赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

質量分析（MS）のために、周囲のイオン化源は、過去10年間に多くの関心の対象となっています。マトリックス支援レーザ脱離エレクトロスプレーイオン化（MALDESI）は、このような方法の例であり、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）（ 例えば、脱着のパルス性質）及びエレクトロスプレーイオン化（ESI）（ 例えば、ソフトイオン化の特徴）合成されます。 MALDESIの主要な利点の1つは、その固有の汎用性です。 MALDESI実験では、紫外線（UV）又は赤外線（IR）レーザ共振内因性または外因性のマトリックスを励起するために使用することができます。マトリックスの選択は、分析物依存せず、励起に使用されるレーザー波長のみに依存します。 IR-MALDESI実験では、氷の薄層は、エネルギー吸収マトリックスとして試料表面上に堆積されます。 IR-MALDESIソースジオメトリは、液体試料の分析だけでなく、BIOLのための実験の統計的設計（DOE）を使用して最適化されていますogical組織標本。また、強​​固なIR-MALDESI画像源は、調整可能な中間IRレーザはコンピュータ制御XY並進ステージと高分解能質量分析計を用いて同期される場合、開発されています。カスタムグラフィカルユーザインタフェース（GUI）は、レーザの繰返し速度のユーザ選択を可能にする、ボクセル当たりのショット、試料ステージのステップサイズ、及び脱着の間の遅延とソースのイベントをスキャン数。 IR-MALDESIは、繊維と染料と生物組織切片のMSIの法医学的分析のような様々な用途に使用されてきました。内因性代謝物の組織切片内の外因性生体異物の範囲の異なる分析物の分布を測定し、この技術を用いて定量することができます。この原稿で提示プロトコルは、全身の組織切片のIR-MALDESI MSIのために必要な主な手順について説明します。

マイクロプローブモードでの質量分析イメージング（MSI）は、試料の表面上の別個の位置でのビーム（レーザーまたはイオン）によって表面からの試料の脱離を伴います。各ラスタ点で、質量スペクトルが生成され、取得されたスペクトルは、それらが収集された元の空間位置とともに、同時に試料中の多数の分析物をマッピングするために使用することができます。質量分析の感度と特異性に結合されたイメージングのこのラベルのない方法は、MSIは、質量分析^1,2の中で最も急速に進化する分野の一つとなって助けました。

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）MSI分析のために使用される最も一般的なイオン化法です。しかし、有機マトリックス及びMALDIの真空要件の必要性は、再現性、サンプルスループット、および方法を用いて分析することができる試料のタイプに重大な制限をもたらします。大気圧（AP）IO数nization方法は、これらの制限^3を回避するために、近年開発されてきました。これらの周囲のイオン化法は、それらの天然の状態に非常に近いと分析前の試料調製工程を簡略化環境において、生物学的試料の分析を可能にします。マトリックス支援レーザ脱離エレクトロスプレーイオン化（MALDESI）は、イオン化法^4,5の例です。

IR-MALDESI実験では、氷の薄層は、エネルギー吸収マトリックスとして組織表面上に堆積されます。中赤外レーザーパルス氷マトリックスによって吸収され、水の伸縮モード共鳴を励起OHによる表面からの中性物質の脱離を容易にします。直交エレクトロの荷電液滴に中性パーティションを脱着しESI状^4-6の後のイオン化されています。それが交流をするのに役立ちますので、外因性の氷マトリックスの添加は、組織内の内因性の水だけに依存よりも好ましいです異なる組織区画中の水分量の変動をカウントし、組織のイメージング実験において〜15倍^7,8によって脱着^6を高め、イオン存在度を改善することが示されています。

本研究では、新生児マウス全身で異なる器官全体の代謝物の分布を誘発するためにIR-MALDESI MSIを利用しています。 IR-MALDESI源の調整可能なパラメータの概要が与えられ、そして組織切片を正常に画像化のために必要なステップが示されています。

注：以下のプロトコルは、IR-MALDESI MSI実験を行うために必要なすべての手順について説明します。より綿密な最適化されたIR-MALDESI源の幾何学とレーザー、ステージとの同期、および質量分析計についての詳細は、別の場所で^5,6見つけることができます。このプロトコルで使用される動物の組織サンプルは、施設内動物管理使用委員会（IACUC）とノースカロライナ州立大学の規則に従って得ました。

1.組織標本

1. ドラフト内でドライアイスの二次容器内の清潔なビーカーに〜イソペンタンの200ミリリットルを配置することにより、イソペンタン/ドライアイス浴を準備します。イソペンタン/ドライアイス浴と組織を取り扱う際は、常に保護手袋及び安全ゴーグルを使用してください。
   1. アベルチン過剰投与によって2日齢の全新生児マウス子犬（7.5ミリグラム/ g体重）を安楽死させる、その後、組織構造を保存するためにイソペンタン/ドライアイス浴中で組織を凍結します。前洗浄を使用してくださいイソペンタン/ドライアイス浴からcryomoldにマウスの子犬を置き、削除する鉗子のエドペア。分析まで-80℃で急速冷凍組織を保管してください。
2. 保護手袋を使用して、40ミリメートルクライオスタットの試料ディスクに最適な切削温度（OCT）封入剤の層を適用します。ゆっくり切片のために所望の向きでディスクにマウスを接着するために10月コーティングされた試料ホルダーに凍結したマウス全体を配置します。
   注意：OCTは単に切片用試料ディスクの組織を接着するために使用されます。完全に10月中の組織を埋め込み、10月はMSI分析に有害な作用を有することが知られているように、過剰な回避しないでください。ゼラチンなどの他の媒体が^、9それをスライスする前に、組織を、埋め込 ​​み凍結するために使用することができます。
3. クライオスタットを押しペルチェ電源ボタンにペルチェ試料ホルダーに（10月および組織切片で）ディスクを置きます。試料が熱平衡に来るのを10分待ちます。
4. 組織は上に搭載されて（標本のディスクを置きそれ）ディスクホルダーの内側、およびダウン分析のための所望の平面に組織に直面しています。クライオスタット¹⁰の内部に収容された回転式ミクロトームを用いて、-20℃で所望の厚さの切片に組織をスライス。
   注：全身分析のために、組織の完全性を維持するために、25ミクロンの厚さの切片に組織をスライス。より小さな領域（ 例えば 、肝臓、脳、腎臓）のために、厚さ10μmのセクションに組織をスライス。
   1. ローリングからスライスした組織切片を防止するために、アンチロールガラス板を使用してください。不要な組織片を除去するために、クライオスタットの真空ホースとブラシを使用してください。組織が区分されたら、人身傷害を避けるために、鋭利なミクロトームの刃をカバーするためにブレードガードを使用します。
5. オリエントマウスの試料プレート上の部分と、それ^10に触れることなく、組織切片にできるだけ近いスライドをもたらすことによって事前に洗浄したガラス顕微鏡スライド上に解凍マウント。
   注：量的MSI experiについてメント、前に組織を取り付けるに自動化された空気式噴霧器を用いた内部標準とコートスライド、および解凍マウントコーティングされたスライド¹¹上の組織切片を。
6. ブレードエジェクタを用いて組織を切片に使用するミクロトームの刃を外し、安全に適切な「シャープ廃棄物」の容器にブレードを捨てます。
7. 組織の凍結保存を維持するために、ステップ3.2までクライオスタット内部のガラススライドを保管してください。

2. IR-MALDESI準備/校正

1. 中赤外レーザーをオンにして、コンピュータ上のレーザ制御アプリケーションを起動します。メーカーによって供給されたレーザ制御アプリケーションを使用して所望の波長を選択してください。 IR-MALDESI実験は、典型的には2,940 nmで行われます。
   注：最近の実験は、中間IRレーザ波長の依存性及び⁸の特定の分析物であると思われる留意違いが氷行列を調べました。
2. クワガタをオンにします電子コントローラは、カスタムユーザーコントロールプログラム（RASTIR）を起動し、ホームボタンを使用して、ステージの位置を調整します。
3. エレクトロスプレー溶液を調製します。典型的には、正のイオンモードでのエレクトロスプレー溶媒として0.2％ギ酸、50：50（v / v）のメタノール/水を用います。実験によれば、エレクトロ溶媒組成を選択します。例えば、負イオンモードでの撮像用途のためのエレクトロスプレー剤として5 mMの水酸化アンモニウムを使用します。
   注：極性切り替えIR-MALDESI MSIのために、改質剤として1 mMの酢酸を使用します。この修飾子は、ポジティブおよびネガティブイオンモード¹²の両方で安定した再現可能な信号を得るための最適な発見されました。
4. エレクトロスプレー溶剤で1mlシリンジを記入し、新しい溶媒でシリカキャピラリーをフラッシュします。
5. このようなESI-スポット距離、スポット入口距離、試料の高さ、および統計DOを使用して最適化されている溶媒の流量などのソースパラメータを使用して、MS入口を軸にESIエミッタを合わせます組織切片⁶の分析のために、E。注：これらのパラメータおよび組織切片のMSIのために最適化された値を示す概略については、 図1を参照してください。
6. エレクトロスプレーを開始し、この時点では、周囲の化合物のみから構成され、全イオン電流（TIC）を監視することにより、その安定性（> 10分）を評価。一般的に、10〜15分かけて10％<のTIC変動は安定性の良好な指標です。

図1. IR-MALDESI回路図とパラメータを設定します。（A）IR-MALDESIソースセットアップの概略図（正確な縮尺ではない）と調節可能なパラメータ。 （B）組織切片のイメージングのための最適化されたパラメータ値を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1. 注意：ステージ上にサンプルを配置する前に、エレクトロの電源をオフにします。
2. カメラビュー内のIR-MALDESIサンプルプレート上に解凍マウントされた組織を置きます。
3. 手がESIエミッタの明確であるとエレクトロを再起動していることを確認します。
4. 組織の表面上の水の凝縮を防止するために、乾燥窒素でIR-MALDESI源とパージエンクロージャのアクセスドアを閉じます。エンクロージャ内部の相対湿度が<3％に達すると、サンプルプレートを冷却され、ペルチェプレートにDC電源（〜12 V）をオンにします。注：ペルチェ冷却段階で冷却工程は、他の場所¹³で詳細に説明されています。
5. -9℃のステージを冷却し、マウントされた組織が熱平衡（〜5月10日分）に来ることができます。
6. 窒素パージを停止し、ソースアクセスドアを開くことによって、周囲の相対湿度に組織を公開します。氷の薄い層が共上に堆積されますペルチェステージのLD面と空気からの水の逆昇華による組織切片を搭載しています。
   注：実験室の相対湿度は10〜15％未満の場合、氷のマトリックス層の形成を容易にするために、筐体の内部に温水のビーカーを置きます。
7. 氷マトリックス層を形成した後、アクセスドアを閉じて、10±2％の相対湿度を減少させるために乾燥窒素の流れを再起動します。このレベルの相対湿度を維持するために窒素の流量を調整する、経験的、実験⁶を通して氷の一定の層を維持するために氷の形成と昇華のバランスでした。

4.質量分析イメージングデータ集録

1. RASTIR GUI（ 図2）を使用して、「LASER位置」ボタンをクリックすることで、分析位置にステージを移動します。オフ組織領域が切除されます確実にするために、レーザーの調整ダイオードを使用してください。オフ組織再におけるレーザーショットを発射カメラビューに対してオフセットレーザを較正する祇園。レーザー位置を更新するために、「レーザーテストファイア」ボタンをクリックします。
2. 「カメラ位置」に戻り、レーザアブレーションスポット（ 図2-1）にレーザーアライメントレチクルを配置することによってRASTIRにおけるレーザー位置を更新します。
3. （ 図2-2）利息（ROI）ボタンの領域をクリックして、分析されている組織切片のためのROIのサイズと位置を調整します。入力など（単位mm）XとY方向のステップサイズ（ 図2-3）のような適切な実験パラメータを、そして「プロジェクト名」ボックス（ 図2-4）でMSIファイルに名前を付けます。
   1. ROIを描画するときに、コントロールとして機能オフ組織の一部が含まれます。ピークピッキング（ステップ5.4）のために、このオフ組織セクションを使用します。
      注：組織のレーザー脱離径（スポットサイズ）は約150μmです。しかしながら、より高い空間解像度をUSIによって得ることができますオーバーサンプリング法^{14,15 ngの} 。
4. ドロップダウンボックス、ボクセルあたりのレーザーパルス（整数値）の数、及びレーザー・トリガと質量分析計信号取得（ 図2-5）の間の遅延から適切なレーザ周波数を選択します。典型的には、測定⁵のための質量分析器に到達するために生成されたイオンを可能にするために、10ミリ秒の遅延時間で、完全にIR-MALDESI MSI実験で物質を脱着するために20Hzでボクセルごとに2つのレーザパルスを使用します。
   注：レーザーがで動作することが可能である最も高い繰り返しレートを選択します。最近、より高い繰返しレートを使用して分析物検出能^16を改善することが示されました。

IR-MALDESI MSI動作図2.ユーザー・インターフェース。RASTIRスキャン制御プログラムのスクリーンショットが提示されています。 PERFのためのステップ（5）正しい番号を選択する、（4）ファイルに名前を与え、（3）（単位mm）段階のステップサイズを選択すること、（2）ROIを描く、MSI実験をorming（1）レーザスポットの位置を特定しています希望繰り返し率と共に、ボクセル当たりのパルス、及び（6）イメージングおよびMSのセットアップのためのリストを確認する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5. このようなイオン化モード、エレクトロスプレー電圧を、溶媒の流速、キャピラリー温度、および質量分析ソフトウェアの噴射時間と質量分析計のパラメータを選択します。全身IR-MALDESI MSIで使用されるパラメータの例については、 表1を参照してください。
   注：これにより、生物学的サンプルの複雑さ及びMSIにおける分離方法の欠如分析、IR-MALDESI源は高分解能、高質量精度の機器に接続されています。取得方法は、analysのためにロードすることができますこのような並列反応モニタリング^（PRM）7または極性MSI ^12を切り替えるようエス。
6. 一旦全てのパラメータ（レーザー、ステージ、および質量分析計）が選ばれている、同期のために「握手」モードでMSを置き、MSの買収を開始します。
7. RASTIRイメージングソフトウェアを使用して、チェックリストのすべてのステップ（ 図2-6）は、ボックスをチェックすることにより完了し、プログラムをロードしていることを確認します。プログラムがロードされたら、「実行」ボタンが利用可能になります。ファイル名を指定して実行キーを押しMSI信号取得を開始します。
8. イメージング実験が完了すると、質量分析計の取得を停止し、スタンバイモードに楽器を置きます。 、エンクロージャに窒素パージをオフにペルチェプレートに電源をオフにし、ステージコントローラとレーザーをオフにします。
9. 、アクセスドアを開き、ソースエンクロージャ内部からエレクトロスプレーエミッタ先端を取り外し、保護手袋を使用して、拡張加熱金属MS入口を削除します。注意：拡張金属MS入口は非常に高温になります。
10. その後、10分間のHPLCグレードの水で、そして最後に10分間HPLCグレードのメタノール中で、10分間、15％硝酸中で超音波浴によって拡張された金属キャピラリー入口をきれいに、手袋、安全ゴーグルを身に着けています。窒素気流下で金属キャピラリー入口を乾燥し、MSに再度挿入します。注：その後、適切な廃棄物容器に溶媒を廃棄してください。

全身IR-MALDESI MSIで使用される表1の機器パラメータ。

5.データ解析

1. このようなMSConvert ¹⁷とimzML変換器¹⁹などのフリーソフトウェアを使用して、このようなmzXML ¹⁷またはimzML ¹⁸などのデータ形式に機器によって生成された生データファイルを変換します。
2. MSiReader v1.0を、専用の処理コンピュータ上で、高解像力MSIデータ²⁰の分析のために開発されたオープンソースソフトウェアを起動します。 MSiReaderへのイメージングファイルをロードします。 MSiReaderとその組み込み機能のいくつかのユーザーインターフェースについては、 図3を参照してください。
3. 彼らのm / zを入力することにより、目的の分析物のイオンマップを生成し、百万分の一で適切なのm / zウィンドウ（PPM）やトムソン（TH）（ 図3-1）を選択します。高分解能（RP）商品について低ppm範囲内のウィンドウを選択します。
   注：適切なのm / zウインドウは、IR-MALDESIソースがに結合されているインストゥルメントのRPと質量測定精度（MMA）に依存します。
4. さらに、このような補間（ 図3-2）、正規化（ 図3-3）、光学イメージオーバーレイ（ 図3-4）、およびピーク（ 図^{3-5）20 を}ピッキングなどの組み込み機能を使用してデータを解釈します。

図3 MSiReaderのユーザインタフェース。 v1.0の ^20。ファイルをソフトウェアにロードされると、目的の分析物のイオンマップは、（1）のppmまたはThの中のm / z及び公差を入力することにより表示されます。このような（2）補間または（3）正規化などの更なる分析を行うこともできます。組織の光学像もインポートして重ね合わせることができますより良い視覚化のためのイオンマップ（4）。非標的組織（マゼンタライン）の面積と基準面積オフ組織（緑色のボックス）を選択することで、組織特異的なピークを抽出するために使用することができる機能（5）ピークピッキングを分析するために。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

5. ユーザーが定義した基準を用いて、組織特異的なm / z値のリストを生成するために、ピークピッキング関数を使用します。注：PeakFinderアルゴリズムは、2つの領域の平均質量スペクトルの違いを利用します。これらのm / z値は、次いで、METLIN ²¹または脂質MAPSなどの代謝物データベースに対して検索することができる^。22
   1. 尋問組織領域（マゼンタポリゴンROI）とオフ組織の基準領域（緑のポリゴンROI）を選択する例について、図3を参照してください。

図4に示す画像は、全身の組織切片で異なる器官における代謝物の空間的な分布を示します。身体の特定の領域に固有のm / z値は、画像生成のためのバッチ処理に続いて、MSiReader PeakFinderを用いて発見されました。イメージオーバーレイツール（ 図3-4）を得られたイオンマップと氷のマトリックスの沈着の前に撮影した光学像を整列させるために使用されました。動物の細胞膜における構造的役割（ 図4A）から予想されるように、他の代謝産物は、特定の器官または組織区画内の異なる分布（ 図4B-D）を示すのに対し、コレステロールは、すべての組織タイプで観察されます。

図4.代表IR-MALDESI MSIの画像。 ADフォー metaboli全マウスセクション内の化合物の局在を実証するテイオンマップ。脂質クラスは、各画像の右下に注釈が付けられています。組織切片の光学像は、臓器の可視化を支援するために、イオンマップ内に重畳されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

上記のプロトコルは、IR-MALDESI MSI実験を行うための重要なステップについて説明します。マトリックス・アプリケーション・プロセス（第3節）は、昇華またはスプレー塗布ロボット噴霧器を用いて、MALDI MSI実験のために、典型的なマトリックス・アプリケーション・プロセスに似て約20分を取ります。また、IR-MALDESIはマトリックス結晶⁶への検体の分配に依存しない、氷マトリックスが広く関係なく、それらの質量、サイズ、または化学的特性のすべての分析物のために使用することができます。また、氷の使用は、一般的なMALDI実験²³で観察された下位m / z範囲内のマトリックス関連イオンを排除します。

実験内のすべてのステップは、高品質MSIデータを生成するために必要とされるが、実験の過程でエレクトロ安定性は、再現性のIR-MALDESIイオン発生のために不可欠です。相対湿度は、撮像実験の経過にわたって監視する必要があります一定の氷マトリックス層を維持します。 IR-MALDESIの脱着は氷⁶の厚さに比較的不浸透性です。しかし、いくつかのイメージング実験は、監視されていない場合は氷層が煩雑になることがあった複数の時間を取ることができます。この目的のために、比例積分導関数（PID）コントローラは、最近、エンクロージャ内の温度および相対湿度を監視し、必要に応じて調整するためにソースに統合されています。

MSIは、表面からの検体の直接サンプリングを伴うため、クロマトグラフィー分離は、スペクトルの複雑さを軽減するために使用することはできません。さらに、実験室の環境に存在する周囲のイオンは、目的の分析物（複数可）からの信号に干渉する可能性があります。生物学的サンプル内の化合物の多様な範囲と合わせ、周囲イオンからのスペクトルの複雑さは、高質量精度かつ高分解能質量分析計へIR-MALDESI（および他の周囲MSI源）のカップリング、秒を必要とします正確で詳細なイオンマップの生成を容易にするために、この実験で使用されるものとしてUCH。

この研究では、IR-MALDESI全体マウスの種々の器官における内因性代謝物の種々の空間的分布を明らかにするために使用しました。 MSiReaderにアルゴリズムをピークピッキングは異なるクラスからの脂質たその多くが、500以上の組織特異的なイオンを識別することができました。このプロトコルは、異なる器官^24,25に、同時にそのような薬物および薬物代謝産物などの外因性化合物の分布をモニターするために使用することができます。全身薬物分布研究のためのゴールドスタンダードは、全身オートラジオグラフィー²⁴です。しかし、この方法は時間がかかり、放射性標識化合物を必要とし、それは分析物の分子構造についての情報を提供しないので、親薬物とその代謝産物とを区別することができません。また、可能にしながら、IR-MALDESIと全身MSIは、これらの問題を回避します有機マトリックスの添加なしに、周囲環境で実行される分析。

The authors declare no competing financial interests.

The authors thank Professor H. Troy Ghashghaei from NCSU Department of Molecular Biomedical Sciences for providing the whole mouse tissue. The authors also gratefully acknowledge the financial assistance received from National Institutes of Health (R01GM087964), the W.M. Keck foundation, and North Carolina State University.