製作手順と磁気応答性ランタノイド イオンのキレート リン脂質アセンブリを設計するための複屈折測定

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

Method Article

製作手順と磁気応答性ランタノイドイオンのキレートリン脂質アセンブリを設計するための複屈折測定

DOI:

10.3791/56812

⸱

January 3rd, 2018

Stéphane Isabettini¹, Mirjam E. Baumgartner¹, Peter Fischer¹, Erich J. Windhab¹, Marianne Liebi², Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

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要約

高磁気応答性希土類金属イオンのキレート polymolecular アセンブリの製作手順が掲載されています。磁場に対する応答は、ナノ細孔膜間押出しによる合わせたアセンブリのサイズによって決まります。アセンブリの磁気無順序と温度誘起構造変化は、複屈折測定, 核磁気共鳴と中性子小角散乱に無料技術によって監視されます。

要約

膜は、多種多様な脂質の混合物から形成される可変のディスクのような polymolecular のアセンブリです。アプリケーションの範囲は、核磁気共鳴 (NMR) による膜タンパク質の構造研究から光学活性と磁気切替可能なゲルの形成を含むナノテクノロジー開発です。このようなアセンブリのサイズ、磁気応答と熱抵抗の高いコントロールが必要です。1, 2 の混合物-dimyristoyl -sn- グリセロホスファチジン-3-phosphocholine (DMPC) とそのランタニドイオン (Ln^{3 +}) キレートリン脂質共役、1, 2-dimyristoyl -sn- グリセロホスファチジン 3 リン酸エタノールアミンジエチレング triaminepentaacetate (DMPE-DTPA)、DMPC/-ln/DTPA による^{3 +}など高い磁気応答性アセンブリにまとめる (モル比 4:1:1) 膜。コレステロール (哲-オハイオ州) と 2 層でステロイド誘導体の導入は、固有の物理化学的性質を提供するアセンブリの別のセットの結果します。特定の脂質組成の磁気無順序は bicelle サイズに比例します。Ln^{3 +}の錯形成反応の大きさと配置の両方の方向の点で前例のない磁気応答の結果します。暖房時に小胞にディスクのような構造の熱可逆性崩壊によりメンブランフィルター定義された細孔径間押出しによるアセンブリの寸法の仕立てができます。磁気整列膜、小胞前駆体によって定義されたアセンブリ寸法で 5 ° C に冷却することにより再生されます。ここで、この作製手順を説明し、アセンブリの磁気無順序は 5.5 T の磁場下における複屈折測定によって定量化されます。複屈折の信号リン脂質二重膜からは、さらに 2 層 polymolecular の変化を監視できます。この単純な手法は膜の特性によく採用されている NMR 実験に補足であります。

概要

膜は、多数の脂質の混合物から得られたディスクのような polymolecular のアセンブリです。¹^,²^,³^,⁴^,⁵広く使用されます膜の生体分子の構造解析の NMR 分光法による。⁶^,⁷ただし、最近の取り組みが可能なアプリケーションのフィールドの拡大を目指してください。⁵^,⁸^,⁹最も研究の bicelle システムは、1, 2 の混合物から成る-dimyristoyl -sn- グリセロホスファチジン-3-phosphocholine (DMPC)、アセンブリ、および 1, 2 の平面な部分-dihexanoyl -sn- グリセロホスファチジン-3-phosphocholine (DHPC)リン脂質は、エッジをカバーします。¹^,²^,³膜を構成するリン脂質の分子幾何学は、polymolecular の自己組織化構造の建築を指示します。⁴^,⁵による DTPA と交換 DHPC 高磁気応答性と調整可能な bicelle システムを生成します。¹⁰^,¹¹ DMPC/-ln/DTPA による^{3 +} (モル比 4:1:1) 膜強化磁気応答の結果、膜の表面に多くより常磁性希土類金属イオン (Ln^{3 +}) を関連付けます。¹⁰また、希釈耐性膜の形成による DTPA/Ln^{3 +}と DHPC の水溶性分子を交換します。¹¹

平面 polymolecular アセンブリの磁気無順序は彼らの全体的な磁気エネルギーによって決定されます。

figure-introduction-1327 (1)

B が、磁場の強さ、 figure-introduction-1436 磁気定数、n 集計数と figure-introduction-1512 、膜を構成する脂質分子の反磁性帯磁率異方性。したがって、磁場に対する DMPC/-ln/DTPA による^{3 +}膜の応答はサイズ (集計番号 n) および分子磁性磁化率異方性 Δχ で合わせています。後者は容易にキレート Ln^{3 +}の性質を変えることによって行われます。¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵紹介コレステロール (哲-オハイオ州) や 2 層他のステロイドの誘導体は、集計番号 n とアセンブリの帯磁 Δχ チューニングの可能性を提供しています。¹¹^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹特定の脂質組成の大きいアセンブリを含めるより脂質 E_マグ(集計数 n が大きいほど) に貢献できるより整列種の結果します。DMPC/DHPC 膜のサイズはたとえば、従来構成脂質の比率または合計濃度の最適化を通じて制御されます。²⁰^,²¹^,²²これは DMPC/-ln/DTPA による^{3 +}膜可能ですが、提供を加熱すると小胞へ bicelle からの熱可逆性転換は仕立てオプションを追加しました。機械は、メンブランフィルター押出により、小胞の形成などを意味します。5 ° C に冷却される磁気整列の膜が再生され、小胞前駆体からの寸法を決定します。¹¹ ・・・、我々に焦点を当てると DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}機械加工手順の可能性 (モル比 4:1:1) または DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) 参照システムとして。その他 Ln^{3 +} Tm^{3 +}よりもを使用するとき、プロセスはおおむね正確に働きます。これらの技術によって提供される可能性の広い範囲が図 1に強調され、広く他の所で議論。²³

figure-introduction-2904
図 1: 可能な製作手順の図式的な概観します。調査磁気整列 Ln^{3 +}キレート polymolecular アセンブリのいずれか DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}で構成されています (モル比 4:1:1) または DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5)。PH 値 7.4 の 50 mM リン酸緩衝と乾燥脂質膜が水分補給し、総脂質濃度は 15 mM。脂質膜の効果的な水分補給が必要か凍結融解のサイクル (フィート) または加熱・冷却サイクル (H & C)。H & C サイクルが最後フリーズの分解の手順の後のサンプルを再生成するか、またはさらに押出成形せずに使用する場合、時間の長時間にわたって凍結保存試料を再生成する必要。これらの手順は、Isabettiniらに広く議論されています。²³最大限に整列 polymolecular アセンブリを実現、脂質組成に基づく別のアセンブリのアーキテクチャを提供します。Bicelle サイズと磁気無順序ナノ細孔膜フィルター (Ext) 間押出しによる可変です。提示された線形要因 A_fは 800、400、200、100 のいずれかを通して押し出さ DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) サンプルの 2次元小角中性子散乱 (SAN) パターンから計算された nm 毛穴。SANS の測定、詳細はここでは扱いません bicelle 配置の定量化の補完的な手段です。¹¹^,¹⁶ A_f -1 (並列中性子散乱または磁場方向に対する膜の垂直配置) から等方散乱の 0 の範囲します。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。

膜の構造は、解析技術の広い範囲で幅広く研究されています。¹³磁場にさらされる膜の配置は、NMR 分光法又は小角中性子散乱 (SAN) 実験のいずれかを使用して定量化されています。⁵^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁴^,²⁵ただし、shift キーを押し Ln^{3 +}の存在下で発生する NMR ピークの広がりは深刻な制限メソッドに。¹⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸が SAN 実験に苦しむしないこの制限、代替、ソリューション内のアセンブリの磁場誘起配向のルーチンの定量化のために望ましいより使いやすいテクニックです。複屈折測定可能な比較的簡単な代わりであります。NMR 実験に同様する複屈折測定では、脂質の語順換えおよび 2 層で発生する脂質段階に関する貴重な情報を明らかにします。また、温度などの環境条件を変更すると polymolecular アセンブリの幾何学的な変化が監視されます。¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶磁気誘導複屈折 Δn′ は、リン系の様々な種類を勉強する使用されています。¹³^,²⁹^,³⁰磁場下における位相変調法を用いた複屈折測定は、膜の向きを検出するための現実的な方法です。¹²^,¹⁶^,¹⁸^,²⁹^,³¹^,³² 35 T までの高磁場下における複屈折膜の調査の可能性 m. Liebiらによって示したも¹³

偏光異方性材料が入ったら、普通と異常な波で屈折します。¹¹ 2 つの波は別の速度がある、位相差 δ によって段階にシフトされます。位相差 δ の程度を測定し、複屈折信号に変換 figure-introduction-5721 材料を用いた異方性の度合いを定量化するには

figure-introduction-5836 (2)

λ ある波長レーザーと d は、試料の厚みです。リン脂質は、光学異方性とその光軸の長い分子軸は、炭化水素の尾に平行と一致しています。¹¹^,¹²位相差計測されますないリン脂質はソリューションでランダムに配向されています。リン脂質は、互いに平行に並んでいる場合、遅滞は測定されます。磁気誘導複 figure-introduction-6136 磁気フィールドに、分子の方向に応じて正または負の符号を持つことができます図 2を参照してください。負の x 軸に平行にリン脂質になります figure-introduction-6299 、肯定的な z 軸に沿って整列それら結果 figure-introduction-6384 。光軸が y 軸に平行に配置されます、リン脂質、光の伝搬方向と一致する場合は複屈折認められなかったです。

figure-introduction-6563
図 2: リン脂質と磁場誘起複屈折の対応する記号の配置 figure-introduction-6693 .測定の記号 figure-introduction-6791 磁場下におけるリン脂質の向きによって異なります。破線は、分子の光軸を示しています。光は 45 ° で偏光し、y 方向に伝達します。磁場 B は z 方向です。この図は、M. Liebi から変更されています。¹¹ この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

膜の異方性のコロイド分散液、場合、膜リン脂質の配置による配向は失われ、位相差 δ をゼロになります。膜は、偏光の位相差 δ を引き起こして、その膜の光学活性なリン脂質をオリエンテーションするためにも揃える必要があります。その結果、複屈折は、polymolecular アセンブリの磁気無順序を定量化する敏感なツールです。配向膜磁場に対して垂直に行えば、肯定的な figure-introduction-7319 、平行にこれらの否定的な利回りが figure-introduction-7400 。サインはセットアップの配置に依存し、参照サンプルでチェックすることがあります。

プロトコル

1. DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}施工 (モル比 4:1:1) と DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) polymolecular アセンブリ

予備の準備
1. 一度エタノール安定・クロロホルム洗浄フラッシングによってすべてのガラス (> 99% クロロホルム) と圧縮空気で乾燥。
2. 2 個別 10 mg/mL 原液 DMPC と DTPA によるクロロホルムのエタノール安定を生成 (> 99% クロロホルム)、クロロホルムのエタノール安定哲-オハイオ州の 10 mM 在庫ソリューション (> 99% クロロホルム) と 10 mM の原液に都民₃メタノール。
3. 0.121 g ナトリウム二水素リン酸塩二水和物と無水ナトリウムの 0.599 g 超純水 H₂o. の 100 mL の水素リン酸を混合することによって pH 値 7.4 の 50 mM リン酸バッファーを準備します。
乾燥脂質膜の作製
1. 2.5 mL のガラス製注射器で別 3 mL ガラススナップカップに両親媒性物質 (DMPC による検査、必要に応じて哲-オハイオ州) および Ln^{3 +}原液必要量重量を量る。
  1. DMPC/による造影の 3 mL サンプルボリュームの/Tm3 + (モル比 4:1:1、総脂質濃度 15 mM)、DMPC 原液による DTPA 原液と都民₃原液 0.7126 g 1.4731 g 3.6435 g の重量を量る。
  2. DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5、15 mM の総脂質濃度) の 3 mL サンプルボリュームの 0.7126 g の哲ああ原液の 1.0749 g、1.4731 g による DTPA 原液の DMPC 原液の 2.9148 グラムの重量を量る都民₃原液。
    注意: クロロホルム、メタノールは有毒、常温で揮発性です。ヒュームフードの下で動作し、速やかに質量測定を続行します。
2. 25 mL の丸底フラスコにスナップカップの内容を転送します。対応する溶剤の約 2.5 mL の丸底フラスコに各スナップカップをフラッシュします。
3. 40 ° C で回転蒸発器の真空下で溶媒を除去します。初期圧を 30 000 に設定 Pa 溶剤のほとんどが削除されるまで。圧力を 100 に減らす Pa とドライ 2 h の最低の回転の下でサンプルフラスコのガラス壁に均一乾燥脂質膜を得る。
4. 空気中の脂質酸化を回避し、水分補給する前に冷凍庫にサンプルを格納するアルゴンの着実なストリームの下 1 分乾燥脂質膜を配置します。
乾燥脂質膜の水和
1. 15 mM の総脂質濃度に到達する丸底フラスコに 3 mL のリン酸バッファーを追加します。
2. それは (沸騰液体窒素停止)、完全に凍結し、加熱するまで液体窒素中での回転の下でフラスコを突っ込むことにより凍結融解 (フィート) サイクルを行うに継続的に、フラスコを渦巻く水のお風呂に 5 分のサンプルを置くことによって 60 ° C までをバックアップします。溶融プロセスを支援します。30 の適用サンプルが液体脂質膜の水和を支援するために各冷凍サイクルの前にボルテックスの s。
  注: 脂質膜がない表示されますフラスコの壁に 2 つ目凍結融解サイクル後。
3. 1.3.2 を合計 5 回繰り返します。リン酸バッファーの不要な蒸発を避けるためサンプルが熱いときにキャップフラスコを閉じます。サンプルが固定されるプロトコルを一時停止する場合があります。
4. 2 つの加熱と冷却に進みます (H & C) 凍結最後出てくるサンプルを安定化または最大 2 ヶ月間凍結を維持するサイクル。DMPC/による DTPA/Tm^{3 +} 40 または 60 ° C にサンプルの熱 (モル比 4:1:1) または DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5)、それぞれ、1 ° C/分で 5 ° C に冷却する前に維持するためサンプルの最大値と最小 5 分サイクルの温度。
5. 今、いずれか (ステップ 2) の外部磁場中試料の複屈折信号を決定するまたは bicelle 寸法と磁気無順序 (手順 1.4) に合わせてサンプルをさらに押し出します。
  注: DMPC/による DTPA/Tm^{3 +} (モル比 4:1:1) のサンプル、主に 70 の平均流体力学的直径 D_H膜の 5 ° C で動的光散乱 (DLS) の測定から得られる nm 番号分布によって明らかにされました。これらのサンプルはまた 500 の平均 D_Hより大きい polymolecular アセンブリを含む nm 強度分布によって明らかにされました。DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) のサンプルは非常に明らかに平均 D_H 700 の典型的な強度分布を持つサイズの多 nm、数の分布が小さいによって支配される人口を明らかにしながら200 のサイズの範囲で膜 nm。詳細なサイズ分布とこれらのサンプルの低温電子顕微鏡透過電子顕微鏡像は、Isabettiniらによって報告されています。²³
Polymolecular アセンブリの押し出し。
1. 図 3に示すように、押出機を組み立てます。手袋やピンセットを使用し処理用石英管を保護します。ろ紙 (5) を (6) メンブレンフィルターの最適配置を可能にするバッファーの数滴にぬれます。紙の上に o リング (7) を配置した後ひだを持たないことを確認します。
  注: 押出成形プロセスは、800、400、200、100 の孔径膜フィルター (6) でテストされた nm;図 7を参照してください。
2. DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}のための 40 ° C に風呂の水を設定 (モル比 4:1:1) サンプルまたは DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) サンプル extrudable 小胞の形成を保証するための 60 ° C。
3. 高圧ポリ塩化ビニール管を用いた加圧窒素瓶に押出機を接続 (> 4 MPa) serto アダプターを搭載し、膜を通して液体材料を押し出します。圧力 1 MPa、200 の孔径のメンブランフィルター (6) 押し出しの通常必要な nm 以上。1.5-2.5 MPa が必要小さい膜フィルター (6) 孔径 100 nm。
  注: 膜フィルターを変更は、場合異常高圧 (> 2.5 MPa)、(これは目詰まりの最初の兆候) サンプルを押し出す必要。
4. カバー (10) を開き、2 mL ガラスピペットを使用してサンプルを挿入します。その後、カバー (10) を閉じて、サンプルアウトレットチューブ (2) を押しながら圧力弁 (12) を開きます。プレッシャーバルブ (12) 押出成形サイクルが完了した後、口を閉じて次のサイクルを続行します。
  注: 長すぎると蒸発によって過剰なサンプルの損失を避けるためにホットジャケット容器 (8) 連絡先のサンプルを放置しないでください。

30-60 s は圧力弁 (12) を開く前に、押出機で平衡に 3 mL のサンプルは十分な時間です。

図 3に示すように、与えられた膜細孔寸法 10 押出成形サイクルに進んでください。ほとんどの bicelle システム 10 回 100 の孔径膜を通して 200 と別の 10 倍の孔径膜を通して押し出されますサンプル比較可能性を保証する nm。

(ステップ 2) の外部磁場中試料の複屈折の信号を確認します。

figure-protocol-3968
図 3: 研究所押出機 bicelle と小胞の準備に使用します。押出機を下から組み立てられる: マウント (1)、(2) サンプル (8) ジャケット容器 (7) o リング、(6) 膜フィルター、2.4 mm (内径) プラスチック排水チューブ o リング、(3) と (4) 大小の安定メッシュ (5) フィルターペーパー空間を収集 (9。) (12) 圧力弁 (11) 蝶ネジ、(10) カバー入口および圧力接続トップカバーします。右のサイドの組み立ての押出機のスケッチが表示されます。窒素 (N₂) は圧力容器によって指定され、温度制御のための水のお風呂に外周 (9) が接続されています。サンプルは、任意の与えられた膜フィルター孔径 (青で示されているパスのサンプル) 10 押出成形サイクルを経る。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

2 DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}複屈折測定 (モル比 4:1:1) と DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) polymolecular アセンブリ。

構築し図 4に示すように複屈折セットアップを接続し、それぞれの電子素子に電源を供給します。置かないでください PEM、サンプル、および第 2 の偏光レーザーの経路にこの段階で。反映の表面、たとえばアルミミラーホルダー、黒い紙で覆うことによって後方散乱光の検出を避けるため。
直流電流の強度によって表される検出器ではレーザーの強度を最大限にミラーを調整図 4 bでローパスフィルターから得られます。
注意: ミラーを調整するときに、適切な眼の保護を着用初めてレーザーを操作する場合、レーザー安全インストラクターと相談してください。
最大限に最初交差の直線偏光子 (入射レーザー光を垂直に維持) をオンに、。

figure-protocol-5319
図 4: 複屈折のセットアップおよび光信号の接続の概略図。A)超伝導電磁石は、5.5 T の磁場を提供します。635 でダイオードレーザーからの光 nm が 2 つ交差偏光板によって偏波します。光弾性変調器 PEM 90、50 KHz で動作し振幅₀ 2.405 rad の偏光フィルターを 2 つの間に配置。サンプルは、PEM と 2 つ目の偏光板の磁石であります。非偏光ミラーは、さまざまな要素を光を導く、光検出器で検出は最終的に。最初と 2 番目の高調波 figure-protocol-5680 と figure-protocol-5748 の AC 信号を監視する Ln^{3 +} polymolecular アセンブリをキレート磁気無順序で情報を与えて複屈折信号の計算を許可します。サンプルのキュベットは、温度制御 (青) の外部水風呂に接続されます。サンプルの温度は、温度プローブ (赤) で監視されます。B)光検出器からの信号は、± 12 V DC 電源供給バラケませんケーブル (3) を 360 Hz のカットオフ周波数を持つ 2 次 Sallen キーローパスフィルター (24 V AC 電源) に供給されます。ローパスフィルターは DC 成分を抽出 figure-protocol-6106 し、BNC 50 Ω ケーブルを介して PC インターフェイス (4) に配信します。光検出器からの信号は 2 つのロックインアンプに配信 (最初と 2 番目の高調波を抽出する figure-protocol-6260 、 figure-protocol-6329 ) BNC 50 Ω ケーブル (1) & (2)。高調波の強度は、位相敏感検出によって検出されます。その結果、PEM 信号は (1 階 - 最初のロックインアンプに PEM および第二に 2f 出力の出力ケーブルの接続、BNC 50 Ω) ロックインアンプの基準信号として使用されます。出力信号は BNC 50 Ω ケーブルを介して PC インターフェースユニットに配信されます。アナログ集録ユニット cFP-AI-110 と cFP CB 1 を監視するための rs-232 ケーブルを介してコンピューターに転送される信号をデジタル化します。K タイプ温度プローブは、アナログ集録 3 号 cFP CB 機と cFP TC 120 は、監視するための rs-232 ケーブル経由でコンピューターに転送する前の信号をデジタル化 PC インターフェースユニットにも接続されます。C) B. キー要素でスケマティックのセットアップの写真は 1 から 4 に対応する番号で示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4 aに示すように、入射レーザー光に垂直な 2 番目の交差した直線偏光子を配置します。最小限に抑えるため、最初に対して 90 ° の角度で 2 つ目の偏光板を設定することによって。
2 つの交差した直線偏光板と垂直入射レーザービーム図 4 aに示すように間 0 ° 光弾性変調器 (PEM) の場所。図 5 aに示すように 50 kHz と 2.405 rad に A0 振幅の周波数に PEM を調整します。これは DC コンポーネントを複屈折とブーストの独立して、。
注: 定数を維持するために、数度の PEM の光軸に調整されるかもしれません任意のサンプルを測定する前に空気で。
レーザーおよび電子機器の信号を安定させるために電源を入れた後 1 時間待ちます。

信号は、一定のまま自動位相ロックインアンプの後に安定しています。

パス長 10 mm で温度制御された石英キュベット内サンプルを置き、最初に 5 ° C で設定外部水浴に接続

サンプルの温度を監視するサンプルに直接 0.5 mm 厚タイプ K 熱電対 (温度プローブ) を配置します。プローブが (後でキュヴェット) レーザーの経路にホワイトペーパーを置き、プローブによって引き起こされる影を探してのレーザー光と干渉しないことを確認します。
注:、風呂の水の温度記録と試料の温度差 2 ~ 3 ° C があります。

図 4 aに示すように、磁石の穴にキュヴェットを配置します。レーザー光は、非偏光ミラーによって偏向は、光検出器で検出されたサンプルを水平方向に伝播します。
注: レーザーは、ファラデー効果 (すなわち、反対方向に出ても下りが取り消されたとき、磁場による光の偏光面の回転) のために、ダウンサンプル、同じパスをバックアップを使用されます。

部屋の温度と 10000 で圧縮空気の定常空気流を適用、信号の強度を減らすと、ノイズを増加させる細胞壁上の水の凝縮を避けるためにキュヴェットの Pa。5 ° C で測定するとき、これは特に重要です。

最初と 2 番目の高調波を検出 figure-protocol-8286

と

2 つのロックインアンプの AC 信号の。自動ロックインアンプを図 5 bに示すように (2) のボタンを押すことによって相し、図 5 b (1) に示すように感度を調整します。信号のオーバーロードを避けるために図 5 b (3) で示すように、アンプに 4 つ以上の赤いバーがないことを確認します。図 5 (8) に示すように、プログラムTesla_Magnet_Const_V092で両方のロックインアンプの採用の感度を書き留めます。プログラムは、補足情報として提供されます。

図 5 (5) に示すように、 Tesla_Magnet_Const_V092プログラムを通じて磁石に電流を供給することにより 5.5 T まで磁場をランプします。

複屈折を取得

方程式 2、遅延で計算されます。
figure-protocol-9030

(3)
どこ

と

最初の種類のベッセル関数は、 figure-protocol-9258

、

。¹¹^,¹³^,¹⁸^,³³^,³⁴は、図 5 (4) に示すように、 Tesla_Magnet_Const_V092プログラムの遅滞をプロットします。
メモ: 2 つのロックインアンプ、同じ感度で動作していない場合、複屈折信号を計算するプログラムによって提供される遅延を使用できませんする必要があります (手順 2.12 参照)。ログに記録された高調波強度 figure-protocol-9785

と

に正しいサイズを取得するロックインアンプの感度が乗算されますが。また、マグネットフィールド下で測定した複屈折信号は 0 t 得られた平均複屈折信号を減算することによって正規化する必要があります。

サンプルの複屈折信号定数または温度 (1 ° C/分) を図 4に示すようにキュベットに接続されている風呂の水の温度を調整することによって変更を監視します。

(9) のファイル名を指定して (10) ログ開始」ボタンを押して記入図 5 (8) の実験の説明で実験データを記録します。

figure-protocol-10305
図 5: 雇用の設定、プログラムのスクリーンショットのイラスト。A) PEM 設定: 遅滞 2.405 rad、波長 635 nm の, 周波数 50 hz ホワイトサークルを示すアクティブにする設定 (USR ユーザー定義遅滞、LOC を = = 操作のローカルモード)。B)ロックインアンプの設定。感度 (1) 必要に応じてステップ 2.11 に各測定の前に選択するがあります。信号のオーバーロードを避けるために表示 (3) 上に赤いバーが 4 つ以上があるないはずです。オーバーロードは、測定は不可能、赤色 (1) led が点灯したときに発生します。すべての測定の前に自動フェーズボタン (2) を押します。C) Tesla_Magnet_Const_V092補足情報として提供プログラムのスクリーンショット。プログラムには、磁気フィールドの制御と信号を時間の関数として出力すべての録音ができます。磁場の強さとサンプル温度は (1) でプロットされます。最初と 2 番目の高調波 figure-protocol-10918 と figure-protocol-10986 2 つのロックインアンプによって測定される AC 信号の (2) でプロットされます。直流電流の強度 figure-protocol-11104 (3) でプロットされます。遅延は、2.13 の手順で説明するように計算され、(4) でプロットします。磁場強度は、(5) に設定されています。K 型熱電対によって記録された温度の直接測定は、(6) で表示と出力信号 ( figure-protocol-11279 、 figure-protocol-11356 ) (7)。その他のサンプルについては、増幅器、サンプル名、等の採用の感度など (8) 挿入されるかもしれません。データを記録され、(9) で提供される .txt ファイルにエクスポートされた可能性があります。起動し、ログ開始」ボタン (10) でデータ集録を停止します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

結果

非押し出し DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}複屈折信号 (モル比 4:1:1) 冷暖房サイクル 5 から 40 ° c、1 ° C/分 (図 6) のレートで 5.5 T の磁場中観察したサンプル。複屈折の結果は、1.5 倍の報告された押出成形システムにも強い、10^-5倍の値で 5 ° C で高磁気線形を確認しました。⁶^,⁷^,²³は、非整列の小胞の形成によって引き起こされた 24 の ° C で DMPC の T_m以上複屈折信号のゼロします。液体の無秩序相の運動の外観には、polymolecular アセンブリの主要な再編成がトリガーされます。これらの再配置は、熱可逆性です。T_m以下で冷却時に再生した整列種と複屈折の信号は、加熱と同じ傾向を辿った。T_m周りに発生する明確なピークは、非整列の小胞によって整列アセンブリの交換をマークします。²³応用加熱と冷却 1 ° C/分の速度に関して分子語順換えの遅い速度は、ピークが重複していない理由について説明します。代わりに、両方のピークは二分子膜脂質必要がありますある程度整列種の形成を支持するための示唆 DMPC の T_mで開始。

figure-results-829
非押し出し DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}温度の関数として図 6: 複屈折信号 (モル比 4:1:1) サンプル (赤) を加熱と冷却 1 ° C/分 (ブルー)サンプルでは、プロトコルの手順 1 に 1.3.5 が用意されていた。複屈折測定は、次のプロトコル手順 2 を実施しました。磁場強度は 5.5 T 最大傾斜し、サンプルが 5 °、加熱と冷却のサイクルに進む前に 10^-5 x 1.5 の複屈折信号を達成するために保たれました。ない配置サンプルとして観察された 35 の ° C の上の温度で複屈折信号総司令官だった小胞のみで構成されます。冷却時に、膜が再生したし、5.5 T と 5 ° C で 10^-6 x 7.2 の最終的な複屈折信号を達成しました磁場強度は 0 T にランプアップし、サンプルは 5 ° C で維持されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +}(モル比 16:4:5:5) サンプル次の加熱ハイドレイトされましたと 1.3.4 をステップでプロシージャを冷却し、別孔サイズの膜フィルターを 60 ° C で 10 回押出後、1.4 の手順を参照してください。60 ° c、脂質混合物は押出成形プロセスによって形作られる小胞にアセンブルします。¹⁶^,³⁵^,³⁶^,³⁷押し出しを完了すると、膜が 5 ° C に冷却することにより再生成された、DLS により流体力学的直径 D_Hを測定しました。8 T での san A_fを計算することによって、5.5 T; で複屈折の信号を測定することにより、膜の磁気無順序は 5 ° C で評価しました。図 7を参照してください。複屈折の信号は、図 7Aのように、5.5 T までと 0 T までフィールドを変化させることによって得られました。ピークの複屈折は、最高度の配置の 1 の方程式によると期待されていた 5.5 T で発生しました。91、106、190 220 に、膜の流体力学的直径 D_Hが減った 800、400、200、100 の細孔径を持つ膜を通して連続押し出しで nm nm それぞれ。磁場配向の対応する減少されたゼロの図 7 bに接近_f減少の複屈折信号と絶対値の減少によって確認されました。結果は bicelle サイズと 60 ° C での押出によって、小胞の仕立て、5 ° C に冷却して磁場配向制御の可能性を確認しました。

figure-results-2501
図 7: 様々な細孔寸法の膜フィルターを通して押し出さ DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 16:4:5:5) サンプルの磁場配向。A) B 800 nm の細孔を通して押し出さサンプル上下ランプの磁場強度の関数として複屈折信号 Δn′。式 1 に従い 5.5 T でピーク複屈折に達しました。この最大複屈折値を報告B).同じサンプルは 400 nm 毛穴から押し出されます。磁場配向評価 (同様に A の前の押出成形の手順をやった) 5.5 T で両方の複屈折測定 (黒い正方形)、_f (赤丸) で 8 T の関数としてプロット配置要素の計算、流体力学的直径 D_H DL_.によって得られる磁場配向は、200 nm 毛穴と 100 nm の細孔を通して押し出し後 1 つの最後の時間を通して押し出さ同じサンプルで同様に評価しました。5 ° C ですべての測定を行ったこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

複屈折測定された SAN との組み合わせで使用する方法の詳細な説明は、高磁気応答 Ln^{3 +}アセンブリは Isabettiniらリンをキレートを生成するための方法を評価する実験します。²³提案作製プロトコルは、や、膜ステロイド誘導体化学エンジニアリングを含む、長い DPPC とヒドリド錯体を用いたリン脂質から成るアセンブリに適用されるも。¹¹^,¹²^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹唯一の要件、サンプルが十分に高温に加熱されるの手順 1.3.2、1.3.3、1.3.4 および 1.4.2。温度は、乾燥の脂質膜またはサンプル再生の最適の水和を保証液体無秩序相を入力する膜脂質を許可しなければなりません。DPPC/ヒドリド錯体-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 4:1:1) アセンブリ、たとえば、類似 DMPC ベースシステムは 24 ° C 以上加熱する必要がありますしながら DPPC の相転移温度 42 ° c 以上に加熱する必要があります十分に高温も脂質二重膜は、1.4 の手順で乱れた状態時に発生する extrudable の小胞の形成を保証するために必要です。1.3.2 の手順で凍結融解サイクルを完全に H に置き換えられます可能性があります & C サイクル。²³サンプル完全にこの手順で脂質膜の水和物へのより多くの時間を必要とし、時 5 ° C、60 ° C で 2 分 20 分 vortexed をする必要があります。追加 H & 乾燥脂質膜の要素はまだフラスコのガラス壁に観察される場合、C サイクルが実施。

Tm^{3 +}キレート膜このプロトコルでは、磁界の方向に垂直なを合わせます。この配向方向は、Tm^{3 +}大正帯磁率から起きる。¹¹^,¹⁴ Dy^{3 +} Yb^{3 +}などの他の希土類金属イオンが適用されますも可能性があります。¹¹^,¹³^,¹⁹の Ln^{3 +}別の磁気異方性は、膜の磁場配向を仕立ての追加の手段を提供しています。たとえば、Dy^{3 +}磁場方向に平行の膜の配置の高度の結果、膜リン脂質の本質的に負の磁化率が向上します。¹³配向方向のこの変更が複屈折信号と異方性 2次元から計算された配置要素の符号に変化によって検出されたパターンの SANS。Ln^{3 +}の化学的性質によって、Ln^{3 +}のキレートの幾何学によって、帯磁、だけで決まるいないに注意することが重要だ-複雑なリン脂質。¹⁹^,³⁸合成別 Ln^{3 +}リン脂質 headgroups、結果として得られるアセンブリの磁気応答の定義をキレートし帯磁を設計する可能性があります。³⁸

すべてのサンプルは光学的採用構成脂質の性質によって異なります。温度の機能としてサンプルの濁度を監視、アセンブリの温度誘起構造変換を評価する相補的な方法です。これらの測定値は通常、分光光度計、磁場のない状態で行われますが監視レーザーの直流電流の強度 figure-discussion-1888 ここに提案するセットアップと磁場の存在下で同じ情報を提供しています。フィールド。¹¹^,¹⁶ DMPC/による-DTPA/Tm^{3 +} (モル比 4:1:1) のサンプルは、5 ° C で哲 OH 含む DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 +}(モル比 16:4:5:5) 同等よりより少なく通常混濁5 ° C の水に似ているサンプルは、一般的に磁場で整列ではありません。At 部屋温度、透明の両方のサンプル見て DMPC/による DTPA/Tm^{3 +} (モル比 4:1:1) サンプルは、膜および小胞間の移行段階と DMPC/哲-ああ/による-DTPA/Tm^{3 + に大きな同心円の穴が表示されます}(モル比 16:4:5:5) 膜。¹¹^,¹⁶^,²³ DMPC/による DTPA/Tm^{3 +}で小胞を膜の遷移状態 (モル比 4:1:1) 室温でサンプルの粘性の増加も伴います。2.11 の手順で右の感度を選択する困難をこの濁度の温度依存性の変更になります。5 ° C で濁ったサンプルの感度を調節して高すぎる、暖房のサンプルのより透過的な性質はアンプのオーバーロードを引き起こす可能性があります。また、非常に濁ったサンプルはノイズと信号の比率が大きく増加、複屈折測定に適さない場合があります。レーザー光は、検出するために、サンプルを通過できる必要があります。

非押し出しサンプルは、いつもより濁り、傾向がある冷蔵庫の中に短期記憶に集計します。それにもかかわらず、磁気応答のサンプルは H で再生容易に & C サイクル。非押し出しサンプルは、冷凍の状態では、容易に保存される場合も H で再生成 & C サイクル。押出成形サンプルを冷蔵庫に保管し、1 週間サンプルの準備の後で一般に測定します。液体または凍結状態で押し出しの種の長期貯蔵に関する研究レポートがないです。したがって、押出から取得したアセンブリのサイズ分布は、長期の保管を保証できません。

同様の bicelle システムにこれらの磁気整列平面アセンブリはのみ脂質組成と濃度の定義済みの範囲で存在します。脂質の比率を変更すると、ミセル、リボン、および小胞の形成を含む別のアセンブリのアーキテクチャになります。⁵^,¹¹^,¹⁶^,¹⁸^,²⁰リン酸緩衝溶液濃度と 1.1.3 の手順で pH、膜および磁気応答の形成に重要な役割を果たしています。バッファーは、polymolecular アセンブリを取り巻く親水性の環境を支配する物理化学的相互作用を定義します。高濃度サンプル集計と超過料金審査による降水を引き起こすしながら濃度バッファーは別のアセンブリのアーキテクチャで結果します。3 と 4 の間の pH 値を酸性条件下でによる DTPA/Ln^{3 +}の配位子として複雑なカルボン酸基がプロトン化です。これは、結果の集約とサンプルの沈殿物で観測された磁気応答性 polymolecular アセンブリの破壊。磁気応答の Ln^{3 +} polymolecular アセンブリより基本的な pH 値に向かって適度な抵抗があります。ただし、DMPC/による DTPA/Tm^{3 +} (モル比 4:1:1) 膜 pH 値 12.9 のミセルに分かれることが示されました。¹¹サンプルは、水道水または他の塩に決して公開する必要があります。他のイオンが邪魔、Ln^{3 +}キレート処理または電荷スクリーニングによるアセンブリの集計結果します。測定では、SANS バッファー用意しています D₂O の超純水 H₂o. 注 pH メーターの読み取りが 7.0 (7.4 の pD 値に対応する) ことではなく、1.1.3 ステップで説明したよう。

熱可逆性に加熱対象 polymolecular アセンブリで発生して、冷却サイクル構造の変換されます。したがって、5 ° C で最終的な複屈折信号は温度サイクルの前と同じにする必要があります。¹¹^,¹⁶複屈折信号が高い場合サイクルの後、サンプルは正しく再生成されません 1.3.4 の手順で。これは時間の長時間にわたって保存されているサンプルでよく発生します。後温度サイクル図 6に見られる低複屈折の信号は、実験のセットアップで問題を示します。最も一般的には、レーザー光路は、後方散乱または別のオブジェクトによって妨げられました。これは特に問題となるサンプルに直接挿入された温度プローブ (手順 2.8 参照) するレーザー光のダイレクトパスに干渉しないよう配置必要があります。邪魔光路の秋を引き起こす、 figure-discussion-4490 、ノイズの多い信号や複屈折-温度曲線に異常ピークが生じる。たとえば、図 6の約 35 ° C で加熱で発生するピークは、レーザー光のダイレクトパスに水冷チューブの拡大によって引き起こされました。複屈折の信号は、その時点以降から信頼できない場合があります。冷却曲線の一般的な形状は、通常は、5 ° C で得られた低複屈折信号は干渉によって引き起こされました。

このプロトコルを次の中から得られた複屈折値は絶対的ではなく、自分の中でサンプルを比較する使用されます。文献値との比較、参照システムと校正が必要です。たとえば、測定障害の兆候はセットアップの配置によって異なります、3.27 × 10^{− 9} T^{− 2}の定数の綿ムートントルエンでチェックすることがあります。³⁹^,⁴⁰

サンプルの磁場配向の変化から発生した複屈折信号は 2 層分子語順換えによって引き起こされる信号から切り離される場合があります。異方性 2次元 SAN から計算された配置要素磁場下で得られたパターンのみ polymolecular アセンブリの一括配置によって影響を受けています。2 つの方法は相補、複屈折信号への貢献の分離を許可します。提案の複屈折のセットアップは、外部の磁界への暴露とのサンプルの同時モニタリングを可能にするレーザービームを分割することによって完成されることが。磁場下におけるサンプルの複屈折の結果は、0 T、効果的に背景の会計でサンプルの得られた信号によって正規化可能性があります。

複屈折測定は、膜の磁場配向を定量化に限定されません。多数の柔らかい材料は、その内部構造の順序による複屈折信号を生成します。提案のセットアップは、外部磁界の有無と温度の関数としてこのような材料の複屈折を監視できます。アントラセン organogel 繊維、流れ、ナノ結晶セルロースやアミロイド Fe₃O₄線維の下の蠕虫状ミセルが複屈折現象を提案のセットアップを正常に行ったいくつかの例があります。²⁹^,³⁰^,³²^,⁴¹

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、SMhardBi (プロジェクト番号 200021_150088/1) を資金調達のためのスイスの全米科学財団をご了承ください。SAN の実験は、スイスの核破砕中性子源 SINQ、ポール・シェラー工業、Villigen、スイス連邦共和国で行われました。著者は温かみのある SAN 実験で彼の指導の博士ヨアヒム Kohlbrecher をありがとうございます。強磁場下での複屈折測定セットアップは、既存の強磁場磁性研究室で HFML、ナイメーヘン、オランダのセットアップから触発されました。博士ベルンハルトコラー継続的な技術サポートとレーザーの罰金と安易な配置を許可するフレームワークを構築するためのダニエル Kiechl 1 月コルサーノブルーノフィスター複屈折セットアップのエレクトロニクスの開発に彼の助けを感謝いたします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	-
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	-	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	-	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	-	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	-
Nitrile gloves	VWR	-
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	-	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	-	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	-	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	-
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator

参考文献

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