化学汚染物質の迅速検出のためのラマン分光アッセイ強化フィルターベースの表面

製造や化学汚染物質（ すなわち、農薬フェルバムと抗生物質アンピシリン）の検出のためのラマン分光（SERS）アッセイ強化フィルタベースの表面を実行するための手順が提示されています。

We demonstrate a method to fabricate highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopic (SERS) substrates using a filter syringe system that can be applied to the detection of various chemical contaminants. Silver nanoparticles (Ag NPs) are synthesized via reduction of silver nitrate by sodium citrate. Then the NPs are aggregated by sodium chloride to form nanoclusters that could be trapped in the pores of the filter membrane. A syringe is connected to the filter holder, with a filter membrane inside. By loading the nanoclusters into the syringe and passing through the membrane, the liquid goes through the membrane but not the nanoclusters, forming a SERS-active membrane. When testing the analyte, the liquid sample is loaded into the syringe and flowed through the Ag NPs coated membrane. The analyte binds and concentrates on the Ag NPs coated membrane. Then the membrane is detached from the filter holder, air dried and measured by a Raman instrument. Here we present the study of the volume effect of Ag NPs and sample on the detection sensitivity as well as the detection of 10 ppb ferbam and 1 ppm ampicillin using the developed assay.

表面増強ラマン分光法（SERS）は、ナノテクノロジーを用いて、ラマン分光法を組み合わせた手法です。貴金属ナノ表面における検体のラマン散乱光の強度が大幅に局在表面プラズモン共鳴により増強される^。1銀ナノ粒子（銀NPS）その高い拡張能力をはるかに最も広く使用されているSERS用基板である。今まで² Ag NPの様々な合成方法が開発されている^。3-6のAg NPは、その感度および/ ​​または機能を増強するのに有効なSERS基板として単独で使用、または他の材料及び構造と組み合わせることができる^。7-11

SERS技術は、食品や環境試料中の様々な微量汚染物質の検出のための偉大な能力を実証している^12は伝統的に、SERSのサンプルを調製するための2つの一般的な方法があります：。。溶液系と基板ベースの方法は^、13 ソリューションベースのメ​​トdは、サンプルと混合するNPコロイドを使用しています。次にNP - 分析物複合体は、遠心分離を用いて回収し、乾燥後のラマン測定のための固体支持体上に堆積されます。基板ベースの方法は、通常、事前に作製した固体基板上に液体試料のいくつかのマイクロリットルを堆積させることによって適用される^。14が、これら2つの方法のいずれもが、試料容量の大量のために有効かつ適用可能です。 SERSアッセイのいくつかの変更は、フィルターシステム^15-21またはマイクロ流体デバイスの組み込みの統合などの音量制限を、克服した^。21-24修正されたSERSアッセイは、化学汚染物質を監視するための感度と実現可能性に大きな向上を示しています大規模な水サンプルインチ

ここでは、農薬フェルバムおよび抗生物質アンピシリンの微量を検出するために製造およびシリンジフィルターベースのSERS法の適用の詳細なプロトコルを示します。

1.銀ナノ粒子の合成¹⁵

1. 5秒間100ミリリットルの超純水（18.2ΩU）とボルテックスで18 mgの硝酸銀を溶解させます。
2. 5秒間1ミリリットルの水とボルテックスで27 mgのクエン酸ナトリウム二水和物を溶解させます。
3. 撹拌棒を含む三角フラスコに準備された硝酸銀溶液のすべてを転送し、磁気ホットプレート上にフラスコを置きます。 〜350℃で700rpmでの撹拌速度で激しく撹拌しながらフラスコを加熱（プレート上で温度を設定）。
4. 沸騰した場合、直ちに三角フラスコに準備されたクエン酸ナトリウム溶液のすべてを追加し、解決策は、Ag NPの形成を示す緑がかった茶色を、なるまでさらに25分間沸騰するソリューションを残します。
5. ホットプレートからフラスコを外し、一定の色やトランで、別の磁性板の上に置いた（加熱しないでください）​​、攪拌O / NがRTで同じ撹拌速度で混合物が安定状態に達するまでsparency。必要に応じて用意したAg NPの吸光度を決定するために、紫外可視分光光度計を使用してください。
6. 100mlに超純水を用いて最終混合物を希釈します。
7. 必要に応じて、製造業者のプロトコルに従ってのAg NPのサイズを測定するゼータサイザーを使用してください。
8. 密閉容器に銀コロイドを移し、アルミホイルで光から保護します。必要に応じてコロイドを2ヶ月間4-7℃の冷蔵庫に保存することができます。

SERSアクティブフィルタ膜の2製作

1. 50mMのNaCl溶液を作るために水100mlに2.92はグラムの塩化ナトリウム（食塩）を溶解します。
2. 用意したAg NPの1ミリリットル中に5 mMのNaCl溶液の1ミリリットルを追加し、20 rpmで10分間章動ミキサーで混ぜます。このステップでは、Agナノクラスターの中に銀のNPを集約することです。
3. 注射器に取り付けることができるフィルタホルダにフィルター膜（PVDF、0.1μmの孔径）を置きます。より小さい孔サイズ膜FOました銀ナノクラスターを捕捉し、一貫性のある信号を生成する際に、より大きな細孔サイズの膜（ すなわち、0.22μmの）よりウントより効果的。
4. 濾過のための注射器にロード用意したAgナノクラスターの2ミリリットルを。シリンジにフィルターホルダーを取り付け、手動で1滴/秒の流量で膜を通してのAgナノクラスターのボリューム全体を渡します。膜トラップのAgナノクラスターは、SERS活性フィルター膜を形成します。
5. フィルターホルダーからフィルター膜を外します。膜への損傷を受けないためにピンセットを使用して、外リムに膜を保持している場合には、特別な注意が必要とされています。スライドガラス上に約3分と場所膜用の空気乾燥。
6. SERS基板のラマン検出
   1. 5mWと、10倍の顕微鏡対物レンズをセット2の1秒、露出数の露光時間のレーザパワーと波長780nmのレーザにラマン測定器を設定します。ソフトウェア上の目的は、あまりにもそれに応じて設定されていることを確認します。
   2. ラマン計測器のプラットフォーム上に上に膜を有するガラススライドを配置し、膜の表面に集中する顕微鏡を使用しています。
   3. ランダム膜表面8から10のスポットを選択し、機器が順番に自動的にそれらを収集します。分析のための製造元のソフトウェアでのスペクトルデータを開きます。

化学汚染物質を検出するために、SERSアクティブフィルタシステムの3.アプリケーション

1. 10 ppbでのフェルバム溶液を調製します。
   注意：フェルバムは非常に揮発性です。固体を計量する際の注意事項（人工呼吸器やゴーグル）を使用します。
   1. 2ミリグラムフェルバム粉末を秤量し、ストック溶液（100 ppm）を行う20 50mlの％アセトニトリル（10mLのアセトニトリルおよび10mlの水）の中に溶解します。 30秒間フラスコを渦。
   2. 試験管に100ppmのフェルバム溶液1mlを取り、10ppmの溶液を作る9 50mlの％アセトニトリルを加えます。 5秒間チューブをボルテックス。
   3. の1ミリリットルを取り10 ppmの試験管内の溶液と9ミリリットルの50％アセトニトリルを追加するには、1 ppmの溶液を作製します。 5秒間チューブをボルテックス。
   4. 試験管内では1ppm溶液1mlを取り、100ppbの溶液を作製するために9ミリリットルの50％アセトニトリルを追加します。 5秒間チューブをボルテックス。
   5. 試験管内で100ppbの溶液1mlを取り、10 ppbの溶液を作製するために9ミリリットルの50％アセトニトリルを追加します。 5秒間チューブをボルテックス。
2. 1ppmのアンピシリン溶液を調製します。
   1. 10 mgのアンピシリン粉末を秤量し、100ppmのアンピシリン溶液を作るために100 mLの水に溶解します。 30秒間フラスコを渦。
   2. 試験管内で100ppmの溶液1mlを取り、10 ppmのアンピシリン溶液を作製するために9ミリリットルの水を追加します。 5秒間チューブをボルテックス。
   3. 試験管に10ppmの溶液1mlを取り、1 ppmのアンピシリン溶液を作製するために9ミリリットルの水を追加します。 5秒間チューブをボルテックス。
3. NPコーティングされた側を上に向けて、バックフィルターホルダーにフィルター膜を置きます。
4. その後、新しいシリンジにロード一つのサンプルの5ミリリットルを、そして内側の銀コーティングされた膜でフィルターホルダーに取り付けます。
5. 手動で1滴/秒の流量で膜を通してサンプルのボリューム全体を渡します。標的分子は、フィルター膜上に塗布されたNPを吸着させ、濃縮することができます。
6. 、フィルターホルダーからフィルタ膜を取り外し、約3分間空気乾燥し、ステップ2.6に記載したのと同じ方法を用いて、ラマン装置を使用して信号を測定します。
7. 別の銀コーティングされた膜を作成し、他のサンプルの検出のためのステップ3.3から追従する2.6を繰り返しステップ2.2。

この実験の主要な工程を示す模式図（ 図1）に示した。2が最大感度に達するために、膜コーティングでAgNPsの最適化されたボリュームを使用する重要性を示した図 。フェルバムを使用している場合0.5ミリリットル（不十分なコーティング）または2ミリリットル（あまりにも多くのコーティング）と比較したAg NPの1ミリリットルは、最も強い信号を提供します。

我々は開発したフィルタベースのSERSアッセイ（ 図1）によって、大きな信号強度で1 ppmには10ppbレベルとアンピシリンでフェルバムを検出することができました。フェルバムのSERSスペクトルは、10 ppbので明瞭な特徴的なピークを示します。 1386センチメートル^-1のピークは混合CN伸縮およびC = Sの振動、および対称CH ₃変形からです。 1516センチメートル^-1のピークは_CH 3及びCN延伸に関連しています。 561センチメートルのピーク ^{-1 SSのストレッチによって生成される。25-27 1ppmのアンピシリンのスペクトルも明確に検出されました。 1594センチメートル-1および1447センチメートル-1のピークはC = Cはそれぞれ、ストレッチおよびCH ₃ / CH ₂変形からです。 1001センチメートルでの強いピークは-1ベンゼン環の振動からです。 852 cm -1でのピークは、対称CNC延伸に関連付けられている。28-29を一つの試料を分析するための実験時間は、予め合成されたAg NPを有するSERS活性フィルター膜の製造などの20分未満です。}

図4に示すように、サンプル容量の増加に伴って、我々はさらに、検出限界を高めることができる。サンプル容量を増加させるときに我々は、ピーク強度の増加を観察しました。ボリュームが調整可能であり、検出限界にも調整可能であるので、これは、フィルタベースの方法の利点です。

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図1. フィルターSERSアッセイの概略図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5ミリリットルが100ppbの 図2. SERSスペクトルは、Ag NPの異なる量によってコーティングされた膜を通過フェルバム上から下へ：1.0ミリリットルのNaClを0.5ミリリットルのNaClを0.5ミリリットル銀コロイド、1.0ミリリットルのAg、1.5と1.5ミリリットルのAg mlのNaClが、それぞれ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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銀のNPコーティングされたフィルター膜上フェルバムとアンピシリンの 図3. SERSスペクトル上から下まで：50％アセトニトリルの制御、10ppbののフェルバム、水の制御、1 ppmのアンピシリン、それぞれの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

銀のNPコーティングされたフィルター膜上が100ppbのフェルバムの異なるボリュームの 図4. SERSスペクトル上から下へ：3ミリリットルフェルバム、5ミリリットルフェルバム、7ミリリットルフェルバム、9ミリリットルフェルバム、それぞれ。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。

このプロトコルにおいて重要なステップの一つは、均一のAg NPは一貫性のある結果を得るための鍵である銀のNP合成、です。加熱時間及び前駆体の濃度を正確に制御しなければなりません。このAgNPs製剤の平均サイズはゼータサイザーで測定した80ナノメートルである（データは示さず）。別の重要なステップは、塩濃度及び凝集時間を正確に制御しなければならない塩の集合体です。小さい細孔径を有する膜は、トラップのAgナノクラスターへのより効果的であることが見出されたように加えて、膜の選択も重要です。本研究で使用される特定の膜は、正面側のシリンジを接続するホルダー中に配置しなければならない前面及び裏面があります。それは下に置かれた場合には、コーティングは、それほど効果的でした。膜を通過する際に気泡を回避することは、成功したコーティングに別のキーです。

このアッセイのトラブルシューティングのために、次の手順推奨されています。何か少しシグナルが検出されない場合、以下の原因を確認してください。主な原因は、Ag NPはフィルター膜の細孔中に閉じ込めされるのに十分に集約されていない可能性があります。塩濃度および/またはインキュベーション時間を増加させると、凝集を増強することができます。それ以外の場合は、フィルター膜の裏側を上に向け、および膜上に負荷サンプルの体積または濃度が低すぎないことをされていることを確認してください。標的分子の信号が一貫していない場合は、次の原因をチェック：銀のNPのサイズ分布が広すぎるであってもよいし、NPのが均等におそらくあまりにも多くのNPの凝集や速すぎると、膜上に分布していません膜を通過します。

SERS基板としてのAg樹状突起の使用に関する我々の以前のデータ^、30-31と比較すると、このフィルタベースのSERSアッセイの感度はフェルバム検出に非常に高いです。これはラを流すことができるフィルターベースのシステムの利点によるものですサンプルのRGE量、より多くの分析物分子がSERS基板上に集中するようになっています。いかなる遠心分離は、NP-分析物複合体を収集するために必要とされないように、溶液ベースの方法を介してフィルタベースのシステムを使用する別の利点は、動作およびfieldable測定の容易さです。この方法の制限は、複雑なコンポーネントが膜孔をブロックすることができるようにそれは、そのような直接牛乳のような複雑な液体マトリックスのために使用することはできないです。前処理は、膜を通過する前に、妨害成分を除去するために必要とされます。

要約すると、我々は、液体食品マトリックス及び環境試料中の汚染物質またはadulterationsの検出に適用することができる簡単かつ敏感なフィルタベースのSERSアッセイを実証します。さらに、検出の限界をプッシュするために、NPのサイズと量、塩濃度、サンプル体積と機器パラメータなどのパラメータの最適化が必要です。

The authors have nothing to disclose.

This material is based upon work supported by the U.S. Department of Homeland Security under Grant Award Number 2010-ST-061-FD0001 through a grant awarded by the National Center for Food Protection and Defense at the University of Minnesota. Disclaimer: The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as necessarily representing the official policies, either expressed or implied, of the U.S. Department of Homeland Security or the National Center for Food Protection and Defense.