3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

不死化された癌細胞株は、3次元細胞培養物、生物学的研究のための貴重なモデルとして成長させることができる。このプロトコルは、サンプル調製プラットフォームの改善を含む、三次元細胞培養物の質量分析イメージングを記述する。このプロトコルの目的は、質量分析イメージング解析のために3次元細胞培養物を調製するためにユーザーに指示することである。

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.^1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.^5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.^8–11

3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.¹⁰ Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.¹⁰ There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.⁷ However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.^12–14

All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.^12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

イメージング用1. 3D細胞培養と準備

1. 培養に適切な細胞株、 すなわち、HCT116結腸癌細胞株、二次元、単層培養した。
2. 一般的には数日かかる50〜70％の集密度まで、5％CO ₂インキュベーターでマッコイの5A培地+ 10％ウシ胎児血清を含むT-25フラスコにHCT 116細胞を増殖させる。
3. 0.25％トリプシン-EDTA溶液で細胞を放出し、細胞密度および生存率をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞の一部をカウントする。
4. カウントした後、適当なウェル6000細胞/播種密度は、30,000細胞/ mlを達成するために完全培地で細胞を希釈する。

2.アガロース被覆96ウェルプレートを準備します

1. 50ミリリットルコニカルチューブ内の標準のメディアの10ミリリットル（メディアでの1.5％アガロース溶液^）10にアガロースの0.19グラムを追加します。穏やかに混合することによって取り込みを確認してください。水浴中でアガロースオートクレーブ20分間。
2. アガロース+媒体混合物の50μlをフラット60中央ウェル中に吸引する、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート培養プレート底。プレートの周縁部におけるウェルはわずかに高い蒸発速度を有するように、200μlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の代わりに、これらのエッジにアガロースを加える。
3. アガロース混合物は、内側のウェルに添加された後に冷却するために脇にプレートをセット〜37 細胞の添加の前にCを°。

三次元培養を3シードとなりがち

注：複数またはより少ない細胞が関与培養の要件に応じて播種することができるが、それはこれらの条件は、培養の10〜14日後に直径約1mmの三次元細胞培養構造をもたらすことが判明した（データは示していない） 。

1. アガロース被覆に（〜6000細胞を含むように希釈された）適切な細胞溶液200μlを追加します。96ウェルプレート。プレートをカバーし、細胞増殖のために37℃、5％CO ₂の加湿インキュベーター内で設定。
2. 細胞媒体ごとに48時間の最小値を変更するか、またはメディアが表示されたときに色を変更すること。
   1. 慎重にアガロースの下にある（2日目までに肉眼で見える）小三次元細胞培養の周囲から古いメディアを吸引することによって、メディアを変更します。三次元細胞培養の上に静かに新鮮な培地200μlを追加します。
   2. これらのメディアの変更時には（オプションステップ）は、テストのための化学療法剤または他の薬剤を追加します。完全なメディアとの最終濃度になるように選択薬を希釈し、各ウェルに必要な200μlを添加する。
   3. 三次元細胞培養物は、直径約1mmになるまで、光学顕微鏡で3次元細胞培養増殖をモニターする。

4.収穫の3D細胞培養

1. 優しくアガロースベッドから3D細胞培養を削除するには2ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。
<李は>優しく待っている24ウェルプレートに約1mlのPBSにそれらをピペッティングすることによりPBSで3次元細胞培養物を洗ってください。
2. 転送は、タンパク質または代謝産物を抽出するための遠心管に、血清学的ピペットを介して三次元細胞培養物を収穫し、または画像化用途のためにスライスを支援するために、切断媒体に埋め込む。

ゼラチン5.埋め込みの3D細胞培養

1. 高純度の水で〜175 mg / mlのゼラチンの溶液を準備（18MΩ推奨^{）。22,23、}激しくゼラチンを混ぜる。粘性および操作が困難になって解決策を守ってください。溶液が透明と吸引することが容易となるまで〜60℃の水浴中でゼラチンを含むコニカルチューブを配置し、暖かい。
   注：温かいゼラチン溶液は、それが冷えると急速に硬化するため、急速に凍結する前に、次の手順をすべて実行。
2. それを加熱した後、細胞培養フードに直ちにゼラチンを取る。 BEAにゼラチンでチューブを維持約60で予熱水とケル ゼラチン溶液の硬化を避けるためにC°。
3. 2ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、24平底プレートのウェル中に温かいゼラチン溶液0.6mlを堆積させる。このボリュームは、薄層の下側をカバーするのに十分である。穏やかに直ちに3D構造を破裂を避けるために異なるの2mlピペットを用いてゼラチン層の上に三次元細胞培養物を堆積させる。
   注：ケアは、ゼラチンにPBSを配置していないこの段階で注意しなければならない。このような場合は、しかし、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。
4. 三次元細胞培養物をゼラチン層の表面上に配置された後の培養物の位置を乱さないように、慎重に、三次元細胞培養上温かいゼラチン混合物の別の0.6ミリリットルをピペット。第2層が配置された後、-80℃でゼラチン包埋3D細胞培養を凍結。

6.スライスと解凍マウント番目質量分析イメージング用の電子ゼラチン包埋3D細胞培養

1. 冷凍庫から3D細胞培養物を含む24ウェルプレートを外します。ピンセットやメスでは、ウェルの側面ダウン優しくスライドするまで、あなたの手からの熱とプレートの底を温める。
2. スムーズにセンターを解凍せずにゼラチンを解放、ピンセットやメスをスライドさせます。クライオスタットサポートに一滴の水を取り、支援にゼラチンディスクを接着するためにこれを使用する。
   1. ゼラチン中に埋め込まれた三次元細胞培養物を-30℃でスライスに最も適している。使用前に70％エタノールクライオスタットブレードとガラスを清掃してください。ブレードの鈍化を防ぐために、ブレードまたは各3D細胞培養 - ゼラチンディスクの新しいブレードの別の部分を使用してください。
3. 3D細胞培養物が見えるようになるまで、クライオスタットを用いて、優しく余分なゼラチンをオフに直面している。
4. この時点で、ゆっくりと12〜16ミクロンのセクションでスムーズな動きで3D細胞培養物をスライス。
   注：スライスへの重要な要因は、ブレードにガラスの距離、ブレード角度、クライオスタットの温度、及び支持体上のディスクの角度を含むので、これらのすべては、一貫性のある結果を保証するためにチェックする必要があります。
5. 慎重にスライスを解凍し、適切に標識されたインジウムチタン酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライド上にマウントし、デシケーターに保管してください。最高品質のために可能な限り迅速にスライスを使用してください。

7.マトリックスアプリケーションおよびMALDIイメージング用サンプル調製

1. MALDIイメージングに先立ち、適切なマトリックスとスライスを準備する。
   1. 小分子の分析のために、何回の洗浄工程は、一般的に必要とされない。無傷のタンパク質の検出のために、そのような信号をマスクする可能性脂質などの小分子を除去するために冷100％アセトン、カルノア液、または70％/ 95％イソプロパノールでスライスを洗浄し^{、24 - 26}
   2. 静かに時を超えない30秒間洗浄します。しないすべてのスライスを乱す。
2. 0.1％TFAと、有機溶媒と水の溶液中でマトリックスを準備する。そのようなαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）などの小分子は、60％ACNを使用し、40％H ₂ O：0.1％TFA（10 mg / mlで）。タンパク質検出のためのそのようなシナピン酸（30 mg / ml）でのように、同じ溶媒溶液を使用する。シナピン酸の最適な溶解度のため、TFAを添加する前に、アセトニトリル中で最初に溶解する：H ₂ O溶液。他のマトリックスを適宜用いることができる。
   注意：マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっている注目すべきである。小さい結晶は、複数の分子種が検出され、生物学的な違いはなく、マトリックス効果に起因することを可能にし、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。
3. メソッドをhandspottingにより行列を適用します。
   1. MATRの0.5μLを適用する先の細い注射器を使用してください三次元細胞培養スライス上にix溶液とマトリックスが結晶化さ許す。
4. また、エアブラシメソッドを使用します。マトリックス溶液と商用グレードのエアブラシを埋める。
   1. 8〜12インチ離れスライドから噴霧器を保持するスライスで微細な噴霧を目指しています。パス間では、1分間に最高の結晶形成を可能にするためのマトリックスを乾燥させる。エアブラシの10〜20パスまでのマトリクス²²の最適な層を製造するために必要とされている。
5. また、他の場所で詳述さ昇華法を使用しています^。25,27
6. かかわらず行列適用の方法のMALDI-MSI、前の少なくとも30分間デシケーター中で乾燥したスライド²⁵

MALDI-TOFシステムを用いた8 MALDI-MSI分析（ すなわち、オートフレックスIII）

注：このセクションでは、MALDI-TOFイメージング実験のためのパラメータを設定するための指示やアドバイスが含まれています。アドインによってはtrumentメーカーやソフトウェア使用、プロセスが異なる場合があります。

1. しっかりとイメージにITO被覆されたスライドに付着した3D細胞培養スライスを75ミリメートル×25 mmスライドを保持するために作られ、アダプタのスライドを取り付けます。機器にスライドアダプタをロードします。
2. 問題の質量範囲のための適切な較正標準を選択することにより、MALDI-MSIのための楽器を準備します。小分子の尋問のために、使用されるマトリックス、α-CHCAに対応して検出された信号は、キャリブラントの一つの共通のグループである。タンパク質の分析のために、関心のある質量範囲内の既知のタンパク質標準（ すなわち、ユビキチン、トリプシノーゲン）を選択し、較正物質として3次元細胞培養に隣接してスポットする。メソッド開発を進める前に、機器を校正。
3. 画像化の前に、機器の製造業者が提供するソフトウェアを使用して、選択した質量範囲のためのデータ取得方法を開発する。のための図1と図2を参照してください小分子とタンパク質イメージング。小分子イメージングのために、最高の質量分解能のためのリフレクトロンモードを使用しています。
   1. のm / z 100〜1,000の間と8,000- 25000 メートル/ zの間のタンパク質のための小分子データ取得のための質量範囲を調整します。楽器を持つ可能性が最も高い質量分解能を提供しながら、選択領域を包含するように質量範囲を調整します。
   2. レーザパワー、周波数、較正溶液と近くの「犠牲」の3D細胞培養スライスを用いたレーザーショットとスポットサイズの数を調整する。主計測器制御ソフトウェアでこれらの設定を確認します。 60％の電力、400レーザーショット、超小型スポットサイズ：推奨されるの出発点として、以下の設定を使用してください。これらの設定は、楽器やメソッド間で異なるので、それぞれ特定の楽器のための最高品質のスペクトルを与えるために、機器パラメータを最適化します。調整することができる他のパラメータは、検出器利得、サンプルレート、及び電子利得を含む。 Sイメージングソフトウェアで使用するためには、この方法をaveの（ すなわち 、自動実行方法はFlexImagingがに頼ること）。
      注：検出を妨害しないように（再び計測器制御で見つかった）関心の質量範囲以下のイオンを抑制します。
   3. 選択した質量範囲のためのタンパク質のデータ取得方法を開発する。上記で概説した同じ手順に従いますが、今回は中〜高質量範囲については、約3 kDaの上、リニア·モードを使用します。
      NOTE：設定小分子法のために使用されるものとは異なる。
4. そのようなブルカーMALDI-TOFシステム用FlexImagingとして機器の製造元から提供イメージングソフトウェアを使用してセットアップ特定のMS機器パラメータ、。
   1. 前と保存されて開発された方法を使用して、新しいイメージングファイルとフォルダを作成します。そのようなラスタスポット（ステップ8.3.2または8.3.3にセットアップ）計測器制御方法を設定するサイズ（約200μm〜50μmのデフォルトからの変更）、およびPOSIなどの機器パラメータを選択します三次元細胞培養物を走査するる。
   2. 順番に各レーザを移動し、試料上の3適切なティーチポイントを選択します。 「印刷画面」を使用して、MALDI-TOFレーザー制御ソフトウェアからの光学写真を入手します。
      注：多くのイメージング·ソフトウェア·プログラムは、スキャナまたはしばしば器具カメラで得られるレーザが配置されている「教示」ソフトウェア、サンプルの光学写真を必要とする。
5. その後、イメージングソフトウェア（しない計測器制御）からの撮像処理を開始し、各スライスからマススペクトルを取得。特定の領域に局在ほとんどの3D細胞培養全体の質量と他の人を観察します。

9.オプションデータ解析手法

1. ターゲット分析のために、平均スペクトルに質量をクリックすることにより、スペクトルの手分析を行い、または（イメージングソフトウェアが自動的に特定のしきい値を超える質量を選択できるように例えば 、ABピーク）上位20％のしきい値をOVE。品質管理のため、マトリックスピークの分布や平均スペクトルを調べる。
2. そのようなRやMatlabなどの数学ソフトウェアで抽出されたデータセットを統計分析を実行します。
   1. ASCII形式でエクスポートシングルスペクトル、好みのソフトウェアにロードするための読み取り可能なテキストフ​​ァイル、。
   2. 、いくつかの異なるソフトウェアプログラムによって²⁸読み取るためmzML形式のASCII、mzXML、個々のスペクトルに変換する^{- 31、}または分析（.imgの）形式のファイル、MRIのような他のイメージング用途に使用される一般的なフォーマットとしてデータをエクスポート³²分析のための2つのオープンソースのオプションはMSiReaderとバイオマップ^32,33です。
   3. ファイルは、ソフトウェアによって読み取り可能なフォーマットにエクスポートされると、それぞれのソフトウェアの命令を経由してデータセットをロードします。ロード後、そのようなベースラインの除去および正規化として、取得後の処理を行う。
   4. このデータセットでは、statiがを実行そのようなカスタムスクリプトやMatlabなど¹⁸のようなソフトウェアでのアルゴリズムで構築いずれかを使用して、階層的クラスタリングの主成分分析としてsticalトリートメント。

MSI画像は、3D細胞培養物中の多数の異なる分子量分布を明らかにする可能性がある。上記で概説した方法を用いて、小分子（ 図1）からの大きなタンパク質（ 図2）の種は、培養にわたって追跡することができる。これらの結果は、MSiReader図³²の結果は、関心領域全体走査領域のいずれかで可視化ソフトウェアで3D細胞培養を横切る単一の注目イオンを分析することができる無料のツールと単一イオンの視覚化を示す。さらに、ほとんどのソフトウェアは自動的に発見の努力を支援する可能性がある、ユーザーが設定した一定の閾値を超えるイオンを可視化します。単一イオンマップが得られると、ほとんどのソフトウェアは、イオンの共局在を表示するために画像をオーバーレイする能力を含む。いずれかのアプローチを発見ベースまたは標的化様式で、質量分析イメージングは​​、3次元細胞培養物を分析するための強力なツールである。

図3D細胞培養増殖および切片。左）収穫前に14日目に見て、無傷の結腸直腸HCT-116三次元細胞培養構造の光学画像の1代表的な結果 。右大腸3D細胞培養雪解けの約赤道スライスの）光学画像は、撮影用のITO被覆スライド上にマウントした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

低質量（小分子）の範囲でα-CHCAを用いて達成図3D細胞培養の赤道部分の小分子MALDI-MSIの2。代表的な結果。トップ）の平均質量スペクトル。の下）代表的な画像単一の質量：主に3次元細胞培養及び主に3D細胞培養の縁に局在429.7 メートル/ zの内部に局在327.8 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3D細胞培養。トップ）は、より高い（タンパク質）の質量範囲内シナピン酸を用いて達成さの平均質量スペクトルの赤道部分のMALDI-MSIによるタンパク質イメージングの3代表的な結果 。ボトム）単一の質量の代表的な画像：主に回転楕円体の端に局在10871 メートル/ z、およびより多くの回転楕円体の内部に向かってローカライズされた12184 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示し。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

上記に概説した方法を用いて、三次元細胞培養物を増殖させ、MALDI-MSIを分析することができる。ときに適切^。9,10ケア、すなわち、何回も通過した低継代番号がされていない細胞を培養するために取られるべきで培養多くの不死化細胞株は、3D構造を形成する。一般的に、10および下部の継代数を有する細胞は、3次元細胞培養物を成長させるために最適である。従来のアガロース支持体に3次元細胞培養物を成長させることは、このシステムを試して三次元細胞培養物中の興味の研究グループのための費用効果の高い方法を提供する。この方法は、ほとんどの哺乳動物細胞培養室でない既にいくつかのコンポーネントを利用する。 3D細胞培養物は大きさや形状が一致しているように、細心の注意を払うことが、成長のためのアガロースプレートの準備に支払わなければならない。細心の注意を必要とするいくつかの態様は、気泡を混合物に捕捉されていないことを確認し、適切なメニスカスがそれぞれワットの底部に形成されていることが挙げられるエル。メニスカスが正常に形成されない場合、細胞は、非回転楕円形状又は小塊に成長することができる。また、ケアはスフェロイドとゼラチンにPBSを配置しないように注意する必要があります。この問題が発生した場合は、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。コストが要因ではない場合には、超低結合丸底プレートは、市販されており、これらの工程の簡略化を提供する。他の組織に埋め込む方法も費用がかかり、非質量分析両立させることができる一方で、ゼラチン - 埋め込みは、安価で汎用性の両方であることが示されている。上に概説準備戦略は、最高品質のデータを取得する3次元の細胞培養のために最適化されている。ゼラチン埋め込み質量分析と適合性であることが示されているが、このプロセスは、共結晶化に使用可能なマトリックスを狭めない。凍結したら、三次元細胞培養物は、それらが凍結融解されないようにヶ月間安定である。ゼラチンは凍結時に不透明になり、3Dセル培養は、類似した色であるので、スライスを補助するために、3D細胞培養の配置を記録するため、凍結前に推奨される。

スライドを調製する場合、マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっていることに留意すべきである。小さなマトリックス結晶は、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 handspottingマトリックスアプリケーションの最も単純な方法であるが、より大きな溶媒容量は、大きな結晶サイズと有意な分析物の移行をもたらすことができる。

質量分析計では、最初の分析に必要な専門知識が低下しているMALDI-MSIの技術の進歩。データ収集と分析は、初心者でもITO被覆スライドから高品質の情報を取得することができ、ほとんどのシステムでは単純である。近くの非画像値する3D細胞culturに最適化された機器パラメータを慎重に選択、エスは、高品質のデータを得るために重要である。例えば、レーザパワーを大きくするとピーク強度を増加させることができるが、レーザパワーの減少は、解像度を向上させ、より対称的なピーク形状を与えることができる。三次元細胞培養物は、最適なサンプルの品質を確保するためにスライスした後すぐに使用されるべきである。タンパク質シグナルの劣化（20 kDaの上記）、特に高質量領域において、適切なストレージ（デシケータ/ -80°Cの冷凍庫）なしで週以内に見ることができる。による需要のために、多くの異なる可視化ソフトウェアプログラムが開発され、研究公衆に自由にされている。ほとんどのイメージング質量分析計は、それぞれの機器で使用して独自のフォーマットを持つ単一の塊を可視化するために必要なソフトウェアがインストールされている。これらのソフトウェアプログラムは、単一の質量の画像を取得し、データをエクスポートするために使用することができる。ほとんどのソフトウェアはまた、目的の2つ以上の質量のオーバーレイを可能にする。さらに、MSIデータのための多くの異なった視聴者は、そのようなMSiReader ANとして、ダウンロードして無料ですのdバイオマップ。得^32,33質量分析データは、最前線に有用な情報をもたらし、容易に取得後に処理することができる。

医薬品からの脂質へのタンパク質の、上記で概説したシステムは、三次元細胞培養構造全体で目的の分子の分布を評価するためのデータの迅速な取得を可能にする。連続切片は、3D細胞培養のスライスの各2D画像から構築することにより、画像全体の三次元構造をとることができる。プロトコルにおける技術やノートは、単層培養および動物モデル間のブリ​​ッジとしての三次元細胞培養を開始したい研究者に使用されるであろう。一度習得し、これらの技術は、彼らが選択したいずれかのサンプル画像への研究を可能にする、三次元細胞培養物、組織、および細胞培養物の複数のタイプに適用することができる。

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.