腹腔内 (群) の無線遠隔測定ビデオと脳波 (EEG) システムを使用して生きている動物の定期的な発作を慢性の監視と SE 誘導のプロトコルを提案する.ピロカルピン注射後 7 日間で 6 週間後ピロカルピン海馬の神経細胞の減少との関係の注意を必要とする顕著な行動の変化を示しました。またビデオと脳波記録用電極注入の実験の手順や頻度の解析、慢性再発性発作の期間について述べる。最後に、我々 はなぜ期待どおりの結果は、それぞれのケースで達成されていない原因をについて説明します。これはマウスのトラブルシューティングのためのガイドライン慢性てんかんのモデリングの基本的な概要を説明します。このプロトコルが慢性てんかんとてんかんの適切なモデルのためのベースラインとして使用できると考えています。

TLE は、最も一般的な取得てんかん¹のいずれかです。てんかんを持つ人々 の脳^2,3の異常な神経活動の結果として再発発作を経験します。TLE はしばしば難治性ではない、ことを考える、てんかんの開発の基礎となる基本的なメカニズムを理解することが重要です。

人間 TLE の主な特徴を要約することができます動物のモデルは TLE の病態、容易に監視し、てんかんの重要な要因を操作することのより良い理解を提供できます。その中でも、chemoconvulsants 誘起 SE は広く使われている^4,5をされています。海馬硬化と堅牢な SRS^6,7、8を示しています電気刺激などの他のてんかんモデルとは異なり、chemoconvulsants の全身投与が人間 TLE の臨床病態をまねることができます。すなわち、初期の脳損傷、潜伏期間、慢性てんかんはステージけんしょう SRS^5,9,10です。したがって、急性期脳損傷、てんかん、発作抑制のメカニズムを説明する様々 な研究ではこの手法を利用できます。さらに、chemoconvulsants による病理組織学的変化は TLE 齧歯動物モデル^10、11,12の使用のための追加の根拠を提供する人間の TLE に見られるものと似ています。特に、海馬を含む構造の被害が一貫して両方カイニン酸およびピロカルピンによる SE モデルで再現します。ただし、カイニン酸注入と比較して、ピロカルピン モデル生成できるマウス、トランスジェニック マウス線^5,の普及を考慮したとき、慢性てんかんを勉強するためのかなりの利点を提供できるより堅牢な SRS^13,14,15します。 また、発作進行ピロカルピン注射はカイニン酸モデルよりも一般に高速後てんかんのピロカルピン モデルの効果的な使用のための追加の証拠を提供します。

ここでは、ビデオと慢性てんかんの脳波モニタリングを行いピロカルピンの i. p. 注入による誘導 SE 法を示す.

すべての実験プロシージャ韓国カトリック大学の倫理委員会で承認され、ケアおよび実験動物の使用 (NIH 出版物第 80-23) 国立の機関健康ガイドに従って行われました。

1. SE 誘導

1. 8 週齢雄 C57BL/6NHsd マウスを購入し、それぞれのマウスの重量を量る。その後、マーカーのペンを使用して、SE 誘導中に、簡単に識別できるすべてのマウスの尾をマークします。
2. マウスの重量に基づいてスコポラミン臭化メチル (スコポラミン; 2 mg/kg)、テルブタリン hemisulfate (テルブタリン; 2 mg/kg)、塩酸ピロカルピン (ピロカルピン; 280 mg/kg) の量を計算し、生理食塩水 0.9% 食塩水 (10 mL/kg) ソリューションを作成するを追加します。
   注:たとえば、マウスの重量が 25 g の場合次に掲げる金額が適用されます: スコポラミンとテルブタリン: 2 mg/kg * 25 g (1,000 g) = 0.05 mg、生理食塩水: 10 mL/kg * (1,000 g) 25 = 0.25 mL、ピロカルピン: 280 mg/kg * 25 g (1,000 g) = 7 mg、生理食塩水: 10 mL/kg * 25 g (1,000 g) = 0.25 mL。
3. 30 G の針を用いて 1 mL の注射器にスコポラミンとテルブタリンの混合物をロードします。各マウスに腹腔内に薬液を注入し、マウスをケージに戻ります。テルブタリンとスコポラミン投与後 30 分で各マウス (i. p.; 1 mL 注射器 30 G 針) にピロカルピン溶液を注入します。ピロカルピン投与後すぐに観察のためのインキュベーター (28-30 ° C) にマウスを配置します。
4. SE が誘発されるまで慎重にマウスの動作を監視します。ラシーンの規模に応じて 3 以上のステージに対応する大脳辺縁系の運動発作が検出された場合は、時間を記録し、発作が頻繁に発生するかどうかを判断するマウスを監視します。連続の運動発作は 2 分以上を最後に一度室温で新しいケージにマウスを置き、その痙攣を続けるし、SE が誘導されるかどうかを決定する 3 h の監視を保つため。入力に失敗したマウスを安楽死させるピロカルピン投与後約 2 時間で SE。
   注:ラシーンのスケール;ステージ 1、口や顔の動き;ステージ 2、頭うなずいて。ステージ 3、前肢クローヌス;ステージ 4、前肢クローヌス; 育児ステージ 5、飼育と前肢クローヌス¹⁶と落ちる。SE 導入後すぐに、マウスは室温でケージに引き継がれないマウスはハイパーサーミアのため死ぬことができます。
5. ジアゼパム ソリューション (i. p.; 10 mg/kg 群; 1 mL 注射器 30 G 針) を注入することで SE の発症後 3 時間で行動の急性発作を終了します。生理食塩水 (i. p.; 10 mL/kg; 1 mL 注射器 30 G 針) を追加することによって 10% polyoxyl 35 水添ヒマシ油でジアゼパム 5 mg/mL を希釈しては、ジアゼパムのソリューション。
   注: 10% polyoxyl 35 水添ヒマシ油ソリューション: 1 mL polyoxyl 35 水添ヒマシ油ソリューション + 9 mL 生理食塩水。室温でソリューションを保存します。たとえば、マウスの体重は 25 g、ジアゼパム ソリューションの 250 μ L を注入: 50 μ L 5 mg/mL ジアゼパム + 200 μ L 10% polyoxyl 35 水添ヒマシ油ソリューション = 250 μ L 1 mg/mL ジアゼパム。
6. 偽マウス スコポラミン臭化メチルとテルブタリン hemisulfate 混合物の i. p. 注射を実行 (i. p.; 両方の 2 mg/kg、30 G 針; 1 mL シリンジ 10 mL/kg)。30 分後、腹腔内に生理食塩水を注入 (i. p.; 10 mL/kg; 1 mL 注射器 30 G 針)。
   注:マウスの体重は 25 g、250 μ L ピロカルピンの代わりに生理食塩水の注入があります。
7. ジアゼパム注入 (i. p.; 1 mL 注射器 30 G 針)、1 mL (26 G 針 1 mL 注射器; i. p.) 個々 のマウスあたり 5% ブドウ糖の管理します。
   注: 1 mL の 5% ブドウ糖注入エネルギー源と生存率を高めることができます水和を提供します。
8. インキュベーター (28-30 ° C) で後ケア中に過剰分泌唾液、涙、糞便などを拭き取る。
9. 日 1 SE 誘導後、マウスの重量を量るし、1 日余分にインキュベーター (28-30 ° C) でそれらを保ちます。SE の誘導の後の 2 日目、マウスの重量を量る、彼らのホームのケージに戻ります。彼らの回復を容易にするしっとり食事を提供します。
   注:この実験では、SE 終了後 C57BL/6NHsd の死亡率の平均 (35 マウス テストのうち 3) 8.57% であった。
10. 7 日後ピロカルピンまで毎日動物の体重を測定し、5% ブドウ糖 (i. p.; 1 mL 注射器、26 G 針) とマウスを注入時、体重は増加していません。本体重量監視マウス開始体重を取り戻すために、ピロカルピン投与後 2 日で苦もなくしっとり食事を消費するときを停止します。
    注:7 日間ポスト SE までマウスの体重が増加していない場合実験からマウスを除外し、二酸化炭素による安楽死させます。マウスの背景によって死が時折発生します。ただし、C57BL/6NHsd の場合マウスの 1% 未満はこれらの実験で死亡しました。SE 誘導後 7 日以上の生存、マウスはほとんど潜伏期間中に死にます。

2. 注入手術ビデオ脳波モニタリング

1. 12 週齢のマウス (SE 導入後 4 週間) を準備すると、脳波を監視するためのテレメトリの注入を実行します。
   注:注入のタイミングは、実験の目的とマウス系統に応じて変更できます。
2. 術前にケタミン (50 mg/mL) および 2.5 μ L/g 本体重量 (i. p.; 1 mL 注射器、26 G 針) の用量で生理食塩水に溶解したキシラジン (23.3 mg/mL) ソリューションの混合物 (4:0.5) でマウスを麻酔します。一定の間隔 (最大 15 分間隔) でマウスの呼吸努力と呼吸速度を監視し、ペダル逃避反射によって麻酔の深さを評価します。
3. 耳バーとバイト プレート固定枠にマウスを置きし、失明を避けるために両方の目に獣医軟膏を適用します。
4. 手術中に滅菌状態を維持するためにかみそりの刃を使用して施術部位を剃る。毛皮手術野の汚染を防ぐために注意してください。シェービング後、70% エタノール、ヨウ素溶液で皮膚を消毒します。
   注:手術は、滅菌手袋、滅菌機器や無菌技術を使用してマスクを身に着けている無菌的に行わなければなりません。
5. 麻酔の深さを確認した後、頭蓋骨を公開する皮膚の正中切開を確認します。前後軸 (AP) の前から座標に脳定位固定装置に接続されているドリルでバリの 2 つの穴を作る: +0.1 mm、内外軸 (ML): +0.1 mm (リファレンス) と AP: −0.2 mm、ML: +0.22 mm (左頭頂葉)¹³。
   1. PBS に浸した綿スワップ、70% エタノール、ヨウ素溶液の順で肌を拭いてください。はさみラムダ (、矢状面と後上の縫合が交わるポイント)、前 (矢状縫合、冠状縫合の交点の点)、およびターゲットの場所を公開するとヘッドの中央で縦切開を作る。
   2. ラムダや前など解剖学的ランドマークを識別します。穴あけの位置このポイント前でメモ、X、Y 座標します。
   3. 脳のアトラス本を使ったり、脳波記録の脳領域の適切な座標を決定する参照を公開します。ネジ (リファレンス ・記録) の座標を計算すること、2.5.2 のステップで測定前の座標を使用して。
   4. 頭蓋骨が薄く時点であまりにも遠くドリル ビットを挿入することに注意しながらバリの穴にドリルの刃をゆっくりと下ろします。
6. 挿入単一チャネルの本体は皮下首筋、首の後ろに脳波送信機を無線し、柔軟な配置は、頭蓋骨の近くリードします。
7. ステンレス鋼ねじ (2 mm) を各穿にピンセットで配置を時計回りに回転でスクリュー ドライバーを使用して締めます。ネジが硬膜や脳の組織の損傷を防ぐためにねじの回転角度を調整することによって余りに深くまで挿入されていないことを確認します。
8. 絶縁被覆リード線の先端から 2 mm のストリップ、電線とネジの間の接続が良好のため、ねじ軸を丸める十分な長さワイヤーを伸ばします。フロントのネジと頭頂連合野のネジに録音リード参照リードを接続します。その後、金属の部分を公開することがなく場所でアセンブリ全体をセキュリティで保護する歯科用セメントを適用します。
9. 歯科用セメントが目視による完全に乾燥していることを確認した後、皮膚を縫合し、局所ムピロシン軟膏を適用します。マウスを置き 30 の ° C の定温器単独で手術 (約 30 分) からリカバリするまで。連続ビデオ脳波モニタリングを開始するまで、家のケージにマウスを返します。
   注:手術後、それぞれのマウスは 5 mg/kg のゲンタマイシン (抗生物質) とケトプロフェン (鎮痛薬) の 5 mg/kg (i. p.; 1 mL 注射器 30 G 針) が注入されます。完全に通院になるまで、動物を監視する必要があります。送信機移植マウス約 1 週間の回復期間があります。

3. ビデオ ・脳波モニタリングと分析

1. 個々 のケージ内マウスを置き、ファラデーケージの中がコンピューター、AC ラインと隣接する受信機を含むすべてのソースからの電気信号の中断を避けるためにインストールされているワイヤレス レシーバー プレートの上にケージを置きます。
   注:製造元によって提供されるマニュアルを参照してください。死角を避けるために注意する必要があります。
2. 無線ビデオ EEG テレメトリ システムを使用して電気的活動を記録します。
   1. ビデオ脳波記録用ソフトウェアを開きます。「ハードウェア」をクリックし、、"設定を編集"を選択します。受信機と送信機の各マウスに注入を一致します。「チャネル構成」をクリックし、すべてのチャンネルがアクティブなことを確認します。「ビデオ設定」をクリックして脳波データ (30.00 40 × 480、フレーム レート解像度) とビデオを同期しますします。
      注:夜、マウスの微妙な行動の変化を識別できる良好な画像品質を収集する必要がある場合は、感度が高い IP カメラをインストールします。
   2. 「セットアップ」をクリックして、個々 の動物情報を入力、一致したカメラ、およびグラフ設定に「セットアップの P3」.
   3. セットアップのサンプリング レートを「取得」と「A/D サンプリング レート」をクリックします。「データセット名」をクリックして各実験を指定します。
      注:脳波のサンプリング レートは高い 500 Hz。 よりも大規模なビデオと脳波データ サイズのためする必要があります、お勧めだけセッションごとに処理されるデータの 24 h 連続 2 週間記録を使用して 1 つのファイルとしてではなく。RAM メモリ不足の場合 8 時間または 12 時間の間隔でデータを別々 に保存できます。
   4. 磁気棒を持つ送信機をアクティブにし、「集録を開始」をクリックしてビデオ脳波記録を収集します。少なくとも 2 週間ビデオ脳波システムによってマウスを継続的に監視します。
      注:C57bl/6 マウスの SRS は、最後約 5.2 日と無料の発作期間の長さは約 6.7 日¹⁷クラスターで発生する傾向があります。
3. 解析ソフトウェアを使用した手動検査で発作頻度と期間を決定します。
   1. SRS を示す領域をマークし、統計分析用のデータをエクスポートします。頭をかいたり、咀嚼; によって生成できる脳波アイテムを除外するのには注意が必要これらは、ビデオのデータをチェックすることによって削除できます。
      注:SRS は、反復的なてんかんスパイク活動の突然の発症として定義 (≥ 3 Hz) が続く以上 10 s. けいれん動作はよくスパイク活動のバーストを伴うことができます。非痙攣また痙攣行動せずアノキシア スパイキング活動をデモンストレーションできます。発作終了は発火スパイク ベースライン アクティビティに戻る時に発生すると定義されます。
   2. 発作頻度の分析、それぞれの個々 の動物のための記録日数の合計で 2 週間の間に検出された場合は SRS の合計数を分割します。
   3. 発作持続時間の分析のため発症からてんかんスパイク活動の終了までの時間を測定します。
4. ビデオ脳波記録の完了後、transcardial 潅流によって 4% パラホルムアルデヒドで脳を修正します。マウスを麻酔のケタミン (50 mg/mL) とキシラジン (23.3 mg/mL) ソリューション (4:0.5) を注入するには、投与量 10 μ L/g 本体重量 (i. p.; 1 mL 注射器、26 G 針) で生理食塩水に溶解しました。マウスを確認して、麻酔が深く、一度灌流 transcardial を実行します。
5. マウスの脳を分離する前にクレンジング後の再利用のためのマウスから送信機を取得します。
   1. 鉗子を使用してリードを歯科用セメントを削除します。
   2. 歯科用セメントを溶解するまで 100% アセトンで歯科用セメントとリードの先端を浸します。
   3. 送信機周辺の組織の汚染物質を削除するには、蒸留水で洗浄します。
   4. リンス 3 h や空気のための 70% のエタノールで送信機乾燥して保管。次の使用前にすぐにネジとの 70% エタノール、蒸留水、続いて送信機を洗浄し、生理食塩水にそれらを置きます。
      注:以来、マウスを decapitating フレキシブル リードが短すぎる場合、次の注入とビデオ脳波記録のノイズを増やす可能性があるときに柔軟な配線を切断しないように注意する必要があります。

成功した SE は、海馬の細胞死および SRS (図 1および図 2) を引き起こすことができます。私たちは SE 発症後 3 h でジアゼパム注入による行動の急性発作を終了し、7 日または 6 週間後マウスを犠牲にしました。

ビデオ脳波モニタリング、SE 後、4 週間でインプラント手術を受けたマウスおよび SRS の場合は SE 発症後 5-7 週間から 2 週間行った。

クレシル バイオレット染色による海馬の細胞死を図 1に示します。SE 後 7 日で異型細胞が検出された海馬歯状回と海馬 (図 1Af) の CA3 サブフィールドの錐体細胞層の肺門領域 (図 1Ad) でそのまま海馬が観察されたに対しピロカルピン (図 1Aa c) の代わりに生理食塩水を注入した偽の動物。興味深いことに、複数の発作を受けた動物は、入力に失敗しました SE、肺門領域の錐体細胞層 (図 1Ag i) 細胞死を認めなかった。SE 後 6 週間で肺門細胞 (図 1Bm) 数のマーク付きの減少を認めた。さらに、神経細胞の損失は、CA1 で観察された (図 1Bn) と CA3 (図 1Bo) 地域。

図 2は、シャムと SE グループ (図 2A) で代表的な脳波トレースを示します。生理学的な電気的活動を示す偽のグループと比較して、SE のグループは時折けいれん動作を伴うてんかん放電を示した。硬膜外の電極の位置は、図 2Cで示されます。図 2Bに隣接するモニターから電気的なノイズの例と信号収集の失敗を示します。我々 はまたビデオ脳波記録 (図 2E) の 2 週間の間に自発的な発作を示し、皮質の損傷は、灌流、おそらく過度に深層から派生した偽操作動物の脳波痕跡を実証硬膜外ネジ (図 2D)。

図 1: SE のピロカルピン誘導後、海馬における神経細胞死。7 日間 (A) のグループとピロカルピンまたは生理食塩水投与後 6 週 (B) から代表的なイメージ。拡大画像表示(、 j)門部 CA1 サブフィールド (b, k) と CA3 サブフィールド (c, l) 偽の生理食塩液投与群、門部 (d, m)、CA1 サブフィールド (e, n)、CA3 サブフィールド (f, o) SE グループの門部 (g)、CA1] サブフィールドのヘッダー (h) と、 g、およびjの SE 黒矢印を開発しないマウスの CA3 サブフィールド (私)代表的な肺門部細胞の一部を示し、 dとmで矢印を示す異型細胞。下部にあるスケール バー左側 = 200 μ m、左ほとんどの列のスケール バー全体の有効な a と c = 20 μ m、全体の中央の列と右の列の有効な。この図では省略形: CA1、CA3: コルニュ Ammonis 海馬サブフィールド。総局: 海馬歯状回。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: ビデオと脳波記録てんかんマウス自発的再発性発作を示しています。シャム - (top) から (A) 代表的な脳波をトレースと SE 操作動物 (下)。SE 受ける動物がてんかんスパイク活性を示すことに注意してください (≥ 3 Hz)、偽の動物がいない展示。(B) A 電気ノイズと信号収集の失敗の代表的なイメージ。高振幅ユニポーラ スパイク ・電気信号の廃止に注意してください。(C) の模式図マウスの脳に電極の場所。(D) 2 像そのままで、負傷した脳硬膜外ネジの過度に深い挿入のための皮質。右の画像の黒い矢印は、大脳皮質の損傷のサイトを示します。スケール バー = 250 μ m. (E) 代表的な脳波偽改変動物脳損傷の有無の痕跡。スパイク活動およびけいれん SRS 皮質損傷の動物の偽操作が生成されることに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

この仕事は、SE の誘導および慢性発作の評価に関する実験の手順を説明します。

いくつかの要因は、SE 導入に影響を与えます。ラシーンの規模に応じて正確な行動監視は、SRS の開発にとって重要です。頭うなずいて、前肢クローヌス、飼育と落ちるは、開発 SE フェーズ^4,16に急性発作の行動特徴。最初の運動発作が検出された後の痙攣の間隔の長さが減少に入る前に SE。また、行動の発作は、ジアゼパム⁵によって終了しない限り、SE を少なくとも 6 時間持続する必要があります。それは研究者がジアゼパム注射で沈静化に見える行動の発作も、活動は、electrocorticograms、を介して検出することができます発作の持続可能性に注意する必要があることは注目に値するです。SE 誘導が SE と動物の数を大幅に改善できるまでピロカルピン注射後周囲温度を増加しています。また、十分な水分補給、栄養サポート、および重量平均^5,18の約 70-80% よりも高い生存率の監視を含む集中の発作後のケアを提供することが重要です。動物の遺伝的背景によってピロカルピンに対する感受性が異なることがあります。動物は、高い死亡率と重症の急性発作を表示、ピロカルピン投与量、SE の期間、または増加したスコポラミンおよびテルブタリンの削減があれば役に立つ。深刻な SE は高い死亡率と SRS のより高いに関連発生率として知られているこれらの要因を考慮することが重要です。海馬神経細胞死は、SE 後一貫して観察されます。6 h のポスト-SE、肺門介在ニューロンの広汎な損失報告¹⁹きた。SE 後 7 日は、CA3 サブフィールドの錐体細胞は通常、死ぬし、錐体細胞層の神経細胞の損傷の程度はマウスで変数に SE 導入後 6 週間で継続的に観測されました。海馬の CA1 サブフィールドの神経細胞の減少もよく観察できます。興味深いことに、動物を入力しない人複数の発作 SE を示したほぼそのまま海馬偽のグループに類似を示す組織学的細胞死が十分に深刻な急性発作の良いマーカーにすることができます。

SE 後約 4 週間ですべてピロカルピン投与 C57BL/6NHsd マウスにてんかんになったし、示した SRS、デモの主要なメリットはこのモデルを使用します。慢性的な発作がクラスター化されているのでビデオ脳波記録すべき継続的に、断続的にではなく、少なくとも 2 週間にもかかわらずマウス系統や実験目的¹⁷によって録音期間を変更できます。また、TLE の自然発作午後の後半²⁰SRS 高頻度を示す日内変動があります。実質的に、正確なビデオ脳波記録のため AC ライン、コンピューター、カメラ、または隣接する受信機のマウスに移植の送信機を含むすべてのソースをブロックする必要があります。昼と夜の間にファラデーケージと高い感度を持つカメラのインストールは、電気的なノイズを減らすことができ、一般化された慢性的な発作をそれぞれ識別するのに役立ちます。最後に、硬膜の表面にネジを配置するように誤解を招くの脳波データを生成することができるときに脳の損傷を避けるために非常に重要です。SRS の周波数は高くない強制スクリュー刺入による機械的皮質怪我はわずか 1 週間で痙攣を生成でした。

結論としては、モデリングおよび実行する詳細な訓練の要件に対する制約がインプラント手術と脳波解析時間にもかかわらずピロカルピン誘導 SE は現在利用可能な動物の間で慢性的なてんかんを勉強するための最高のモデルの一つはTLE のモデル。ここでは、無線テレメトリー ビデオ脳波を用いた慢性発作の評価ピロカルピン注射後誘導 SE の手法について述べる。このプロトコルは慢性てんかんとてんかんの適切な動物モデルの詳細情報を提供できると考えています。

著者が明らかに何もありません。

この作品は、韓国政府 (NRF 2014R1A1A3049456) によって資金を供給された国立研究財団の韓国 (NRF) 付与と韓国健康技術 R & D プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI) からの助成金によって支持されました。韓国 (HI15C2854) 福祉厚生省によって資金を供給しました。